Name: התמיינות ואפיון אוסטאוקלסטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-22T14:35:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: למד את הפרוטוקול להפקת אוסטאוקלסטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים של בני אדם (iPSCs) ואפיון תאים אלו. שיטה זו מספקת פתרון אמין למחקר מחלות עצם והנדסת רקמות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות לחברי מעבדת ג'יאצ'לי על עזרתם ותמיכתם הטכנית. אנו מודים למרכז W. M. Keck Microscopy Center ולמנהל מרכז Keck, ד"ר נתנאל פיטרס, על הסיוע בהשגת תמונות המיקרוסקופ הקונפוקלי והמיקרוסקופ הרחב. אנו מודים גם ל-Flow Core Facility של UW ולמנהל מתקן Flow Core, Aurelio Silvestroni, על התמיכה והסיוע הטכני. לבסוף, אנו מודים לחנה בלומקה על התמיכה באיור ובעיצוב גרפי.
המימון ניתן באמצעות מענק המכונים הלאומיים לבריאות R35 HL139602-01. אנו מכירים גם במענק S10 של NIH S10 OD016240 למימון מכשירים במרכז W. M. Keck וכן במענק NIH 1S10OD024979-01A1 למימון מכשירים במתקן UW Flow Core.

הערה: ניתן למצוא את כל הריאגנטים המשמשים בפרוטוקול זה בטבלת החומרים. אלא אם צוין אחרת, כל חומרי ההדפסה שוונו מראש ל-37°C לפני השימוש. כל שלבי הצנטריפוגה מבוצעים ב-37°C ובאמצעות מצב האצה/האטה האיטי ביותר. אלא אם כן צוין אחרת, סופרנאטנט מוסר תמיד באמצעות פיפטות זכוכית פסטר חד פעמיות.
1. הפשרה והפצה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים
<ol><li>יום לפני הפשרת תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים יש לצפות באר של צלחת בעלת 6 בארות ב-1 מ"ל תמצית קרום בסיסי בריכוז של 200-300 מק"ג/מ"ל. מניחים את צלחת הבאר על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
	<li>למחרת, להפשיר ולהעביר את התאים לתוך צינור 15 מ"ל באמצעות פיפטה P1000. Dropwise, להוסיף 5-7 מ"ל של DMEM/F-12 עם 15 mM HEPES.</li>
	<li>צנטריפוגה את התאים ב 300 x גרם במשך 5 דקות. הוציאו בעדינות את התאים מהצנטריפוגה, והקפידו לא להפריע לכדורית התא.</li>
	<li>הסר בזהירות את הסופרנאטנט עם פיפטה מזכוכית פסטר והשהה מחדש את התאים ב-1 מ"ל של מדיום נטול סרום hiPSC (hiPSC-SFM המכיל 10 מיקרומטר של מעכב Rho kinase (ROCK) Y-27632) באמצעות P1000 עם קצוות רחבים.</li>
	<li>שאפו את תמצית קרום הבסיס מהמצופה היטב ביום הקודם (שלב 1.1) והעבירו 1 מ"ל של hiPSC-SFM עם 10 מיקרומטר Y-27632 לבאר. הוסף iPSCs מרחפים לבאר כדי להגיע לנפח סופי של 2 מ"ל לכל באר.</li>
	<li>סובבו את הצלחת לפיזור שווה של אגרגטי iPSC לפני הכנסתם לאינקובטור בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2.</li>
	<li>בצע שינויים בינוניים מלאים אחת ליומיים באמצעות hiPSC-SFM (ללא תוספת של מעכב ROCK Y-27632). iPSCs בדרך כלל מגיעים 70-80% מפגש לאחר 3-4 ימים של התפשטות.</li>
</ol>2. iPSCs עוברים
<ol><li>יום אחד לפני העברת iPSCs, מצפים בארות של צלחת 6 בארות עם תמצית קרום בסיסי בריכוז של 200-300 מיקרוגרם / מ"ל. מניחים את צלחת הבאר על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. הערה: ודא שהתאים הגיעו למפגש של 70-80% בקירוב. ודא iPSCs לא מקבל overfluent (יותר מ 80% confluency), כמו זה יקדם דיפרנציאציה ספונטנית.</li>
	<li>התחל לעבור iPSCs על ידי הסרת אזורים מובחנים או אזורים עם אגרגטים מתים רבים iPSC מתחת לסטריאומיקרוסקופ באמצעות 10 μL או 20 μL פיפטה קצוות או מגרד תאים. אזורים מובחנים ייראו צפופים יותר או לבנים יותר בצבע. הערה: צברי תאים מגרדים עשויים עדיין להתחבר חלקית לתחתית הבאר.</li>
	<li>שטפו את קרקעית הבאר מספר פעמים עם פיפטה P1000 רחבה כדי להסיר אגרגטים שעדיין עשויים להיות מחוברים חלקית לתחתית הבאר.</li>
	<li>השליכו את המדיום המשומש שבו טופחו ה-iPSCs המכיל את אגרגטי ה-iPSC המנותקים. חזור על שלב הכביסה פעמיים נוספות עם מלח חוצץ פוספט (PBS).</li>
	<li>לאחר מכן, להוסיף 1 מ"ל של 5 U/mL Dispase לכל באר. קצוות מושבות iPSC יתרוממו מלוח הבאר, אותו ניתן לצפות תחת המיקרוסקופ הסטריאוסקופי לאחר דגירה של 3-5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>בזהירות להסיר Dispase כדי למנוע עקירה של אגרגטים מנותקים מעט ולהוסיף 1 מ"ל של DMEM/F-12 עם 15 mM HEPES. השתמשו במרים תאים חד פעמי כדי לפרוס את האגרגטים לגדלים קטנים. ניתן לשפר את העקביות של גדלי צבירת iPSC באמצעות כלי העברת תאי גזע.</li>
