Name: טכניקת הזרקה תוך צפקית בדגי זברה בוגרים הממזערת נזקי גוף ותמותה נלווית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-29T14:20:00.000+00:00
Duration: 2 min 32 s
Description: למד טכניקת הזרקה תוך צפקית חדשנית לדגי זברה בוגרים המפחיתה נזקי גוף ותמותה בניסויים עם תרכובות רעילות כמו דוקסורוביצין. שיטה זו מייעלת מחקר בקסיקולוגיה וביולוגיה התפתחותית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי ה- NIH (HL107304 ו- HL081753) וקרן מאיו (המרכז לגילוי ביו-רפואי ומרכז מחקר לב וכלי דם) ל- X.X. J.L. ממומן על ידי קרנות המחקר הבסיסיות עבור האוניברסיטאות המרכזיות של אוניברסיטת מרכז דרום, מס '56021702. תודה מיוחדת לבניניו גור וקוונטין סטיבנס על ניהול מתקן דגי הזברה.

כל ההליכים שנערכו אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של מאיו קליניק, תוך שמירה על הסטנדרטים המפורטים ב"מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה" (National Academies Press, 2011). כל דגי הזברה במחקר שייכים לזן הקריוטיפ ההודי הפראי (WIK). פרטי הריאגנטים והציוד ששימש למחקר מפורטים בטבלת החומרים.
1. הכנה ואחסון של תמיסת מלאי דוקסורוביצין
<ol><li>השג את מלאי doxorubicin ממקור מסחרי. הערה: דוקסורוביצין רגיש לאור, לכן רכשו אותו בצורת אבקה ואחסנו אותו במיכלים אטומים כדי להגן עליו מפני חשיפה לאור. בצעו את כל השלבים להכנת אבקת Dox בתוך מכסה מנוע כימי.</li>
	<li>ממיסים לחלוטין את אבקת Dox במים מזוקקים ומכינים תמיסת ציר בריכוז סופי של 5 מ"ג/מ"ל.</li>
	<li>Aliquot את המניה על ידי חלוקתו צינורות 1.5 מ"ל.</li>
	<li>עטפו את הצינורות ברדיד אלומיניום כדי להגן עליהם מפני חשיפה לאור.</li>
	<li>אחסן את תמיסת aliquot Dox ב- 4 ° C לאחסון לטווח קצר (&lt; חודש), או -20 ° C לאחסון לטווח ארוך10.</li>
</ol>2. קיבוץ הדגים לפי משקל גופם
<ol><li>קבצו את הדגים עם הפרש BW של פחות מ-10% יחד להזרקה לאחר מכן. הערה: כדי לחסוך מאמץ בשלב זה, דגים עם שונות BW של פחות מ-10% מסווגים באותו גודל.</li>
	<li>יש לאפשר לדגים לצום במשך 24 שעות לפני ההזרקה.</li>
	<li>מרדימים את הדג באמצעות מי עובר המכילים 0.16 מ"ג/מ"ל טריקאין למשך דקה אחת.</li>
	<li>הוציאו את הדג מהמים עם טריקאין וטפחו את שני צידי גוף הדג בנייר סינון נקי כדי להסיר עודפי מים.</li>
	<li>מדוד ורשום את BW של כל דג, ולאחר מכן החזר מיד את הדג למיכל התאוששות מלא במי מערכת מתוקים. הערה: הזרקת דוקס בוצעה על דגים לאחר שהגיעו לגיל 3 חודשים. במחקר זה, החוקרים השתמשו בדגים בני 3 חודשים עד 10 חודשים. ה-BWs של דגי זברה בוגרים, מזן WIK, עשויים לנוע בין 0.2 גרם ל-0.5 גרם. הרדמה ממושכת שנמשכה יותר מ-5 דקות, ולאחריה זריקת דוקס, הובילה לתמותה גבוהה של דגים.</li>
</ol>3. הכנת המחט והתחנה להזרקה
<ol><li>קבע את נפח ההזרקה של תמיסת ציר Dox (למשל, 5 מ"ג/מ"ל) הדרוש לכל דג בהתבסס על משקל הגוף הממוצע כדי להשיג את המינון המיועד של 20 מיקרוגרם/גרם.</li>
