Name: דיסקציה, עיבוד היסטולוגי וניתוח ביטוי גנים של רקמת שומן חומה סופרקלאביקולרית מורין (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-29T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: למד פרוטוקול לניתוח רקמת שומן חומה סופרקלאביקולרית בעכברים לצורך ניתוח ביטוי גנים והיסטולוגיה. השיטה משפרת דיוק ויעילות חילוץ לחקר תפקודים מטבוליים ותפקידים פיזיולוגיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי NIDDK של NIH תחת פרס מספר R01DK116899, USDA/ARS תחת פרס מספר 3092-51000-064-000D, ופרס פיילוט ממכון ביילור לרפואה לחקר הלב וכלי הדם. תרשימי הזרימה הופקו באמצעות BioRender.

אפיון מורפולוגי ומולקולרי של scBAT בעכברים

<ol><li>Boutari, C., Mantzoros, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+2022+update+on+the+epidemiology+of+obesity+and+a+call+to+action%3A+as+its+twin+COVID-19+pandemic+appears+to+be+receding%2C+the+obesity+and+dysmetabolism+pandemic+continues+to+rage+on%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolism%22%5BJournal%5D)">A 2022 update on the epidemiology of obesity and a call to action: as its twin COVID-19 pandemic appears to be receding, the obesity and dysmetabolism pandemic continues to rage on.</a> Metabolism. 133, 155217(2022).</li>
<li>Hales, C. M., Carroll, M. D., Fryar, C. D., Ogden, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+obesity+and+severe+obesity+among+adults%3A+United+States%2C+2017-2018%5BTitle%5D)+AND+%22NCHS+Data+Brief%22%5BJournal%5D)">Prevalence of obesity and severe obesity among adults: United States, 2017-2018.</a> NCHS Data Brief. (360), 1-8 (2020).</li>
<li>Berry, D. C., Stenesen, D., Zeve, D., Graff, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developmental+origins+of+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The developmental origins of adipose tissue.</a> Development. 140 (19), 3939-3949 (2013).</li>
<li>Wang, W., Seale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+brown+and+beige+fat+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of brown and beige fat development.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (11), 691-702 (2016).</li>
<li>Maliszewska, K., Kretowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+tissue+and+its+role+in+insulin+and+glucose+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Brown adipose tissue and its role in insulin and glucose homeostasis.</a> Int J Mol Sci. 22 (4), 1530(2021).</li>
<li>Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+tissue%3A+function+and+physiological+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Brown adipose tissue: function and physiological significance.</a> Physiol Rev. 84 (1), 277-359 (2004).</li>
<li>Cypess, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+importance+of+brown+adipose+tissue+in+adult+humans%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans.</a> N Engl J Med. 360 (15), 1509-1517 (2009).</li>
<li>van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold-activated+brown+adipose+tissue+in+healthy+men%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Cold-activated brown adipose tissue in healthy men.</a> N Engl J Med. 360 (15), 1500-1508 (2009).</li>
<li>Virtanen, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+brown+adipose+tissue+in+healthy+adults%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Functional brown adipose tissue in healthy adults.</a> N Engl J Med. 360 (15), 1518-1525 (2009).</li>
<li>Cypess, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+localization%2C+gene+expression+profiling+and+functional+characterization+of+adult+human+neck+brown+fat%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Anatomical localization, gene expression profiling and functional characterization of adult human neck brown fat.</a> Nat Med. 19 (5), 635-639 (2013).</li>
<li>Leitner, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+human+brown+adipose+tissue+in+lean+and+obese+young+men%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mapping of human brown adipose tissue in lean and obese young men.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (32), 8649-8654 (2017).</li>
<li>Mo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+supraclavicular+brown+adipose+tissue+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a supraclavicular brown adipose tissue in mice.</a> JCI Insight. 2 (11), e93166(2017).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Expression+Analysis+of+Environmental+Temperature+and+High-Fat+Diet-Induced+Changes+in+Mouse+Supraclavicular+Brown+Adipose+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Gene Expression Analysis of Environmental Temperature and High-Fat Diet-Induced Changes in Mouse Supraclavicular Brown Adipose Tissue.</a> Cells. 10 (6), 1370(2021).</li>
<li>Chang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+perivascular+adipose+tissue+on+peroxisome+proliferator-activated+receptor-gamma+deletion+in+smooth+muscle+cells+impairs+intravascular+thermoregulation+and+enhances+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Loss of perivascular adipose tissue on peroxisome proliferator-activated receptor-gamma deletion in smooth muscle cells impairs intravascular thermoregulation and enhances atherosclerosis.</a> Circulation. 126 (9), 1067-1078 (2012).</li>
<li>Ye, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+and+functional+characteristics+of+the+thoracic+aorta+perivascular+adipocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte.</a> Cell Mol Life Sci. 76 (4), 777-789 (2019).</li>
<li>de Jong, J. M., Larsson, O., Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stringent+validation+of+mouse+adipose+tissue+identity+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">A stringent validation of mouse adipose tissue identity markers.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 308 (12), E1085-E1105 (2015).</li>
<li>Fu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+cells+differentiate+into+brown+adipocytes+and+contribute+to+periaortic+arch+adipose+tissue+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural crest cells differentiate into brown adipocytes and contribute to periaortic arch adipose tissue formation.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 39 (8), 1629-1644 (2019).</li>
<li>Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sectioning+mammary+gland+whole+mounts+for+lesion+identification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Sectioning mammary gland whole mounts for lesion identification.</a> J Vis Exp. (125), e55796(2017).</li>
<li>Berry, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Imaging of adipose tissue.</a> Methods Enzymol. 537, 47-73 (2014).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