	<li>לשטוף את אגרגטים iPSC פרוס עם המדיום בבאר ולהעביר את המדיום עם אגרגטים לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל באמצעות פיפטה סרולוגית 5 מ"ל או P1000 עם קצה רחב משעמם.</li>
	<li>שטפו את הבאר עם DMEM/F-12 והעבירו את התווך לצינור של 15 מ"ל עם אגרגטים iPSC.</li>
	<li>צנטריפוגה את צברי iPSC פרוסים ב 200 x גרם במשך 3 דקות. הסר את הסופרנאטנט עם פיפטה מזכוכית פסטר והוסף 2 מ"ל של hiPSC-SFM כדי לעקור ולהשהות מחדש את תאי ה- iPSC באמצעות פיפטה סרולוגית של 5 מ"ל או P1000 עם קצוות רחבים.</li>
	<li>שאפו את שאריות תמצית קרום הבסיס מהצלחת המצופה מראש והוסיפו 1 מ"ל של hiPSC-SFM לכל באר של צלחת 6 הקידוחים.</li>
	<li>העבר iPSCs לתוך בארות חדשות של צלחת 6 בארות כך שהנפח הסופי הוא 2 מ"ל של hiPSC-SFM לכל באר באמצעות P1000 עם קצוות משעממים רחבים. בהתאם לקו iPSC, יש למטב את יחסי הפיצול. כאן נעשה שימוש ביחס פיצול של 1:6.</li>
	<li>בדוק את הבאר עבור אגרגטים צפים וגודל צבר מתחת לסטריאומיקרוסקופ. באופן אידיאלי, הגודל המצטבר צריך להיות בין 50-200 מיקרומטר.</li>
	<li>מערבלים את צלחת הבאר כדי לפזר את התאים באופן שווה על פני הצלחת לאחר העברת האגרגטים ולדגור ב 37 ° C ב 5% CO2 עד 70-80% מפגש.</li>
</ol>3. הקפאת תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים
<ol><li>כדי להקפיא תאי iPSC בחזרה, תאי מעבר כמתואר לעיל (ראה שלב פרוטוקול "2. העברת iPSCs"). לאחר שהתאים נחתכו למושבות ונשטפו מתחתית הבאר (שלב 2.10), סובבו את האגרגטים החתוכים במהירות של 200 x גרם למשך 3 דקות. שאפו את הסופר-נאנט.</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של אמצעי שימור בהקפאה ללא סרום לכל באר של צלחת 6 בארות לצינור 15 מ"ל והשהה מחדש את האגרגטים החתוכים באמצעות P1000 עם קצה משעמם רחב.</li>
	<li>העבר תאים לתוך cryotubes מסומן מראש. סגור צינורות ולהעביר צינורות לתוך מיכל cryopreservation מראש ב 4 ° C. אחסן תאים ב -80 ° C למשך 24-48 שעות.</li>
	<li>העברת קריובלים לחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך. הערה: סיכום סכמטי של תהליך התמיינות OC מומחש באיור 1.</li>
</ol>4. השראת גוף עוברי
<ol><li>לטפח ולהרחיב מספיק iPSCs כמתואר לעיל עבור אינדוקציה EB. הערה: ניתן להגדיל את ייצור OC על ידי הגדלת מספר הגופים העובריים, אשר בתורם מייצרים תפוקה כללית גבוהה יותר של תאים המטופויטיים. באר אחת של 70-80% iPSCs מתמזגים מניבה כ 8.4 x 105 תאים לכל באר של צלחת 6 באר. דרושים 12,500 תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים חד-תאיים כדי ליצור גוף עוברי אחד.</li>
	<li>שאפו את המדיום המושקע מתרביות iPSC ושטפו את מושבות iPSC עם D-PBS.</li>
	<li>הוסיפו 0.5 מ"ל של מגיב דיסוציאציה חד-תאי שחומם מראש לטמפרטורת החדר לכל באר של צלחת בעלת 6 בארות וערבלו את כלי התרבית כך שיצפו את כל משטח הבאר. לדגור על כלי התרבית ב 37 ° C במשך 5-8 דקות.</li>
	<li>הסר את כלי הדם מהאינקובטור, שאף מגיב דיסוציאציה של תא בודד, והוסף 1 מ"ל של מדיום התמיינות שלב 1 לבארות, המורכב מתווך נטול סרום hiPSC עם 50 ng/mL חלבון מורפוגנטי של עצם אנושית 4 (hBMP4), 50 ng/mL גורם גדילה אנדותל כלי דם אנושי-165 (hVEGF), 20 ng/mL גורם תאי גזע אנושיים (hSCF), ו-10 מיקרומטר Y-27632.</li>
	<li>נתקו תאים בעדינות על ידי שטיפת הבאר בתווך שלב 1. בריכה iPSCs מנותקים לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל.</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של מדיום התמיינות שלב 1 לבארות ושטוף את כל התאים שנותרו או השתמש במגרד תאים עבור מושבות שאינן נשטפות בקלות.</li>
	<li>לאחר העברת כל התאים לצינור, צנטריפוגה ב 200 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי ליצור גלולה התא. שאפו והשעו מחדש את התאים בסך הכל 2 מ"ל של מדיום התמיינות שלב 1 משוקל מראש באמצעות פיפטה סרולוגית של 5 מ"ל או P1000 עם קצה משעמם רחב.</li>
	<li>ספירת תאים באמצעות המוציטומטר או מכשיר ספירת תאים אוטומטי. הוסף את התווך לצינור 15 מ"ל המכיל את תרחיף התא הבודד כדי לצלחת 12,500 תאים לכל באר בתחתית עגולה בעלת חיבור נמוך במיוחד 96 בארות צלחת ב -100 מיקרוליטר של מדיום ההתמיינות שלב 1. הערה: תחת המיקרוסקופ, תאים יופיעו כתרחיף חד-תאי עם תאים המפוזרים ברחבי הבאר.</li>
	<li>צנטריפוגה את לוחות 96 בארות במשך 3 דקות ב 100 x גרם. לאחר הצנטריפוגה, התאים צריכים להתחיל להידמות לספרואידים כאשר מסתכלים עליהם מתחת למיקרוסקופ. מניחים את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.</li>