	<li>השתמש בנוסחה הבאה כדי לחשב את נפח ההזרקה: <img alt="נוסחת חישוב נפח הזרקה, מינון דגים, ריכוז, תרשים מדעי." src="/files/ftp_upload/66500/66500eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"></li>
	<li>הוסף 1x תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS) כדי לדלל את תמיסת Dox המחושבת בשלב 1 להזרקה, ולהגיע לנפח כולל של 5 μL. הערה: השתמש בתמיסת תפזורת עבור כל קבוצת דגים בהתבסס על BW שלהם וכלול 3 דגים נוספים בכל קבוצה כדי להבטיח שלא יהיה מחסור בתמיסה להזרקה במהלך הניסוי.</li>
	<li>הקש בעדינות על הצינור ולאחר מכן מיקרוצנטריפוגה קצרה במהירות שיא כדי לאסוף את התמיסה בטמפרטורת החדר במשך 10 שניות.</li>
	<li>הניחו את התמיסה המוכנה על קרח והגנו עליה מפני חשיפה לאור.</li>
	<li>הניחו צלחת פטרי נקייה בקוטר 100 מ"מ עם ספוג מתחת למיקרוסקופ ניתוח, ולאחר מכן התאימו את המיקוד. הערה: הספוג מכיל חריץ באורך 4 ס"מ. הנסיגה האלסטית של הספוג תספק לדג תמיכה ותשמור על גוף הדג במקומו. ניתן לעשות שימוש חוזר בספוג.</li>
	<li>צייד מזרק מיקרו 10 μL עם מחט משופעת 34 G.</li>
	<li>שטפו את המחט עם חיץ HBSS 1x כדי לסלק בועות ולנקות חסימות פוטנציאליות מהמזרק.</li>
	<li>למדוד 5 μL של הפתרון מוכן בשלב 4 עבור ההזרקה.</li>
</ol>4. הליך הזרקת IP Dox
<ol><li>שים את הדג הבוגר במים עם 0.16 מ"ג / מ"ל טריקאין למשך דקה אחת כדי לגרום למצב של חוסר הכרה.</li>
	<li>מקמו את הדג בחריץ של הספוג המשובץ כשהבטן פונה כלפי מעלה (איור 1A).</li>
	<li>הכניסו את המחט בזווית הקרובה ל-0°, החל מנקודת האמצע של סנפיר החזה לכיוון הצד האחורי של חלל הלב (איור 1B). הערה: הימנע מכל מגע עם הלב במהלך ההליך.</li>
	<li>כוונו את המחט לכיוון הזנב והיכנסו מתחת לעור הכסוף. הערה: מקם את המחט קרוב לעור הכסוף, תוך הקפדה על מניעת שריטות או פירסינג.</li>
	<li>עקבו אחר קצה המחט בתוך חלל הבטן לאורך כל הניתוח (איור 1C). הערה: הימנע מפגיעה בכבד, במעיים, בשלפוחית השחייה ובאיברים אחרים. ודא כי המחט מגיעה לסוף המעי, ליד פתח cloacal.</li>
	<li>שחררו בהדרגה ובאופן שווה את תמיסת 5 μL Dox, ואז משכו באיטיות את המחט לאורך הנתיב המקורי כדי למנוע דליפה (איור 1D).</li>
	<li>עקבו אחר נוכחות של Dox בחלל הבטן על-ידי התבוננות בצבע אדום של תמיסת Dox (איור 1E).</li>
	<li>העבירו במהירות את הדגים המוזרקים למיכל מעבר נקי מלא במי מערכת מתוקים כדי לעזור לדגים להתאושש. הערה: בין הזרקות, יש לשטוף את המחט פעם אחת עם חיץ HBSS אחד.</li>
</ol>5. טיפול בדגים לאחר הזרקה
<ol><li>החזירו את הדג למערכת עם מחזור הדם לאחר ההזרקה.</li>
	<li>צום את כל הדגים המוזרקים במשך 24 שעות נוספות כדי להקל על החלמתם.</li>
	<li>במהלך השבוע הראשון, השגיחו מקרוב על הדגים. הסר את הדגים המתים בהקדם האפשרי כדי למנוע הדבקה של הדגים האחרים. הערה: מקרי מוות של דגים במהלך 24 השעות הראשונות נובעים ככל הנראה מפציעות פיזיות מהזריקה או מהרדמה ממושכת. רשום מספרי דגים כדי ליצור עקומת הישרדות.</li>
	<li>בצע אקוקרדיוגרפיה לפנוטיפ של הדג המוזרק Dox ב 56 ימים לאחר ההזרקה11. הערה: ודא אחידות בתנאים ובנהלים עבור קבוצת הביקורת המתאימה המוזרקת עם תמיסת HBSS.</li>
</ol>