בפרוטוקול זה, אנו מציגים בפירוט את ההליכים לניתוח ועיבוד scBAT עבור H&E וניתוח ביטוי גנים. מכיוון ש- scBAT שוכן בשכבת הביניים של הצוואר ונמצא לאורך הוורידים הגדולים, הבידוד של מחסן זה דורש טכניקה מדויקת. באופן ספציפי, כדי לקבל תצוגה ברורה של המחסן, אנו ממליצים למקם את העכבר תחת מיקרוסקופ ניתוח לאחר פתיחת הצוואר. באמצעות זוג מלקחיים נקודתיים עדינים במיוחד כדי לקלף scBAT מבלוטת הרוק והוורידים שמסביב, יש להקפיד להימנע מניקוב הוורידים. דימום יתר יכול להקשות על איתור scBAT. כדי לעבד scBAT לצביעת H&E, התאמנו את השימוש בפרוטוקול19 שפורסם עם שינויים קלים כדי לכלול שימוש ב-4% PFA, אלכוהול מיובש, וממס אורגני, טולואן, לעיבוד רקמות כפי שמוצג בסעיף הפרוטוקול. ההליך כולו לוקח ~ 6 ימים כדי להשלים, ואת שקופיות מוכתמות H&E ניתן לצלם למחרת לאחר השלמת הצביעה.
RT-qPCR באמצעות RNA כחומר מוצא הוא השיטה הנפוצה ביותר לניתוח ביטוי גנים בתחום הביולוגיה של רקמת השומן. מכיוון ש-scBAT הוא מחסן BAT קטן יחסית בהשוואה ל-iBAT, השגת מספיק RNA לביטוי גנים יכולה להיות קשה. כדי להגדיל את תפוקת ה-RNA, אנו ממליצים לבצע שלבי הכנה רציפים לליזט כמפורט בסעיף הפרוטוקול, החל מאבקת הרקמה באמצעות מזיק וטיט בזמן ההקפאה. באמצעות שיטת הכנת ליזט זו, השגנו בהצלחה דגימת RNA באיכות גבוהה ובעלת תפוקה גבוהה לניתוח ביטוי גנים של scBAT מעכבר בוגר אחד. שיטת הכנת ליזט זו יכולה להיות מיושמת גם כדי להשיג ליזטים חלבונים באיכות גבוהה מ scBAT עבור כתמים מערביים עם שימוש במאגר ליזה חלבון.
באמצעות iBAT עכברי, חוקרים צברו ידע משמעותי לגבי תפקוד BAT בתרמוגנזה ובמטבוליזם. הזיהוי האחרון של כמה מחסני BAT שלא היו מוכרים בעבר בעכברים ובבני אדם, כולל scBAT, חשף את הצורך במחקרים נוספים לפני שנוכל להבין באופן מלא את התרומה הפיזיולוגית של BAT בעכברים ובבני אדם בוגרים. בפרט, מחקרים המאירים את מקורותיהם, תפקודיהם ומעורבותם של מחסני BAT חדשים אלה שנמצאו לאחרונה בתרמוגנזה ובמטבוליזם אזורי או של כל הגוף מוצדקים.