	<li>שנה מחצית מהמדיום ביום 1 וביום 2 עם מדיום הבידול שלב 1. כדי לשפר את היעילות, השתמש פיפטה רב ערוצית כדי להיפטר 50 μL של מדיום התמיינות שלב 1 משומש לתוך צלחת פטרי.</li>
	<li>לאחר השלכת המדיום מלוח 96 הקידוחים, בדוק אם יש EBs תחת המיקרוסקופ הסטריאוסקופי שאולי הוסר בטעות. העבר EBs שהוסרו בטעות לצלחת 96 באר באמצעות פיפטה P1000 עם קצוות נשא רחבים.</li>
	<li>הוסף 50 μL של מדיום בידול טרי שלב 1 לכל באר של צלחת חיבור 96 באר תחתית עגולה נמוכה במיוחד באמצעות פיפטה רב ערוצית.</li>
</ol>5. הבחנה hematopoietic
<ol><li>יום אחד לפני תחילת התמיינות hematopoietic, לצפות באר של צלחת 6 בארות עם 1 מ"ל של תמצית קרום הבסיס בריכוז של 200-300 מיקרוגרם / מ"ל. מניחים את צלחת הבאר על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. הערה: כל באר תקבל 8 EBs בנקודה מאוחרת יותר של פרוטוקול זה. בהתאם למספר EBs מוכנים, בארות מעיל בהתאם.</li>
	<li>שאפו את עודפי תמצית הממברנה הבסיסית ומלאו מראש בארות של צלחת 6 בארות עם 3 מ"ל של מדיום התמיינות שלב 2, המורכב מתווך בסיסי hematopoietic אליו 2 mM Ultraglutamine, 55 μM 2-mercaptoethanol, 25 ng/mL אנושי interleukin 3 (hIL-3), ו 100 ng/mL אנושי מקרופאג מושבה גורם מגרה (hM-CSF) אנושי.</li>
	<li>בעזרת P1000 עם קצוות רחבים, העבירו 8 EBs לכל באר של צלחת 6 הקידוחים. לאחר ההעברה, יש לאשר בעין או מתחת לסטריאומיקרוסקופ כי 8 EBs נמצאים בכל באר. הערה: לאחר יום אחד, ה- EBs הצפים ייצמדו לקרקעית הבאר. במהלך 5-7 הימים הבאים, אוכלוסיית תאים צפים המורכבת מתאים המטופויטיים אמורה להיות גלויה. תקופת התמיינות hematopoietic יכול להיות מגוון, החל מ 7 ימים. הבחנה במשך 10 ימים הראתה אוכלוסייה hematopoietic המורכבת מתת-אוכלוסיות גדולות CD45+, CD14+ ו- CD11b+ .</li>
	<li>לאחר 5 ימים של טיפול עם מדיום התמיינות שלב 2, בצע שינוי בינוני על ידי הסרת המדיום בילה וניפוקו לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל. פיפטה לאט כדי לנסות להסיר כמה שפחות תאים צפים ולשמור על לחץ הגזירה נמוך ככל האפשר. פיפטינג מתחת לסטריאומיקרוסקופ יכול לסייע במניעת הסרה בשוגג של תאים.</li>
	<li>מיד להוסיף 1 מ"ל של מדיום דיפרנציאציה שלב 2 טרי לבארות. על מנת לשחזר כל תאים hematopoietic צף כי עשוי להיות כבר נוכח בשלב זה בתהליך ההתמיינות, לא להשליך את המדיום שניתן. במקום זאת, סובבו את הצינור עם המדיום המשומש ב 300 x גרם במשך 5 דקות, ושאפו את supernatant.</li>
	<li>הוסף תווך התמיינות טרי שלב 2 לצינור והשהה מחדש על מנת לנתק תאים שאולי הועברו עם התווך המשומש.</li>
	<li>הוסף 2 מ"ל של מדיום ההתמיינות הטרי שלב 2 עם התאים המשוחזרים לכל באר, שהיה מלא בעבר ב -1 מ"ל של מדיום ההתמיינות שלב 2.</li>
	<li>ביום 10 של התמיינות hematopoietic, לבדוק נוכחות של מספר גדול של תאים hematopoietic צפים. קציר על ידי איסוף אותם בצינור 50 מ"ל. ניתן להקפיא אותם בחזרה ב-10% DMSO, 50% FBS ו-40% בינוני או להשתמש בהם באופן מיידי כדי להתמיין ל-OCs.</li>
</ol>6. התבגרות M-CSF ובידול OC
<ol><li>תאי זרע בריכוז של 200,000 תאים לסמ"ק2 על תרבית רקמה מטופלים היטב בצלחות ומטפלים באלפא-MEM, בתוספת 10% FBS ו-50 ננוגרם/מ"ל hM-CSF.</li>
	<li>כדי לבצע בדיקות פונקציונליות או הדמיה, נתק את התאים הבשלים M-CSF 3 ימים לאחר הזריעה על ידי שטיפה עם PBS שחומם מראש ל 37 ° C באמצעות P1000 עם קצה בור רחב. ייתכן שיהיה צורך בשלבי שטיפה חוזרים ונשנים כדי לנתק תאים באופן מלא.</li>
	<li>מעבירים את התאים המנותקים לצינור של 15 מ"ל באמצעות P1000 עם קצה בור רחב וצנטריפוגה במהירות של 300 x גרם למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט.</li>
	<li>השהה מחדש והמיס את גלולת התא עם מדיום התמיינות OC, המורכב מאלפא-MEM בתוספת 10% FBS, 50 ng/mL hM-CSF ו-80 ng/mL hRANKL. לספור את התאים באמצעות המוציטומטר או מכשיר ספירת תאים אוטומטי ולזרוע מחדש תאים שהבשילו M-CSF בצפיפות של 200,00-250,000 תאים לסמ"ק2 בכלי תרבית מתאים לבדיקות פונקציונליות או הדמיה (כלומר, בדיקות ספיגת עצם, שקופיות כיסוי להדמיה, וכו ').</li>
	<li>להבדיל עם מדיום התמיינות OC במשך 7-9 ימים. בצע שינוי בינוני מלא היטב עם מדיום התמיינות OC טרי כל 2-3 ימים. הערה: OCs מרובי גרעינים מופיעים בדרך כלל לאחר 5-7 ימים.</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.