הזרקה תוך צפקית אופטימלית להעברת תרכובות בדגי זברה בוגרים

<ol><li>Tavares, B., Lopes, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+Zebrafish+in+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Medica+Portuguesa%22%5BJournal%5D)">The importance of Zebrafish in biomedical research.</a> Acta Medica Portuguesa. 26 (5), 583-592 (2013).</li>
<li>Dang, M., Henderson, R. E., Garraway, L. A., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+drug+administration+in+the+adult+zebrafish+using+oral+gavage+for+cancer+preclinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Long-term drug administration in the adult zebrafish using oral gavage for cancer preclinical studies.</a> Disease Model Mech. 9 (7), 811-820 (2016).</li>
<li>Sciarra, J. B., Tyler, A., Kolb, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gelatin-based+diet+for+oral+dosing+juvenile+to+adult+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal+Sci+Prof%22%5BJournal%5D)">A gelatin-based diet for oral dosing juvenile to adult zebrafish (Danio rerio).</a> Lab Animal Sci Prof. , https://api.semanticscholar.org/CorpusID:85611302 32-35 (2014).</li>
<li>Kinkel, M. D., Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraperitoneal+injection+into+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intraperitoneal injection into adult zebrafish.</a> J Vis Exp. (42), e2126(2010).</li>
<li>Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injection+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injection in adult zebrafish.</a> J Vis Exp. (34), e1645(2009).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraperitoneally+delivered+mesenchymal+stem+cells+alleviate+experimental+colitis+through+THBS1-mediated+induction+of+IL-10-competent+regulatory+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Intraperitoneally delivered mesenchymal stem cells alleviate experimental colitis through THBS1-mediated induction of IL-10-competent regulatory B cells.</a> Front Immunol. 13, 853894(2022).</li>
<li>De Smet, L., Ceelen, W., Remon, J. P., Vervaet, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+drug+delivery+systems+for+intraperitoneal+therapy+to+extend+the+residence+time+of+the+chemotherapeutic+agent%5BTitle%5D)+AND+%22The+Scientific+World+Journal%22%5BJournal%5D)">Optimization of drug delivery systems for intraperitoneal therapy to extend the residence time of the chemotherapeutic agent.</a> The Scientific World Journal. 2013, 720858(2013).</li>
<li>Dakwar, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomedicine-based+intraperitoneal+therapy+for+the+treatment+of+peritoneal+carcinomatosis-Mission+possible%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Nanomedicine-based intraperitoneal therapy for the treatment of peritoneal carcinomatosis-Mission possible.</a> Adv Drug Deliv Rev. 108, 13-24 (2017).</li>
<li>Al Shoyaib, A., Archie, S. R., Karamyan, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraperitoneal+route+of+drug+administration%3A+should+it+be+used+in+experimental+animal+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Res%22%5BJournal%5D)">Intraperitoneal route of drug administration: should it be used in experimental animal studies.</a> Pharmaceutical Res. 37, 1-17 (2020).</li>
<li>Ma, X., Ding, Y., Wang, Y., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+doxorubicin-induced+cardiomyopathy+model+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A doxorubicin-induced cardiomyopathy model in adult zebrafish.</a> J Vis Exp. (136), e57567(2018).</li>
<li>Wang, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+echocardiographic+assessment+of+cardiac+function+in+normal+adult+zebrafish+and+heart+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Standardized echocardiographic assessment of cardiac function in normal adult zebrafish and heart disease models.</a> Disease Model Mech. 10 (1), 63-76 (2017).</li>
<li>Christidi, E., Brunham, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+cell+death+pathways+in+doxorubicin-induced+cardiotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Regulated cell death pathways in doxorubicin-induced cardiotoxicity.</a> Cell Death Dis. 12 (4), 339(2021).</li>
<li>Zhu, W., Shou, W., Payne, R. M., Caldwell, R., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+juvenile+doxorubicin-induced+cardiac+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Res%22%5BJournal%5D)">A mouse model for juvenile doxorubicin-induced cardiac dysfunction.</a> Pediatric Res. 64 (5), 488-494 (2008).</li>
<li>Podyacheva, E. Y., Kushnareva, E. A., Karpov, A. A., Toropova, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+models+of+doxorubicin-induced+cardiomyopathy+in+rats+and+mice.+A+modern+view+from+the+perspective+of+the+pathophysiologist+and+the+clinician%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Analysis of models of doxorubicin-induced cardiomyopathy in rats and mice. A modern view from the perspective of the pathophysiologist and the clinician.</a> Frontiers Pharmacol. 12, 670479(2021).</li>
<li>Chaoul, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+drug+administration+techniques+in+zebrafish+models+of+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Assessing drug administration techniques in zebrafish models of neurological disease.</a> Int J Mol Sci. 24 (19), 14898(2023).</li>
<li>Lu, X., Lu, L., Gao, L., Wang, Y., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calycosin+attenuates+doxorubicin-induced+cardiotoxicity+via+autophagy+regulation+in+zebrafish+models%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Calycosin attenuates doxorubicin-induced cardiotoxicity via autophagy regulation in zebrafish models.</a> Biomed Pharmacother. 137, 111375(2021).</li>
</ol>