השכיחות הגוברת של השמנת יתר בארה"ב ובעולם הציתה עניין רב בהבנת האטיולוגיה שלה ובזיהוי טיפולים פוטנציאליים 1,2. רקמת השומן ממלאת תפקיד חיוני בחילוף החומרים, וחוסר ויסות של רקמת השומן יכול להוביל להתפתחות של השמנת יתר. בדרך כלל, ישנם שני סוגים של רקמות שומן, רקמת שומן לבנה וחומה. בעוד רקמת שומן לבן (WAT) יכולה לאחסן אנרגיה כימית ולהפריש גורמים אנדוקריניים, רקמת שומן חום (BAT) יכולה להשתמש באנרגיה כימית כדי לייצר חום ולשמור על טמפרטורת הגוף בקור 3,4. בגלל יכולת ייחודית זו, הפעלת BAT יכולה גם להגדיל את הוצאת האנרגיה ולשפר את הרגישות לאינסולין5.
BAT מפעיל את תפקידו באמצעות תרמוגנזה שאינה רועדת, תהליך המתווך על ידי פירוק צימוד חלבון 1 (UCP1)6. יונקים, כולל עכברים ובני אדם, מחזיקים בכמויות משתנות של BAT. ההשקפה הקלאסית של BAT היא שרקמות שומן אלה נפוצות יותר בעכברים ובתינוקות מאשר בבני אדם בוגרים. iBAT, הממוקם באגף הגבי העליון בין עצם השכמה, הוא מחסן העטלף הנחקר ביותר בעכברים. על ידי יישום בדיקות הדמיה רדיואיזוטופית וביופסיה, מחקרים אחרונים זיהו מספר מחסני BAT בבני אדם בוגרים. חלקם, כולל המחסנים שנמצאו באזור הצוואר העמוק והסופרקלאביקולרי, לא זוהו קודם לכן בעכברים או בחיות מודל אחרות 7,8,9,10,11. מבין מחסני ה-BAT הללו, ה-scBAT הוא המחסן הנפוץ ביותר בבני אדם בוגרים. כדי להבין טוב יותר את המקור ואת התרומה המולקולרית של מחסני BAT אלה שנמצאו לאחרונה בבני אדם, חיוני לזהות מחסנים מקבילים בעכברים המאפשרים מניפולציות גנטיות ומולקולריות כדי לעקוב ולבדוק את התפקיד התפקודי של מחסנים אלה. לפיכך, אנו ואחרים זיהינו כמה מחסני BAT שלא היו ידועים קודם לכן במקומות אנטומיים שונים בעכברים, כולל scBAT12,13, BAT פריווסקולרי בית החזה14,15, BAT פריrenal16 ו- BAT פריאורטי17. עכבר scBAT דומה אנטומית scBAT אנושי ודומה מורפולוגית iBAT קלאסי, מבטא רמות גבוהות של UCP112.
שלא כמו iBAT עכבר, אשר ניתן לנתח בקלות, scBAT ממוקם בשכבת הביניים של צוואר העכבר, מתחת לבלוטות הרוק לאורך וריד הצוואר החיצוני. בידוד של מחסן זה לצורך ניתוחים היסטולוגיים ומולקולריים יכול להיות מאתגר. כאן, אנו מתארים בפירוט את ההליך לניתוח scBAT מעכברים לאחר לידה ובוגרים ועיבוד מחסן זה עבור היסטולוגיה וניתוח ביטוי גנים.