פרוטוקול זה מציע שיטה אמינה וחזקה להבדיל iPSCs ל- OCs. עם זאת, ישנם מספר מלכודות שניתן להיתקל בהן לאורך תהליך הבידול. קווי iPSC אנושיים שנוצרו מתאים ממקורות רקמה שונים התמינו בהצלחה באמצעות פרוטוקולזה 33. בעת הקפאת iPSCs בחזרה (ראה שלב פרוטוקול "3. הקפאת iPSCs לאחור"), באר אחת בנקודת המעבר הוקפאה בחזרה לקריביאל אחד. בעת הפשרה (ראה שלב פרוטוקול "1. הפשרה והתפשטות של iPSCs אנושיים"), קריוביאל אחד הופשר לתוך באר אחת של צלחת 6 בארות. קווי iPSC שונים יתנהגו מעט אחרת, ושיעורי ההתפשטות ישתנו. יהיה צורך להתאים את קצב הפיצול בהתאם.
בעת העברת iPSCs או ניתוק iPSCs לתרחיף חד-תאי עבור השראת EB, חשוב להסיר מושבות או אגרגטים של תאים מתים שהתמיינו באופן ספונטני כדי לשפר את היעילות והיעילות של התמיינות מזודרמלית והמטופויאטית. ניתן לעשות זאת תחת סטריאומיקרוסקופ באמצעות מגרד תאים, קצוות פיפטה מפיפטה P10 או P20, או כלי גירוד הבנוי מפיפטהפסטר 35.
כפי שהוזכר לעיל, פרוטוקול זה כרוך בדיסוציאציה של מושבות iPSC לתרחיף חד-תאי עבור אינדוקציה EB, בעוד שבפרוטוקולים אחרים, iPSCs נותרים כאגרגטים לצנטריפוגה עבור אינדוקציהEB 36. גודל EB, מספר תאים, צורה ומורפולוגיה דווחו כולם כמשפיעים על התמיינות 37,38,39. לפיכך, אנו משערים כי הדיסוציאציה לתרחיף חד-תאי מאפשרת אחידות EB-to-EB טובה יותר בגודל ובצורה לאחר צנטריפוגה, ומכאן, תוצאות עקביות יותר של ייצור תאים המטופויטיים31.
תוארו שיטות אחרות להשראת EB. שיטות כאלה המשתמשות בתרחיף חד-תאי בשילוב עם מעכב ROCK כדי לשפר את הישרדות התא דווחו כמועילות בשליטה על גודל EB ותוצאת התמיינות31.
שיטת השראת EB בעלת 96 בארות תחתית עגולה המתוארת בפרוטוקול זה מתאימה לייצור בקנה מידה גדול של EBs ומאפשרת שדרוג של ייצור OC. שיטות חדשניות יותר להתמיינות המטופויטית ללא שלב השראת גוף עוברי עם פוטנציאל להקל על תהליך ההתמיינותתוארו לאחרונה 32. עם זאת, פרוטוקולים אלה טרם נקבעו עבור הבחנה OC33.
בפרוטוקול הנ"ל, אנו מתארים את השינוי הבינוני ביום 5 של התמיינות המטופויטית. מספר קטן של תאים צפים עשוי להופיע כבר סביב יום 4-5 להתמיינות. על מנת להימנע מהשלכת תאים צפים, יש לאסוף את התווך בצינור ולצנטריפוגה לפני השלכתו. לאחר מכן יש לעקור את גלולת התא בתחתית הצינור עם המדיום הטרי ולהעביר אותה חזרה לבארות של צלחת בת 6 בארות. עם זאת, עדיין יש לקבוע את המשמעות של אוכלוסיית התאים הצפים המוקדמת בהתמיינות OC.
הייצור של תאים hematopoietic ניתן להעריך באמצעות cytometry זרימה. תפוקות גבוהות של תאי CD45+, CD14+ ו- CD11b+ רצויות להתמיינות אוסטאוקלסטים33. שימור בהקפאה של תאים המטופויטיים צפים שנקטפו דווח כמאתגר עם שיעורי התאוששות מוגבלים בדרך כלל ויכולת קיום נמוכהשל תאים 40,41. על ידי שימור קריופויאטי של תאים המטופויטיים במדיום שימור קריוגני המורכב מ-50% ממדיום התפשטות תאים המטופויטיים ללא נסיוב (ראו טבלת חומרים), 40% FBS ו-10% DMSO, הצלחנו לשחזר תאים עם כ-90.3% כ-90.3% ±-2.62 SD (n = 7) לאחר ההפשרה.