בשונה משתישיטות הזרקת IP 4,10 הקיימות, שיטת הזרקת ה- IP החדשה מאופיינת בתכונות השונות הבאות. ראשית, נעשה שימוש בזווית חדירה ייחודית של מחט (קרוב לאפס); שנית, המחט חודרת לדג דרך מיקום ייחודי, כלומר חור טבעי על פני השטח הגחוני של הדג, שיקל על ההזרקה; ולבסוף, תנועת המחט היא מהקדמי לאחורי. התאמות אלה מפחיתות ביעילות את הפגיעה באיברים, הנובעת מדליפה מינימלית של Dox במהלך תהליך החדירה. נתיב המחט נמצא ממש מתחת לעור הכסוף, אשר ניתן למעקב רציף על ידי החוקר. כתוצאה מכך, ניתן להימנע ביעילות ממגע ישיר בין קצה המחט לבין האיברים הפנימיים. לאחר ההזרקה, כל הדוקס המוזרק נשאר בחלל הבטן, והיציאה היחידה (נקודת ניקוב) יכולה להיסגר כאשר הדג ער ומתחיל לשחות קדימה.
בהשוואה לשתישיטות הזרקת IP 4,10 הקיימות, שיטת הזרקת ה- IP החדשה מביאה באופן עקבי למזעור נזקי הגוף ושיעורי הישרדות משופרים. הצהרה זו הודגשה עוד יותר על ידי ההיתכנות של זריקות מרובות באותו דג ליצירת מודל DIC כרוני של דגי זברה. חשוב לציין כי בהשוואה לשתישיטות הזרקת IP 4,10 הקודמות, השיטה החדשה ניתנת לשליטה מהירה על ידי חוקרים שאין להם ניסיון קודם בטיפול בדגי זברה בוגרים. נראה כי מודלים אמינים של DIC הושגו בהצלחה בניסיון הראשון או השני שלהם בידיהם של לפחות 4 חוקרים שונים. את הצלחת הזריקה ניתן להסיק בקלות בשבוע הראשון שלאחר ההזרקה: >80%, רצוי 100%, דגים אמורים להיות מסוגלים לשרוד לאחר ההזרקה. כל הדגים ישרדו עד 56 dpi, כאשר רוב הדגים (>80%) צריכים להיות נקיים מנזקי גוף ברורים. זהו שיפור משמעותי, מכיוון שמודל DIC אמין המשתמש בשתי שיטות ה- IP הראשונות יכול להיות מיוצב רק בידו של חוקר לאחר יותר מ -3 סבבי תרגול עם לפחות 10 דגים בכל סיבוב. תהליך זה עשוי לקחת זמן, מכיוון שכל תרגול דרש כחודשיים כדי לסיים את הצלחת הזריקה שלו. הפחתת טראומה לרקמות לא רק משפרת את רווחתם של הדגים, אלא גם ממזערת גורמים מבלבלים שיכולים להשפיע על תוצאות המחקר.
אחד השלבים הקריטיים להצלחת השיטה החדשה הוא זווית החדירה. כפי שניתן לראות באיור 2, כאשר זווית החדירה השתנתה מ-0° ל-45°, נצפתה תמותה משמעותית של דגים, ככל הנראה בשל סיכון מוגבר למגע בין קצה המחט לאיברים פנימיים.
המגבלה העיקרית של השיטה היא שלא ניתן להשתמש בשיטה כדי להעביר תרופות לדגים מתחת לגיל 3 חודשים. בגלל גודל גופם הקטן, דגים צעירים אינם יכולים לשרוד לאחר הנזק הפיזי הכרוך בחדירת מחט. עם זאת, השיטה יכולה לשמש בדגים בוגרים כאשר BW שלהם גדול מ 0.15 גרם, כולל אלה בגילאי 3 חודשים עד 4 שנים.
שיטה חדשה זו תהיה בשימוש נרחב להעברת סמים בדגי זברה בוגרים, במיוחד כאשר מתמודדים עם תרכובות רעילות פוטנציאליות כגון Dox15,16. כשמדובר בתרכובות לא רעילות, כל שלוש השיטות צריכות להיות ישימות.

דג זברה (Danio rerio) זכה לתשומת לב כמודל ניסיוני לחקר מחלות אנושיות מכיוון שבעל חיים זה כולל הומולוגיה גבוהה של גנים ואיברים לבני אדם, הפריה חיצונית, קלות מניפולציה גנטית ושקיפות הגוף לבגרות מוקדמת, המאפשרת מספר עצום של יישומי הדמיה1. בניגוד לתהליך הפשוט של העברת תרופות ישירות למים עבור עוברים וזחלים של דגי זברה, מתן תרופות לדגי זברה בוגרים מציג מאמץ מורכב ומאתגר יותר2.
בדגים בוגרים, תרכובות יכולות להיות מועברות באמצעות טכניקות פסיביות של העברת סמים, כגון מתן ישיר למים, או באמצעות שיטות העברת תרופות דרך הפה כמו gavaging2. גישות אחרות כוללות ציפוי מזון דגים בתרכובות ולאחר מכן הזנת הדגים3, ומתן ישיר של תרופות בלתי מסיסות במים בריכוז קבוע מראש, כולל זריקות רטרו-אורביטליות או תוך צפקיות 4,5. מתן תוך צפקי מועדף למחקרי in vivo של מודלים של מחלות בשל היתרונות הפרמקוקינטיים המובהקים שלו6. שיטה זו מספקת ריכוז גבוה של תרופות וזמן מחצית חיים מורחב בתוך חלל הצפק, ומציעה מסלול יעיל לאספקת תרופות 7,8. הגישה משמשת בדרך כלל במסגרות מחקר כדי להבטיח ספיגה והפצה אופטימלית של תרופות 9. בעוד שיטות מבוססות הזרקה הוכיחו יעילות עבור משלוח יחיד, זריקות ממושכות וחוזרות לעיתים קרובות להוביל נזק לגוף זיהום כרוני2.
נכון לעכשיו, ישנן שתי שיטות של הזרקת IP ב zerbafishבוגר 4,10. עם זאת, לשתי השיטות יש מגבלות כאשר הן מספקות תרכובות רעילות כמו דוקסורוביצין, מה שמוביל לנזק חמור לצורת הגוף ולתמותת דגים. תופעות הלוואי יכולות לסבך באופן משמעותי את פירוש הנתונים. למרות שניתן להתמודד עם אתגרים אלה באמצעות הכשרה מקיפה10, יש צורך ברור בשיטת הזרקת IP חדשה הממזערת את תופעות הלוואי.
כאן, המטרה שלנו היא לפתח שיטה חדשה של הזרקת IP המותאמת להעברה יעילה של דוקסורוביצין לדגי זברה בוגרים, ולהקל על יצירת מודלים אמינים של קרדיומיופתיה הנגרמת על ידי דוקסורוביצין (DIC) עם נזק גוף מינימלי ותמותה נלווית.