<table><tbody><tr><td>95% אלכוהול מייבש (Flex 95)</td><td>Epredia</td><td>8201</td><td></td></tr><tr><td>100% אלכוהול מייבש (Flex 100)</td><td>Epredia</td><td>8101</td><td></td></tr><tr><td>צלחת PCR 96 בארות</td><td>Bio-Rad</td><td>MLL9601</td><td></td></tr><tr><td>Aurum Binding Mini Column</td><td>Bio-Rad</td><td>7326826</td><td></td></tr><tr><td>Aurum High Strict Wash</td><td>Bio-Rad</td><td>7326803-Aurum</td><td></td></tr><tr><td>Low Strictency Wash</td><td>תבניות בסיס Bio-Rad</td><td>7326804</td><td></td></tr><tr><td>(להטמעה)</td><td>Tissue-Tek</td><td>4122</td><td></td></tr><tr><td>BD מחט PrecisionGlide 21 גרם x 1 1/2 אינץ'</td> <td>Becton Dickinson</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1840148</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה ללא מכסה 2 מ"ל</td><td>Fisherbrand</td><td>02-681-453</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5430R</td><td></td></tr><tr><td>CFX Opus 96 מכשיר PCR בזמן אמת</td><td>Bio-Rad</td><td>12011319</td><td></td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>תרמו מדעי</td><td>כימיקלים 383760010</td><td></td></tr><tr><td>ציטוזיל 60 בינוני הרכבה בעל צמיגות נמוכה</td><td>Epredia</td><td>83104</td><td></td></tr><tr><td>DEPC-Treated Water</td><td>Ambion</td><td>AM 9906</td><td></td></tr><tr><td>ניתוח מיקרוסקופ</td><td>ניקון</td><td></td><td></td>SMZ1500</tr><tr><td>תמיסת דילול DNase</td><td>Bio-Rad</td><td>7326805</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Bio-Rad</td><td>7326828</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>תמיסת Invitrogen</td><td>18427013</td><td></td></tr><tr><td>Elution</td><td>Bio-Rad</td><td>7326801</td><td></td></tr><tr><td>EM 400 הטמעת פרפין בינוני</td><td>Leica Biosystems</td><td>3801320</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y (0.5% w/v)</td><td>RICCA</td><td>2858-16</td><td></td></tr><tr><td>פורמולה R הסננה פרפין בינוני</td><td>Leica Biosystems</td><td>3801470</td><td></td></tr><tr><td>Genemark Nutator Gyromixer 349</td><td>Bio Express</td><td>S-3200-2</td><td></td></tr><tr><td>Gill #3 Hematoxylin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GHS332-1L</td><td></td></tr><tr><td>HCl (עבור HCL-אתנול)</td> <td>Fisher Chemical</td><td>A142212</td><td></td></tr><tr><td>IP VI הטמעת קלטות</td><td>Leica Biosystems</td><td>39LC-550-5-L</td><td></td></tr><tr><td>אתנול טהור של קופטק - 200 הוכחה (עבור 70% אתנול)</td><td>Decon Labs</td><td>V1001</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 (25 מ"מ</td>)<td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0971</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.7 מ"ל</td><td>Avantor</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>אטמי מיקרו-סיל 'B' (אטמים אדהיים)</td><td>Bio-Rad</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica Biosystems</td><td>RM2245</td><td></td></tr><tr><td>ביולוגיה מולקולרית כיתה</td><td>קורנינג</td> מים <td>46-000-CM</td><td></td></tr><tr><td>מרגמה Coors Tek</td><td>Thomas Scientific</td><td>60310</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (עבור 0.85% מלח)</td> <td>Fisher Bioreagents</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop ספקטרופוטומטר</td><td>NanoDrop Technologies</td><td>ND-1000 UV/Vis</td><td></td></tr><tr><td>Oligo dT</td><td>Invitrogen</td><td>18418020</td><td></td></tr><tr><td>פרפין מדור ציפה אמבט</td><td>Boekel Scientific</td><td>14792V</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td></td></tr><tr><td>PCR רצועת צינור</td><td>Avantor</td><td>76318-802</td><td></td></tr><tr><td>Pestle by Coors Tek</td><td>Thomas Scientific</td><td>60311</td><td></td></tr><tr><td>Pestle Pellet Motor</td><td>Kimble</td><td>749540-0000</td><td></td></tr><tr><td>מלח מאגר פוספט (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>דיוק דגם 19 תנור