אוסטאוקלסטוגנזה דורשת איחוי של מבשרי OC חד-גרעיניים מרובים כדי ליצור אוסטאוקלסטים מרובי גרעינים המסוגלים לספיגת מינרלים ועצמות. בעוד שקווי תאים מבשרי OC פשוט זקוקים לתוספת של RANKL כדי לגרום להיווצרות OC42, מבשרי אדם דורשים M-CSF נוסף להישרדות תאיםוהתפשטות 43. OSCAR התגלה לאחרונה כקולטן נוסף המעורב בהתמיינות OC, למרות שרק קולגן מסוג I זוהה עד כה כליגנד. בעוד המחקר של OSCAR עם OCs הנגזרים מ- iPSC עדיין מוגבל, נראה כי ריכוזים על-פיזיולוגיים במבחנה RANKL ו- M-CSF בקו תאי מורין עוקפים את הצורך בהפעלת OSCAR44, הפעלה של OSCAR in vivo נראית כאות קוסטימולטורי הכרחי עבור אוסטאוקלסטוגנזה45. גורם נוסף שיש לקחת בחשבון הוא משטח צלחת הבאר. תכונות כימיות46 ופיזיקליות47 ידועות כמשפיעות על התמיינות אוסטאוקלסטים ויכולות לקדם או לעכב התמיינות מוצלחת. הטרוגניות מסוימת באוכלוסיית המבשרים נראית גם קריטית לאיחוי מוצלח של OCs, שכן גורמים שונים הקשורים להיתוך כגון CD47 ו- DC-STAMP פועלים בשלבים שונים של היתוך אוסטאוקלסטים48.
לסיכום, פרוטוקול זה מאפשר להבדיל בין OC אנושי לבין iPSCs כדי להקל ולהאיץ את מחקר ההמהרה (OC).

אוסטאוקלסטים (OCs) הם סוגי תאים רב-תכליתיים 1,2 שמקורם בהמטופויאטיים, הנמצאים בשימוש נפוץ על ידי חוקרים בתחומים כגון חקר מחלות עצם 3,4, חקר הסרטן 5,6, הנדסת רקמות 7,8 ומחקר אנדופרוטזה 9,10. אף על פי כן, התמיינות OC יכולה להיות מאתגרת מכיוון שמיזוג של מבשרי מונו-גרעיניים לתוך OCs מרובי גרעינים הוא הכרחי כדי ליצור OCs11 פונקציונליים. מספר גורמים ביולוגיים, כגון מפעיל קולטן של ליגנד NF-κB (RANKL) וגורם מגרה מושבת מקרופאגים (M-CSF), נחוצים להתמיינות OC. M-CSF דווח כבעל השפעה חיובית על התפשטות תאים, הישרדות תאים וביטוי RANK 12,13,14. מצד שני, RANKL נקשר ל- RANK, אשר מפעיל מפל איתות במורד הזרם המשרה אוסטאוקלסטוגנזה. ההפעלה מתווכת באמצעות גורם 6 הקשור לקולטן TNF (TRAF6), המוביל לפירוק הגורם הגרעיני של משפר הגן פוליפפטיד קל קאפה במעכב תאי B, אלפא (IκB-α), חלבון קושר הקושר דימרים NF-kB16,17. לפיכך, התפרקות IκB-α משחררת דימרים NF-kB, אשר לאחר מכן עוברים טרנסלוקציה לתוך הגרעין וגורמים לביטוי של גורמי השעתוק c-Fos וגורם גרעיני של תאי T מופעלים 1 (NFATc1). זה, בתורו, מפעיל את השעתוק של מספר רב של חלבונים הקשורים התמיינות OC15,18. חלבונים מווסתים כגון DC-Stamp ו-Atp6v0d2 מתווכים איחוי תאים-תאים של מבשרי OC, מה שמוביל להיווצרות סינקיטיום 19,20,21.
ביחס לתאים ראשוניים אנושיים, CD34+ ו- CD14+ PBMCs הם כיום סוגי התאים הנפוצים ביותר להתמיינות לOCs22. עם זאת, גישה זו מוגבלת על ידי ההטרוגניות באוכלוסיית CD34+ של תאים שנקטפו מתורמים23 ויכולת ההרחבה המוגבלת שלהם. תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים מהווים מקור חלופי לOCs. מכיוון שניתן להפיץ אותם ללא הגבלת זמן24, הם מאפשרים הרחבה ושדרוג של ייצור OC. זה מאפשר הבחנה של מספר גדול של OCs, אשר מאפשר מחקר OC.
מספר פרוטוקולים להבחנה של iPSCs ל- OCs פורסמו 25,26,27. ניתן לחלק את כל תהליך ההתמיינות לחלק התפשטות iPSC, חלק התמיינות מזודרמלי והמטופויאטי, והתמיינות OC. התפשטות של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים לפני תהליך הבידול מאפשרת שדרוג של ייצור המהרה לפני הבידול. קיימות מספר גישות לגבי התמיינות מזודרמלית והמטופויאטית. באופן מסורתי, היווצרות גוף עוברי (EB) שימשה כדי להתמיין תאים hematopoietic, אבל גישות מבוססות monolayer מייצגים אסטרטגיית התמיינות hematopoietic אחרת שאינה דורשת השראת EB. עם זאת, נראה כי מערכות מבוססות מונו-שכבות דורשות אופטימיזציה נוספת, מכיוון שאנו ואחרים מצאנו שגישות מבוססות EB עמידות יותר לבידול של OCs.
במאמר זה אנו מתארים את ההבחנה בין OCs לבין תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים באמצעות פרוטוקול מבוסס EB. פרוטוקול זה הותאם מ- Rössler et al.26 והותאם כדי להגביר את החוסן ולאפשר שימור בהקפאה במהלך תהליך הבידול. ראשית, קצרנו תאים המטופויטיים רק פעם אחת לאחר 10 ימים של התמיינות. תאים המטופויטיים נשמרו אז בהקפאה כדי לאפשר גמישות רבה יותר בתהליך ההתמיינות. בנוסף, הגדלנו את צפיפות זריעת התאים ההמטופויטיים מ-1 x 105 ל-2 x 105 תאים לסמ"ר2 לצורך התמיינות OC. נעשה שימוש בתווך חדש יותר ללא סרום iPSC אנושי (hiPSC-SFM, ראו טבלת חומרים), וציפוי בארות בוצע עם 200-300 מיקרוגרם/מ"ל של תמצית קרום בסיסי (ראו טבלת חומרים) במקום 0.1% ג'לטין. פניצילין/סטרפטומיצין לא נוסף לתקשורת.