<table><tbody><tr><td>10 &mu; L NanoFil-seringe</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>NANOFIL</td><td>הזרקת</td></tr><tr><td>כלי 34 G מחט</td><td>מכשירי דיוק עולמיים, Inc</td><td>NI34BV-2</td><td>כלי injcetion</td></tr><tr><td>60 מ"מ צלחת פטרי</td><td>פישר מדעי/פישרברנד</td><td>FB0875713A</td><td>הנחת הספוג&nbsp;</td></tr><tr><td>ניתוח מיקרוסקופ</td><td>ניקון</td><td>SMZ800</td><td>משלב את</td></tr><tr>תרופת Dox<td>Doxorubicin hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>D1515-10MG</td><td>ליצירת מודל DIC&nbsp;</td></tr><tr><td>אקו לב</td><td>VISUAL SONICS</td><td>Vevo 3100</td><td>מדידת תפקוד הלב</td></tr><tr><td>ספוג קצף</td><td>Jaece Industries</td><td>L800-D</td><td>הנחת הדג</td></tr><tr><td>תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBBS)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>14025076</td><td>רכב</td></tr><tr><td>למיקרוצנטריפוגה Dox&nbsp;</td><td>southernlabware</td><td>MyFuge/C1012</td><td>אוספים את תמיסת Dox&nbsp;</td></tr><tr><td>משקל איזון מדויק</td><td>Torbal</td><td>AD60</td><td>מאזניים דיגיטליים</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Argent</td><td>MS-222</td> צינור <td>דגים מרדים</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>1.5 מ"ל</td><td>אחסון&nbsp;</td></tr><tr><td>VEVO LAB&NBSP; תוכנה</td><td>FUJIFILM VISUAL SONICS&nbsp;</td><td>5.6.0</td><td>כימות הלב</td></tr></tbody></table>

טכניקת הזרקה תוך צפקית בדגי זברה בוגרים הממזערת נזקי גוף ותמותה נלווית

An Intraperitoneal Injection Technique in Adult Zebrafish that Minimizes Body Damage and Associated Mortality

דג הזברה הבוגר (Danio rerio), שהוא נגיש גנטית, משמש כמודל בעל ערך לבעלי חוליות לחקר הפרעות אנושיות כגון קרדיומיופתיה. הזרקה תוך צפקית (IP) היא שיטה חשובה המספקת תרכובות לגוף לבדיקת השפעות טיפוליות או ליצירת מודלים של מחלות כגון קרדיומיופתיה הנגרמת על ידי דוקסורוביצין (DIC). נכון לעכשיו, ישנן שתי שיטות של הזרקת IP. לשתי השיטות יש מגבלות בטיפול בתרכובות רעילות כגון דוקסורוביצין, הגורמות לתופעות לוואי המתבטאות בפגיעה חמורה בצורת הגוף ובמוות של דגים. בעוד שניתן להתגבר על חסרונות אלה על ידי הכשרה מקיפה של החוקרים, שיטת הזרקת IP חדשה בעלת תופעות לוואי מינימליות רצויה. כאן, שיטת הזרקת IP ייחודית המסוגלת להתמודד עם תרכובות רעילות מדווחת. ירידה עקבית בתפקוד הלב עלולה לגרום ללא מוות משמעותי של דגים. ניתן לשלוט בטכניקה בקלות על ידי חוקרים שיש להם ניסיון מינימלי עם דגי זברה בוגרים.