ואקום&nbsp;</td>פריימר <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>CAT# 51221162</td><td></td></tr><tr><td>: 36B4&nbsp; (קדימה) 10 &mu; M 5' TGA AGT GCT CGA CAT CAC AGA GCA 3'</td><td></td><td></td> מעבדת <td>חן מסד נתונים Oligo</td></tr><tr><td>פריימר: 36B4 (גב) 10 &mu; M 5' GCT TGT ACC CAT TGA TGA TGG AGT GT 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Oligo database Primer</td></tr><tr><td>: Fabp4 (קדימה) 10 &mu; M 5' ACA CCG AGA TTT CCT TCA AAC TG 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Oligo</td></tr><tr><td>database Primer: Fabp4 (גב) 10 &mu; M 5' CCA TCT AGG GTT ATG ATG CTC TTC A 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Oligo</td></tr><tr><td>database Primer: Glut 4 (פריימר קדימה) 10 &mu; M 5' CTG ATT CTG CTG CCC TTC TGT CCT 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Oligo</td></tr><tr><td>database Primer: Glut 4 (הפוך) 10 &mu; M 5' GAC ATT GGA CGC TCT CTC TCC AAC TT 3'</td><td></td><td></td> מעבדת <td>חן מסד נתונים Oligo</td></tr><tr><td>פריימר: PPARg (קדימה) 10 &mu; M 5' AGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG ACA 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Oligo</td></tr><tr><td>database Primer: PPARg (reserve) 10 &mu; M 5' AAA TTC GGA TGG CCA CCT CTT TGC 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Oligo</td></tr><tr><td>database Primer: Ppargc1a (גב) 10 &mu; M 5' ATG TTG CGA CTG CGG TTG TGT ATG 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Oligo</td></tr><tr><td>database Primer: Ppargc1a (קדימה) 10 &mu; M 5' ACG TCC CTG CTC AGA GCT TCT CA CA 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Oligo database Primer</td></tr><tr><td>: Ucp1 (קדימה) 10 &mu; M 5' AGC CAC CAC AGA AAG CTT GTC AAC 3'</td><td></td><td></td> מעבדת <td>חן מסד נתונים Oligo</td></tr><tr><td>פריימר: Ucp1 (הפוך) 10 &mu; M 5' ACA GCT TGG TAC GCT TGG GTA CTG 3'</td><td></td><td></td><td>מעבדת חן</td></tr><tr><td>תמיסת בידוד RNA של מסד נתונים Oligo (PureZol)</td><td>Bio-Rad</td><td>7326880</td><td></td></tr><tr><td>RNase Away (מטהר פני השטח)</td><td>Thermo Scientific</td><td>1437535</td><td></td></tr><tr><td>RNase H</td><td>NEB</td><td>M0297S</td><td></td></tr><tr><td>מעכב Rnase (RNase Out)</td><td>בקבוקון נצנוץ Invitrogen</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>(זכוכית)</td><td>מיקרוסקופ אלקטרונים מדעים</td><td>72632</td><td></td></tr><tr><td>ספסל לייבוש שקופיות&nbsp;</td><td>אלקטרותרמי (Cole-Parmer)</td> <td>MH6616</td><td></td></tr><tr><td>מתלה צביעה אל חלד</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>70312-54</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סטריאו (להטמעה)</td> <td>Olympus</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>מספריים סוגיות</td><td>McKesson</td><td>43-1-104</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים מוכשרים ישרים לניתוח</td>, <td>Avantor</td><td>82027-402</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus מיקרוסקופ שקופיות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III Reverse Transcriptase (כולל 5x מאגר גדיל ראשון ו-0.1M DTT)&nbsp;</td>מזרק <td>Invitrogen</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>SUR-VET עם מחט 25 גרם x 5/8 אינץ', 1 מ"ל</td><td>Terumo</td><td>100281</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green (תערובת מאסטר של אנזים qPCR)</td> <td>Applied Biosystems</td><td>A25778</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek סט צביעת שקופיות ידני (צנצנות)</td> <td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>מק"ט: 62540-01</td><td></td></tr><tr><td>טולואן</td><td>פישר כימיקל</td><td>T324-1</td><td></td></tr><tr><td>העברת פיפטה</td><td>Avantor</td><td>414004-005</td><td></td></tr><tr><td>קסילן</td><td>פישר כימיקל</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr></tbody></table>