הפרוטוקול של Rössler et al.26 הותאם במקור מ-iPSC לפרוטוקול התמיינות מקרופאגים28 המשתמש בהיווצרות EB להתמיינות המטופויטית. בעוד היווצרות EB שימשה במשך זמן ממושך על ידי חוקרים עבור התמיינות hematopoietic29,30, מספר שיטות של אינדוקציה EB תוארו בספרות, כגון צבירה ספונטנית, צנטריפוגה בצלחת באר עגולה תחתית, תרבית טיפה תלויה, תרבית ביוריאקטורים, תרבית צינור חרוט, כלי לרוחב מסתובב לאט, ותרבית ג'ל micromold31. פרוטוקול זה משתמש בצנטריפוגה של iPSCs מנותקים בלוח באר עגול למטה כדי להביא תאי iPSC בודדים לקרבה זה לזה ולאפשר היווצרות כדור (EB), כמתואר להלן.

<table><tbody><tr><td>2-מרקפטואתנול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>M6250-10ML</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן - אנטי קטפסין K&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab19027</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן - נוגדן אנטי אנושי מצומד APC CD45</td><td>BD</td><td>555485</td><td></td></tr><tr><td>- עכבר מצומד APC IgG1, &kappa; בקרת איזוטיפ</td><td>BD</td><td>555751</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן - BV711 מצומד אנטי אנושי CD14</td><td>BD</td><td>563372</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן - BV711 מצומד עכבר IgG2b, &kappa; בקרת איזוטיפ</td><td>BD</td><td>563125</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן - עז אנטי ארנב IgG H& L Alexa Fluor&reg; 647</td><td>Abcam</td><td>ab150079</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן - מצומד PE אנטי אנושי CD14</td><td>R& D Systems</td><td>FAB3832P-025</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן - אינטגרין אנטי-אנושי מצומד PE alpha M/CD11b</td><td>R& D Systems</td><td>FAB16991P-025</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן - נוגדן מצומד PE-Cy7 אנטי אנושי CD34</td><td>BD</td><td>560710</td><td></td></tr><tr><td>- עכבר מצומד PE-Cy7 IgG1 ו-kappa; בקרת איזוטיפ</td><td>BD</td><td>557872</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן - נוגדן מצומד PE/Cyanine5 אנטי-אנושי CD11b</td><td>Biolegend</td><td>301308</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן - עכבר מצומד PE/ציאנין 5 IgG1, &kappa; איזוטיפ Ctrl</td><td>Biolegend</td><td>400118</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן - עכבר מצומד PerCP-Cy5.5 IgG1 ו-kappa; בקרת איזוטיפ</td><td>BD</td><td>550795</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן - PerCpCy5.5 מצומד אנטי אנושי CD43</td><td>BD</td><td>563521</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בדיקת ספיגת עצם</td><td>CosmoBioUSA</td><td>CSR-BRA-24KIT</td><td></td></tr><tr><td>Countess 3 מונה תאים אוטומטי</td><td>ThermoFisher</td><td>16812556</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex תאי גזע מוסמכים גורם גדילה מופחת תמצית קרום מרתף</td><td>R& D Sytems</td><td>3434-010-02</td><td>תמצית קרום בסיס</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>R& D Systems</td><td>5748/10</td><td></td></tr><tr><td>Dispase (5 U/mL)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7913</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 עם 15 מ"מ HEPES</td><td>תאי גזע</td><td>36254</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>חלבון מורפוגנטי של עצם אנושית 4 (hBMP4)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78211</td><td></td></tr><tr><td>טכנולוגיות תאי גזע</td> <td>אנושיים IL-3</td><td>78146.1</td><td></td></tr><tr><td>גורם מגרה מושבת מקרופאגים אנושיים (hM-CSF)</td><td>טכנולוגיות תאי גזע</td><td>78150.1</td><td></td></tr><tr><td>מפעיל קולטן מסיס אנושי של גורם גרעיני-וקאפה; B Ligand (hsRANKL)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78214.1</td><td></td></tr><tr><td>גורם תאי גזע אנושיים (hSCF)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78155.1</td><td></td></tr><tr><td>Human TruStain FcX (תמיסת חסימת קולטן Fc)</td><td>Biolegend</td><td>422301</td><td></td></tr><tr><td>גורם גדילה אנדותל כלי דם אנושי-165 (hVEGF165)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78073</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Rhodamine Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>MEM &alpha;, נוקלאוזידים, ללא פנול אדום</td><td>ThermoFisher</td><td>41061029</td><td></td></tr><tr><td>mFreSR</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>05855</td><td>מדיום שימור בהקפאה ללא סרום</td></tr><tr><td>mTeSR Plus בינוני</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>100-0276</td><td>מדיום אנושי ללא iPSC-סרום (hiPSC-SFM)</td></tr> <tr><td>Nunclon