בעבר, שתי שיטות intraperitoneal (IP) שימשו לניהול doxorubicin בדגי זברה בוגרים 4,10. בשיטה I, הידועה גם כשיטת הזרקת IP קלאסית כפי שתוארה על ידי Kinkel et al.4, המחט הוחדרה בזווית של 45° לקו האמצע בין סנפירי האגן כאשר הבטן פונה כלפי מעלה. בשיטה II, או שיטת הזרקת IP חלופית כפי שתוארה על-ידי Ma et al.10, המחט הוחדרה דרך הצד הגבי של הדג (איור 2A(i,ii)). לעומת זאת, בשיטה השלישית שלנו יש שני שינויים עיקריים. ראשית, מיקום ההזרקה משתנה, כאשר הבטן פונה כלפי מעלה והמחט מכוונת מנקודת האמצע של סנפיר החזה לכיוון הבטן. אתר החדירה מונחה על ידי חור טבעי באזור זה. שנית, זווית המחט מצטמצמת, שאמורה להיות קרובה ל-0° (איור 2A(iii), איור 1).
השוואה בין שלוש שיטות הזרקה תוך צפקית כדי להשוות בין שלוש שיטות הזרקת ה- IP מוצגים נתונים שהתקבלו מחוקר I, שלא היה לו ניסיון קודם עם דגי זברה. כאשר נעשה שימוש בשיטות I ו-II להזרקת IP, נרשמה תמותה משמעותית של דגים בשבועיים הראשונים לאחר הזרקת IP. בשיטה I, המוות נצפה שלושה ימים לאחר ההזרקה, ואילו בשיטה II, הוא התרחש לאחר יומיים לאחר ההזרקה. 70% מהדגים שהוזרקו הפגינו נזק נראה לעין בגוף, במיוחד סביב אתר ההזרקה, שהתבטא בירידה דרסטית בגודל הגוף ובצורת גוף מעוקלת חודש עד חודשיים לאחר הזרקת IP (איור 2A (iv,v)). ההשערה הייתה שניתן לייחס את התמותה ואת הנזק שנצפה לרעילות של דוקסורוביצין12, שעלול לדלוף מהקצה הפותח של מחט ההזרקה בתהליך ההזרקה, ולפגוע באיבר הפנימי לאורך מסלול ההזרקה. בשיטה I, קצה מחט ההזרקה יכול לגעת במעיים (איור 2A(i)), ואילו בשיטה II הוא יכול לגעת בשלפוחית השחייה (איור 2A(ii)). ההנחה הייתה שניתן למנוע מקצה המחט לגעת באיבר פנימי כלשהו באמצעות שיטה III (איור 2A(iii)). ואכן, נצפה שיפור משמעותי בשיעור ההישרדות, כאשר 80% מהדגים שרדו חודש לאחר ההזרקה (איור 2B). זה מסמל שיפור מדהים בהשוואה לשיעורי ההישרדות בשיטות I ו- II, שהיו 53.33% ו- 33.33%, בהתאמה. חשוב לציין ש-80% מהדגים ששרדו הציגו צורת גוף נורמלית, בניגוד לאלה שנוצרו בשיטות I ו-II (איור 2A(vi)). כדי לאמת את הדור המוצלח של מודל DIC, תפקוד הלב הוערך על ידי מדידת אחוז מקטע פליטה (EF%). ואכן, ירידה משמעותית ב-EF% נצפתה 56 ימים לאחר ההזרקה בקבוצה שהשתמשה בשיטה III (איור 2C).
שחזור שיטה III על ידי חוקרים שונים כדי להוכיח שניתן לשלוט בקלות בשיטה III על ידי חוקרים שונים, גויסו למחקר 3 חוקרים שמעולם לא עבדו עם דגי זברה לפני כן. בניסיונות הראשונים שלהם בשיטה III, כל החוקרים הצליחו להשיג שיעורי הישרדות של 85.71%, 95% ו-83.33% 56 ימים לאחר ההזרקה וירידה ניכרת ב-EF (איור 3A,B). יש לציין כי שלושה חוקרים חזרו על הניסוי שלהם 3 פעמים, 3 פעמים ו-2 פעמים, בהתאמה, והשיגו באופן עקבי תוצאות מוצלחות. נתונים אלה אישרו את יכולת החזרה של שיטה III, ואפשרו לחוקרים ללא ניסיון קודם בעבודה עם דגים ליצור מודלים אמינים של DIC.
באחד הניסיונות הראשונים בשיטה III, חוקר II בדק סטייה של שיטה III: במקום 0°, נעשה שימוש בזווית של 45° בעת חדירת המחט דרך העור (איור 2A(iii), חץ מקווקו). רק 15% מהדגים שרדו חודשיים לאחר ההזרקה (איור 3A), כאשר 80% מהדגים ששרדו הפגינו נזק גוף ניכר. הנתונים הצביעו על כך שזווית החדירה היא שלב קריטי להצלחת שיטה III.
שיטה III מאפשרת הקמת מודל DIC כרוני ההנחה הייתה כי נזק גוף מופחת באופן משמעותי עשוי לאפשר זריקות IP מרובות באותו דג, המחקה את מודל DIC הכרוני בעכברים13,14. לפיכך, שיטה III שימשה לביצוע סדרה של זריקות במשך 4 שבועות רצופים, עם 5 מיקרוגרם/גרם דוקס בשבוע (איור 4A). בניסוי זה, 100% מהדגים המוזרקים שרדו, ו-80% מהם לא הראו סימנים של נזק לגוף. חשוב לציין שמקטע פליטה מופחת משמעותית נצפה ב-56 dpi, מה שמצביע על יצירה מוצלחת של מודל DIC כרוני בדגי זברה בוגרים (איור 4B).