דיסקציה, עיבוד היסטולוגי וניתוח ביטוי גנים של רקמת שומן חומה סופרקלאביקולרית מורין

Dissection, Histological Processing, and Gene Expression Analysis of Murine Supraclavicular Brown Adipose Tissue

תרמוגנזה בתיווך רקמת שומן חום (BAT) ממלאת תפקיד חשוב בוויסות חילוף החומרים, והמורפולוגיה והתפקוד שלה יכולים להיות מושפעים מאוד מגירויים סביבתיים בעכברים ובבני אדם. נכון לעכשיו, מורין interscapular BAT (iBAT), הממוקם בין שתי עצם השכמה באגף הגבי העליון של עכברים, הוא מחסן BAT העיקרי המשמש מעבדות מחקר לחקר תפקוד BAT. לאחרונה זוהו בעכברים כמה מחסני BAT שלא היו ידועים קודם לכן, כולל אחד המקביל לרקמת שומן חומה סופרקלאביקולרית אנושית. שלא כמו iBAT, רקמת שומן חומה סופרקלאביקולרית (scBAT) ממוקמת בשכבת הביניים של הצוואר ולכן לא ניתן לגשת אליה בקלות.
כדי להקל על המחקר של scBAT עכבר שזוהה לאחרונה, מוצג כאן פרוטוקול המפרט את השלבים לניתוח scBAT שלם מעכברים לאחר לידה ובוגרים. בשל גודלו הקטן של scBAT ביחס למחסני שומן אחרים, הנהלים שונו והותאמו במיוחד לעיבוד scBAT. בין שינויים אלה הוא השימוש במיקרוסקופ מנתח במהלך איסוף רקמות כדי להגדיל את הדיוק וההומוגניזציה של דגימות scBAT קפואות כדי להעלות את היעילות של ניתוח qPCR לאחר מכן. בעזרת אופטימיזציות אלה, ניתן לקבוע את הזיהוי, המראה המורפולוגי והאפיון המולקולרי של scBAT בעכברים.

שלא כמו iBAT, אשר ממוקם בשכבה התת-עורית של הגב בין שתי השכמה, scBAT ממוקם בשכבת הביניים של הצוואר, המשתרעת עמוק בין שכבות שרירי השלד ובלוטת הרוק כשהיא גדלה לאורך וריד הצוואר החיצוני (איור 1A). ניתוח scBAT אינו פשוט כמו iBAT. במאמר זה אנו מספקים הליך מפורט הכולל שלבים חיוניים לניתוח SCBAT שלם מעכברים בוגרים ואחרי לידה (איור 1B,C). לאחר פתיחת הצוואר באמצעות הפרוטוקול שסופק, ניתן לזהות שכבה דקה של scBAT תחת מיקרוסקופ מנתח ולקלף מבלוטת הרוק המחוברת ומווריד הצוואר החיצוני באמצעות זוג מלקחיים (איור 1D,E). כדי להעריך את המורפולוגיה של המחסן, scBAT מבודד טרי עובד באמצעות הליך העיבוד שסופק בשילוב עם הליך צביעת H&amp;Eשפורסם בעבר 19 (איור 2A). כפי שניתן לראות באיור 2B, ל-scBAT יש מבני רקמות האופייניים למחסני BAT, והוא מורכב מהרבה אדיפוציטים קטנים ורב-לוקולריים בעכברים בריאים לאחר לידה ובעכברים בוגרים. כדי להעריך את רמות ביטוי הגנים ב-scBAT, רנ"א הופק ממחסני scBAT מבודדים באמצעות ההליכים שסופקו (איור 3A). לאחר מכן ניתן להעריך את רמות הביטוי של גנים מעניינים באמצעות שיטות RT-qPCR סטנדרטיות (איור 3A). כפי שניתן לראות באיור 3B, רמות הביטוי הדיפרנציאלי של גנים המעורבים בתיווך תפקוד scBAT, כולל Pparg, הרגולטור הראשי של התפתחות BAT; Fabp4 ו-Glut4, שני מובילי חומרים מזינים; ו-Ucp1 ו-Ppargc1a, שני גנים המעורבים בתרמוגנזה, ניתנים לקביעה בקלות. לשם השוואה, רנ"א הופק מ-iBAT מבודד, והביטוי של הגנים שצוינו לעיל הוערך גם באמצעות ההליכים שסופקו (איור 3A). רמות הביטוי של גנים אלה דומות יחסית בין שני המחסנים הללו. (איור 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66475/66475fig1.jpg"> איור 1: מיקום אנטומי של scBAT ותהליך הדיסקציה שלו. (A) מיקום scBAT בשכבת הביניים של הצוואר. (B) השכבה השטחית של הצוואר לפני ואחרי הסרת העור. סרגל קנה מידה = 250 מיקרומטר. קווים צהובים מנוקדים מתארים את האזור שיש לחשוף לאחר ביצוע החתך בצורת U. (C) תמונה של פגר עכבר המונח מתחת למיקרוסקופ מנתח כדי להגביר את בהירות הראייה במהלך נתיחה. (ד,ה) תמונות מייצגות של שכבת הביניים של הצוואר לפני ואחרי הסרת scBAT מעכברים בני 3 שבועות ו -3 חודשים. סרגל קנה מידה = 250 מיקרומטר. קווים צהובים מנוקדים מתארים מחסני scBAT דו-צדדיים חשופים; n = 2. קיצורים: scBAT = רקמת שומן חומה supraclavicular; SFI = שכבה שטחית; sg = בלוטת הרוק; tr = קנה הנשימה; jv = וריד ג'וגולרי חיצוני; SM = שריר השלד. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66475/66475fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66475/66475fig2.jpg"> איור 2: עיבוד scBAT עבור צביעת H&amp;E. (A) תרשים זרימה הממחיש את השלבים העיקריים של עיבוד scBAT עבור צביעת H&amp;E. לאחר ניתוח הרקמה, היא קבועה ברצף, מיובשת, מוטמעת, חתוכה ומוכתמת. (B) תמונות מייצגות של scBAT מוכתם ב-H&amp;E מעכברים בני 3 שבועות ו-3 חודשים; n = 3 עבור כל שלב התפתחותי; סרגל קנה מידה = 250 מיקרומטר לתמונות בהגדלה נמוכה יותר; סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר לתמונות בהגדלה גבוהה יותר. קיצורים: scBAT = רקמת שומן חומה supraclavicular; PFA = paraformaldehyde; H&amp;E = hematoxylin ו eosin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66475/66475fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66475/66475fig3.jpg"> איור 3: הכנת רנ"א מ-scBAT לניתוח ביטוי גנים. (A) תרשים זרימה המדגים את שלבי בידוד ה-RNA וניתוח RT-qPCR של ביטוי גנים scBAT. בשל גודלו הקטן ומרקמו הרך, הקפאת מחסן scBAT וטחינתו בחנקן נוזלי חיונית לבידוד מוצלח של RNA. (B) ביטוי יחסי של גנים בסמן, כולל Pparg, Fabp4, Glut4, Ucp1 ו-Ppargc1a, ב-scBAT וב-iBAT שבודדו מעכברים זכרים בני 3 חודשים, n = 5. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. 36B4 שימש כגן משק בית לנורמליזציה. קיצורים: scBAT = רקמת שומן חומה supraclavicular; RT-qPCR = PCR שעתוק הפוך-כמותי; LN2 = חנקן נוזלי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66475/66475fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