Sphera 96-Well, Nunclon Sphera מטופל, בצורת U-Bottom Microplate</td><td>Thermo Scientific</td><td>174925</td><td>חיבור תחתון עגול נמוך במיוחד צלחת 96 בארות</td></tr><tr><td>P1000 קצות קדח רחב</td><td>ThermoFisher</td><td>2079GPK</td><td></td></tr><tr><td>מעכב רוק Y-27632</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72304</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM</td><td>StemCell</td><td>09650</td><td>מדיום תרבית תאים המטופויאטית</td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzyme (1X), ללא פנול אדום</td><td>תרמו פישר</td><td>12563011</td><td>מגיב דיסוציאציה של תא יחיד</td></tr><tr><td>Ultraglutamine</td><td>Bioscience Lonza</td><td>BE17-605E/U1</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 ללא סרום תאים המטופויאטיים בינוני</td><td>Bioscience Lonza</td><td>04-418Q</td><td>מדיום בסיסי המטופויאטי</td></tr> <tr><td>ומיקרו;-שקופית 8 טוב גבוה</td><td>Ibidi</td><td>80806</td><td></td></tr></tbody></table>

התמיינות ואפיון אוסטאוקלסטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

Differentiation and Characterization of Osteoclasts from Human Induced Pluripotent Stem Cells

פרוטוקול זה מפרט את ההתפשטות וההעברה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים ואת התמיינותם לאוסטאוקלסטים. ראשית, תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים מנותקים לתרחיף חד-תאי לשימוש נוסף בהשראת גוף עוברי. לאחר השראת מזודרמיס, גופים עובריים עוברים התמיינות המטופויטית, ומייצרים אוכלוסיית תאים המטופויטיים צפה. לאחר מכן, התאים ההמטופויטיים שנקטפו עוברים שלב הבשלה של גורם מגרה מושבת מקרופאגים, ולבסוף התמיינות אוסטאוקלסט. לאחר התמיינות אוסטאוקלסט, אוסטאוקלסטים מאופיינים על ידי צביעה עבור TRAP בשילוב עם כתם גרעיני ירוק מתיל. אוסטאוקלסטים נצפים כפוליקריוני TRAP+ מרובי גרעינים. זיהויים יכול להיות נתמך עוד יותר על ידי צביעת Cathepsin K. בדיקות ספיגת עצם ומינרלים מאפשרות אפיון פונקציונלי, המאשר את זהותם של אוסטאוקלסטים בתום לב. פרוטוקול זה מדגים שיטה חזקה ורב-תכליתית להבדיל אוסטאוקלסטים אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים ומאפשר אימוץ קל ביישומים הדורשים כמויות גדולות של אוסטאוקלסטים אנושיים פונקציונליים. ניתן לחזות יישומים בתחומי חקר העצם, חקר הסרטן, הנדסת רקמות ומחקר אנדופרוטזה.

ניטור מורפולוגיה של התא לאורך תהליך ההתמיינות כל התוצאות המתוארות להלן נוצרו באמצעות קו MCND-TENS2 iPSC עבור התמיינות OC. קו iPSC זה שימש בעבר במספר מחקרים32,33. עם זאת, קווי iPSC אחרים שימשו בהצלחה גם עם פרוטוקול בידול זה.
הערכה חזותית סדירה מגלה מאפיינים מורפולוגיים שונים ומובחנים של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים לאורך תהליך ההתמיינות ל-OCs (איור 2). מושבות iPSC (איור 2A) נותקו לתרחיף חד-תאי, שמופיע כתאים בודדים לאורך לוח הבאר התחתון העגול לפני הצנטריפוגה (איור 2B). לאחר הצנטריפוגה (שלב 4.9 בפרוטוקול), תאים יאספו במרכז פלטת באר החיבור התחתונה העגולה והנמוכה במיוחד, ולאחר מכן ייצרו כדורים (גופים עובריים, EBs, איור 2C). EBs יגדלו פי שניים עד שלושה במהלך תהליך ההתמיינות המזודרמלית (איור 2D) ויהיו גלויים לעין בקלות בסוף תקופת ההתמיינות בת 4 הימים (איור 2E). ניתן לראות EBs נצמדים ומתמזגים עם תחתית צלחת הבאר לאחר ההעברה לבארות של צלחת בעלת 6 בארות לצורך התמיינות המטופויטית (שלב 5.3 בפרוטוקול, איור 2F). לאחר 7-8 ימים, כמויות גדולות של תאים המטופויטיים צפים נראות בתווך התרבית (איור 2G). לאחר קציר וציפוי מחדש של תאים המטופויאטיים, מגיע שלב ההבשלה של M-CSF, ומתחילה התמיינות OC (שלב 6.4 בפרוטוקול). בתוך 5-6 ימים, תאים מרובי גרעינים עם גוף תא גדול ושקוף נראים לראשונה (איור 2H). מספר רב של תאים חד-גרעיניים עדיין נראים בשלב זה. לאחר 2-3 ימים נוספים של התמיינות OC, OCs יתמזגו עוד יותר עם תאים סמוכים כדי ליצור פוליקריונים גדולים עם גרעינים רבים עוד יותר (איור 2I).
הערכת האוכלוסייה ההמטופויטית שמקורה ב- EB התמיינות המטופויטית יכולה להתבצע למשך זמן משתנה. תקופות זמן המתחילות ב-7 ימים ועד 9 שבועות תוארו בספרות. בפרוטוקול זה, התמיינות hematopoietic מבוצעת לתקופה של 10 ימים. מצאנו ש-10 ימים של התמיינות המטופויטית הניבו מספרים נמוכים של CD34+ מוקדם (0.53%, איור 3A) ומספר גדול יותר של אבות המטופויטיים בשלב הבינוני CD43+ (48.5%, איור 3B). באופן קריטי יותר, כמויות מספיקות של CD45+ (96.2%, איור 3C), CD14+ (33%, איור 3D) ו-CD11b+ (35.9%, איור 3E) HPCs נוצרו לאחר תקופת טיפול של 10 ימים כדי להבדיל אותם בהצלחה לOCs. עם זאת, ייתכן שיהיה צורך להתאים ולמטב את תקופת הטיפול בציטוקינים עבור התמיינות המטופויטית (שלב 5.4 בפרוטוקול) בהתבסס על קו iPSC כדי לייצר כמויות נאותות של תאי CD45+, CD14+ ו- CD11b+ .
בממוצע, 6 מיליון תאים hematopoietic נקצרו לאחר 10 ימים של התמיינות מכל באר עם 8 EBs.