<img alt="טכניקת הזרקת חלל לב דגים בתרשים; תהליך החדרת מחט למחקר ביולוגי." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66500/66500fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> איור 1: מיקום וזווית החדרת המחט בשיטת הזרקת ה-IP החדשה. (A) מיקום החדרת המחט. הדג הפוך, חושף את צד הבטן. הראש הוא ימינה. חור טבעי ממוקם בין סנפירי החזה שהופך את החדירה של העור לפשוטה יותר. (B) זווית החדרת המחט. זה קרוב לאפס מעלות לפני השטח של הדג. (C) מסלול המחט מתחת לעור. קצה המחט מנוטר ברציפות פעם אחת בתוך חלל הבטן. נקודת הכניסה נראית שונה מאיור 1A בגלל עיוות העור במהלך תהליך החדירה. (D) דג לאחר שחרור דוקס. חלל הבטן הופך אדום לאחר שחרור הדוקס. (E) דג לאחר הזרקת IP. אין סימן לדליפה לאחר משיכת המחט. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66500/66500fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="שיטות מחקר דג זברה; גרף הישרדות; תרשים EF%; אתרי הזרקה; תוצאות השוואתיות." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66500/66500fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> איור 2: השוואה בין שלוש שיטות הזרקת IP בדגי זברה בוגרים. (A) סכמות של שלוש שיטות הזרקת IP. (ט-ג) מוצגות סכמות של הזרקת IP קלאסית (שיטה I), הזרקת IP חלופית (שיטה II) והשיטה החדשה (שיטה III). חצים מציינים את אתרי החדירה ואת זווית המחט עבור שלוש שיטות הזרקה. חץ מקווקו, זווית לא מוצלחת של חדירת מחט. סרגל קנה מידה: 5 מ"מ. (iv-vi) גודל גוף מופחת וצורת גוף מעוקלת בדגמי DIC. מוצגים דגים מייצגים מדגי DIC ברזולוציה של 56 dpi. (B) השוואה של עקומות הישרדות בין שלוש שיטות הזרקת IP. מספר הדגים ששרדו נרשם מדי שבוע. (הניסוי החל עם סך של n = 15). (C) הערכת תפקודי לב של דגים ב-56 dpi בעקבות עקה של Dox. n = 6 דגים בקבוצת הביקורת 1x HBSS, והניסוי החל עם סך של n = 15 דגים בכל 3 אצוות שהוזרקו עם Dox. הערכים מוצגים כממוצע ± שגיאת תקן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66500/66500fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="תרשים הישרדות ותרשים עמודות המציגים את יעילות הטיפול, שיעורי הישרדות ימים לאחר ההזרקה, נתוני EF%." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66500/66500fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> איור 3: שיטה III מאפשרת לבסס את מודל DIC של דגי הזברה באופן עקבי בידיהם של 3 חוקרים שונים. (A) עקומות הישרדות של דגי DIC באמצעות שיטה III על-ידי שלושה חוקרים שונים. שיעור הישרדות גבוה נרשם בכל שלושת החוקרים. מספר הדגים החיים נרשם מדי שבוע. שיעור הישרדות נמוך נצפה אצל חוקר II כאשר נעשה שימוש בשיטה III שלא הצליחה (זווית חדירת מחט של 45°, כפי שמוצג על-ידי חץ מקווקו באיור 2A). (B) הערכת תפקודי לב של דגי DIC בשיטה III על ידי שלושה חוקרים שונים. בסך הכל, חוקר II, עבור זווית חדירת מחט 45°, השתמש 3 אצוות (9, 12, 14) דגים עבור הזרקת Dox. עבור זווית חדירת מחט 0° n = 6 דגים הועסקו ב- HBSS 1x כקבוצת ביקורת משותפת. הניסוי החל עם סך של n = 85 דגים עם RII (9, 12, 14), RIII (8, 6, 6) ו-RIV (12, 18) שהופעלו בכל אחת מ-8 האצוות שהוזרקו עם Dox על ידי שלושה חוקרים (II, III, IV), בהתאמה. הערכים מוצגים כממוצע ± שגיאת תקן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66500/66500fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="דיאגרמת ציר זמן של הזרקת Dox וגרף עמודות EF% המשווה בין טיפולי WT (HBSS) ו- Dox." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66500/66500fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> איור 4: שיטה III מאפשרת הזרקות מרובות של Dox בדג זברה בוגר, שחזור מודלים כרוניים של DIC במכרסמים. (A) סכמות של מודל הזרקה מרובה. 5 מיקרוגרם/גרם דוקס (5 מיקרוליטר) הוזרק במשך ארבעה שבועות רצופים. (B) מודל ה-DIC הכרוני מבטא ירידה ב-EF% ב-56 dpi. הערכים מוצגים כממוצע ± שגיאת תקן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66500/66500fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