כאן, אנו מספקים הליך מעשי לניתוח וביצוע ניתוחים היסטולוגיים וביטוי גנים של רקמת שומן חומה סופרקלאביקולרית.

Brown adipose tissue (BAT)-mediated thermogenesis plays an important role in the regulation of metabolism, and its morphology and function can be greatly ...

dissection-histological-processing-gene-expression-analysis-murine

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בסרטון זה, אנו מדגימים את ההליך הכירורגי לבידוד רקמת השומן הלבן התת עורית ורקמת השומן החומה הבין-סקפולרית מעכבר שזה עתה נולד.

אוסף מחסן שומן לבן וחום מגור עכבר: הליך כירורגי לקצירת רקמת השומן הלבנה ורקמת השומן החומה מגור עכבר

בשל קשר דרסטי והשלילי בין השמנת יתר ומחלות רקע אחרים, מחקר על תפקיד השומן משחק במחלה ועל בריאות כללית היא מוצדקת. אנו מציגים פרוטוקול לבידוד והכריתה של מחסני שומן ומאפשרים לחקר השומן באמצעות באתר ובשיטות חוץ גופית.

לוקליזציה, זיהוי, וכריתה של בסיס מיון Murine שומן

קריו-סעיפים רצופים נאספים כדי לאפשר יישומים היסטולוגית והעשרה של RNA למדידות ביטוי גנים באמצעות אזורים סמוכים מתוך שרירי שלד יחיד עכבר. RNA באיכות גבוהה מתקבל מ 20 - 30 מ"ג של cryosections ומדידות ונקווה מושווים ישירות בין יישומים.