מתוארת שיטת הזרקה תוך-צפקית חדשה (IP) בדגי זברה בוגרים. בעת טיפול בתרכובות רעילות כגון דוקסורוביצין, הליך זה יעיל יותר משתי שיטות ה- IP שדווחו בעבר. הטכניקה תוכננה להיות מאומצת בקלות על ידי חוקרים בעלי ניסיון מוגבל במודל דגי הזברה.

The adult zebrafish (Danio rerio), which is genetically accessible, is being employed as a valuable vertebrate model to study human disorders such as ...

אנו שואפים ליצור מודלים של רעילות לב המושרה על ידי אנתרציקלין בדגי זברה בוגרים, כך שנוכל לגלות גנים ותרכובות טיפוליים חדשים. שיטת הזרקת IP אמינה חיונית כדי להבטיח את הצלחת הפרויקט הזה. אז שיטות הזרקת IP שפותחו בעבר הן טכניקות קלאסיות ואלטרנטיביות.בעוד השיטה הקלאסית חודרת לדגים מאתר הבטן דרך קו האמצע בין סנפירי האגן, השיטה האלטרנטיבית חודרת לדגים מהאתר הגבי הממוקם בין סנפירי האגן ופי הטבעת. בשל הרעילות של דוקסורוביצין, נזק גוף משמעותי ותמותה של דגים נרשמו באמצעות שתי שיטות ה- IP הנוכחיות. חוקרים חדשים צריכים לעבור הכשרה מקיפה לפני שניתן יהיה לבסס מודלים אמינים של מחלות בידיהם.תכננו שיטת הזרקת IP חדשה על ידי התאמת מיקום חדירת המחט וזווית חדירת המחט. אנו מזריקים דרך חור טבעי הממוקם באזור הגחון בין סנפירי החזה וחודרים דרך כיוון ייחודי קדמי לאחורי.

an-intraperitoneal-injection-technique-adult-zebrafish-that-minimizes

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

כאן אנחנו מראים איך לעשות רטרו מסלולית הזרקת דג הזברה מבוגר.

רטרו מסלולית הזרקה של דג הזברה למבוגרים

אנו מדגימים intraperitoneal הזרקה לתוך דג הזברה מבוגר. אנו משתמשים microsyringe 10 NanoFil μl נשלט על ידי בקר Micro4 ו UltraMicroPump III. הפגנה זו כוללת את השימוש במים קרים כחומר הרדמה.

הזרקה לתוך intraperitoneal דג הזברה למבוגרים

סרטון זה מתאר את הטכניקה של הזרקה תוך שרירית להעברת תרכובות לשרירים הגביים של דג זברה בוגר.

הזרקה תוך שרירית (IM): העברת תרכובת לשריר הגבי של דג זברה בוגר

סרטון זה מתאר טכניקה של הזרקה תוך צפקית, שיטה להעברת תמיסות לחלל הבטן של דגי זברה בוגרים.

הזרקה תוך צפקית: שיטה להעברת תמיסה לחלל הבטן של דג זברה בוגר

סרטון זה מתאר את הטכניקה של העברת תרכובות לליבם של דגי זברה בוגרים באמצעות הזרקה תוך חזה.

הזרקה תוך חזה: משלוח תרכובות ללב דג הזברה הבוגר

שיטה זו מסתמכת על הזרקה של 0.5-3 μL של הפתרון לתוך החזה של דג מבוגר. ההליך מספק ביעילות חלבונים ותרכובות כימיות לתוך הסמיכות של הלב דג זברה מבלי לפגוע האיבר. הגישה מתאימה לבדיקת ההשפעות של גורמי אקסוגני על רקמות שונות של הלב.

הזרקת תוך-החזה לחקר בוגרים של לב זברדג

כאן, אנו מציגים פרוטוקול אופטימלי ויעיל להזרקה תוך ורידית של תאים או חומרים פרמקולוגיים לדג זברה בוגר, וכתוצאה מכך השתלת תאים משופרת ושיעורי הישרדות מוגברים של דג הזברה המטופל.

הזרקה תוך ורידית אופטימלית בדגי זברה בוגרים

דג הזברה מהווה מודל חשוב ללמוד את מנגנוני התחדשות לב אצל בעלי חוליות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול אינדוקציה של אוטם לב דג הזברה למבוגרים באמצעות cryoinjury. שיטה זו גורמת מוות של תאים מסיבית של 20% קיר החדר, בדומה לזו שנצפתה אוטמים יונקים.

אינדוקציה של אוטם שריר הלב ב דג הזברה למבוגרים באמצעות Cryoinjury

דרך מהירה למסך למכפילים מלנומה תוך שימוש במודל גידול כבני מקום דג זברה מוצגת. הוא מנצל את וקטור miniCoopR המאפשר ביטוי של גנים מלנומה מועמד במלנוציטים. שיטה להשיג עקומות מלנומה ללא הישרדות, assay פלישה, פרוטוקול למכתים נוגדן של מלנוציטים קנה המידה וassay השתלה מלנומה מתוארת.

הקרנה למכפילים מלנומה תוך שימוש במודל גידול כבני מקום דג זברה

קביעת engraftment תא התורם מציגה אתגר במודלי עכבר השתלות מח עצם שאין מוגדרים היטב סמני phenotypical. אנו תארנו המתודולוגיה לכמת engraftment תא התורם גברי בעכברי השתלה נשיות. שיטה זו ניתן להשתמש בכל זני העכבר לחקר פונקציות HSC.

באמצעות PCR כמוני בזמן אמת לקביעת engraftment תא התורם במודל תחרותי Murine מח עצם השתלה

למד טכניקת הזרקה תוך צפקית חדשנית לדגי זברה בוגרים המפחיתה נזקי גוף ותמותה בניסויים עם תרכובות רעילות כמו דוקסורוביצין. שיטה זו מייעלת מחקר בקסיקולוגיה וביולוגיה התפתחותית.

טכניקת הזרקה תוך צפקית בדגי זברה בוגרים הממזערת נזקי גוף ותמותה נלווית

גלה סרטונים נוספים