Cryosectioning של רציף אזורים של שרירי שלד עכבר אחת על ביטוי גנים ועל ניתוח היסטולוגית

כאן נתאר עבור פרוטוקול immunoprecipitation היעילה כרומטין (ChIP) ואחריו רצפי DNA תפוקה גבוהה (צ'יפ-seq) של רקמת שומן חום (בת) מבודד מן העכבר. פרוטוקול זה מתאים גם מיפוי היסטון שינויים וגם חוקרים הגנום כולו לוקליזציה של חלבונים היסטון שאינו של הריבית ב vivo.

כרומטין Immunoprecipitation של רקמת שומן חום מאתר

אדיפוציטים קיימות במחסנים נפרדים ויש להם תפקידים מגוונים בתוך המיקרו-סביבות הייחודיות שלהם. כמו הבדלים אזוריים אופי ותפקוד הפונקציה נחשפים, זיהוי סטנדרטית בידוד של מחסני חיוני לקידום השדה. בזאת, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לגבי כריתה של מחסני שומן בעכבר.

זיהוי וניתוח של מחסני עכבר מגוונים

אנו מציגים פרוטוקול עבור הבידוד, התרבות, והאינדוקציה האדיגנית של הרכס העצבי (NCADSCs) מתוך רקמת השומן של ה-Wnt-1 יצורים+/-; Rosa26Rfp/+ עכברים. NCADSCs יכול להיות מקור נגיש בקלות של ADSCs עבור מידול אדיפוגנזה או ליפוגנזה ב מבחנה.

בידוד, תרבות, והשראה של הרכס העצבי המקורי אדיפוז-תאי גזע שמקורם ברקמת אדיפוז

דו"ח זה מתאר פרוטוקול לבידוד בו זמנית של preadipocytes חום ולבן ראשוני מעכברים שזה עתה נולדו. תאים מבודדים ניתן לגדל בתרבות המושרה להבדיל לתוך adipocytes לבן וחום בוגר לחלוטין. השיטה מאפשרת אפיון גנטי, מולקולרי ותפקודי של תאי שומן ראשוניים בתרבות.

בידוד ובידול של Preadipocytes לבן וחום ראשוני מעכברים שזה עתה נולדו

מחקר זה מתאר שיטה חדשה לבידוד אדיפוציטים חומים מורין לניתוח ביטוי גנים וחלבונים.

בידוד אדיפוציטים חומים מרקמת שומן חום אינטרסקפולרית של מורין לניתוח ביטוי גנים וחלבונים

הדמיה פונקציונלית וכמות של מחסני שומן תרמוגניים בעכברים באמצעות גישה מבוססת הדמיה מיקרו-PET /MR.

הדמיה וכימות של רקמות שומן חום ובז' בעכברים באמצעות [18F]FDG מיקרו-PET/MR הדמיה

פרדיפוציטים מבודדים מהמקטע הווסקולרי של רקמת השומן החום הבין-סקפולרי מעכברים שזה עתה נולדו ומתמיינים לתאים שצוברים טיפות שומנים, מבטאים סמנים מולקולריים ומראים את המורפולוגיה המיטוכונדריאלית של אדיפוציטים חומים בוגרים. תאים אלה מנותחים עוד יותר על ידי immunofluorescence ומיקרוסקופ אלקטרונים הולכה.

התמיינות והדמיה של אדיפוציטים חומים מהמקטע הווסקולרי של רקמת השומן הבין-סקפולרית מעכברים שזה עתה נולדו

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד החצי-אוטומטי של מקטע כלי הדם סטרומה (SVF) מרקמת השומן של מורין כדי להשיג קדם-אדיפוציטים ולהשיג התמיינות אדיפוציט במבחנה. שימוש בדיסוציאטור רקמות לעיכול קולגנאז מפחית את השונות הניסיונית ומגביר את יכולת הרבייה.

בידוד חצי אוטומטי של מקטע כלי הדם הסטרומלי מרקמת השומן הלבנה באמצעות דיסוציאטור רקמות

למד פרוטוקול לניתוח רקמת שומן חומה סופרקלאביקולרית בעכברים לצורך ניתוח ביטוי גנים והיסטולוגיה. השיטה משפרת דיוק ויעילות חילוץ לחקר תפקודים מטבוליים ותפקידים פיזיולוגיים.

דיסקציה, עיבוד היסטולוגי וניתוח ביטוי גנים של רקמת שומן חומה סופרקלאביקולרית מורין

גלה סרטונים נוספים