הערכת מורפולוגיה ופעילות OC לאחר התמיינות OC, OCs ניתן להעריך מורפולוגית ותפקודית. מבשרי OC נזרעים מחדש על שקופיות תא או שקופיות כיסוי לאחר שלב ההבשלה M-CSF כדי לשפר את איכות התמונה בעת צביעה עבור TRAP או Cathepsin K. צביעת TRAP אנזימטית לאחר התמיינות OC מראה OCs גדולים, מרובי גרעינים וחיוביים ל- TRAP (איור 4A). בנוסף, ניתן לראות תאים חד-גרעיניים מעט חיוביים ל-TRAP המשולבים בין OCs רב-גרעיניים. פקדים שליליים ללא תוספת של RANKL אינם מציגים OC רב-גרעיני מאוחה. אף על פי כן, ניתן לתאר מספר קטן של תאים חד-גרעיניים מעט חיוביים ל-TRAP (איור 4B).
תמונות של מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (CLSM) מראות OCs מוכתמים עבור Cathepsin K (טורקיז) ו-F-actin (אדום) בשילוב עם כתם גרעיני DAPI (כחול) (איור 4C, 4D). OCs רב-גרעיניים גדולים נראים לעין כאשר מטופלים ב-RANKL בהתאם לפרוטוקול, אשר מתאר מבנה ציטו-שלד נרחב של F-actin וכתם חיובי עבור Cathepsin K (איור 4C). בקרות שליליות ללא תוספת של RANKL, לעומת זאת, אינן מראות תאים רב-גרעיניים מאוחים.
OCs ניתן להעריך עוד יותר מבחינה תפקודית על ידי מדידת פעילות resorptive . ניתן להשתמש בבדיקות ספיגת עצם או מינרלים כדי לקבוע את פעילות הספיגה. כאן, מבשרי OC נזרעו על בארות מצופות סידן פוספט והובחנו סופנית. אזורים גדולים שבהם נספג מחדש ציפוי המינרלים נראים בצבע אפור-כחלחל (איור 4E). ניתן לזהות בורות ספיגה בגדלים שונים. ציפוי הסידן פוספט הנותר אינו מחודש, נראה בצבע חום. נוכחותם של בורות ספיגה מאשרת את זהותם של התאים מרובי הגרעינים המובחנים כ-OCs. בנוסף, ניתן לכמת בורות ספיגה נוספים על מנת להעריך ולהשוות את פעילות הספיגה. ניתן לכמת את השטח הכולל של מינרל נספג על פני שטח הפנים הכולל של הבאר כמדד אחוזים. בנוסף, ניתן לכמת עוד יותר את גודל ומספר בורות הספיגה שלהם. בקרות שליליות שלא טופלו לא הציגו בורות ספיגה (איור 4F).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66527/66527fig01.jpg"> איור 1: המחשה סכמטית של תהליך התמיינות אוסטאוקלסטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים. איור שצויר על ידי חנה בלומקה באמצעות Affinity Designer 2.1.1. האיור משתמש בציורים שהיו בשימוש בעבר33. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66527/66527fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66527/66527fig02.jpg"> איור 2: תמונות מיקרוסקופיות לאורך תהליך ההתמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים כלפי אוסטאוקלסטים. (A) מושבות iPSC בלתי מובחנות במהלך ההתפשטות. (B) תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים בבארות תחתונות עגולות לאחר דיסוציאציה לתרחיף של תא בודד לפני הצנטריפוגה. (C) תאי גזע מושרים חד-תאיים שנאספו באופן מרכזי בעקבות צנטריפוגה. (D) EBs גדלים בגודלם לאורך תקופת התמיינות מזודרמלית בת 4 ימים. (E) גופים עובריים גלויים לעין לאחר התמיינות מזודרמלית. (F) לאחר העברת גופים עובריים ללוחות 6 בארות מצופות בתמצית קרום בסיסי, ניתן לראות גופים עובריים נצמדים ומתמזגים עם קרקעית הבאר. (G) לאחר 5-7 ימים של התמיינות המטופויטית, ניתן לראות בתווך מספר רב של תאים המטופויטיים צפים. (H) לאחר הבשלת M-CSF, האוסטאוקלסטים הראשונים עם 3-4 גרעינים מופיעים לאחר 5-7 ימים של התמיינות עם RANKL. (I) בסוף התמיינות אוסטאוקלסט ניתן להבחין בתאים גדולים מרובי גרעינים. פסי קנה מידה: A, D, F, G = 200 מיקרומטר, B, C, H, I = 50 מיקרומטר, E = 1 מ"מ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66527/66527fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66527/66527fig03.jpg"> איור 3: ניתוח סמנים על פני השטח של תאים המטופויטיים שמקורם בגוף עוברי באמצעות ציטומטריית זרימה. ביטוי סמן מאפשר ניתוח של תאים hematopoietic וזיהוי של תת-אוכלוסיות לאחר gating עבור סינגלים ותאים חיים. (A) אוכלוסיית תאי אב המטופויטיים מוקדמת אונטוגנטית CD34+ קטנה מאוד עד נעדרת בשילוב עם פרוטוקול זה. (B) תאי CD43+ מהווים כ-50% מכלל האוכלוסייה. (C) בשלב מאוחר יותר CD45+ תאי אב hematopoietic מהווים את החלק הגדול ביותר של האוכלוסייה hematopoietic עם 96.2%. (ד, ה) מבשרי OC ישירים יותר של CD14+ ו-CD11b+ מהווים 33% ו-36%, בהתאמה. באדום: בקרה שלילית לא מוכתמת, בכחול: פקדי איזוטיפ, בצהוב: תאים מוכתמים בנוגדן הסמן המתאים. מגרשים משתמשים בנתונים שפורסמו בעבר33. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66527/66527fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66527/66527fig04.jpg"> איור 4: הערכה מורפולוגית ותפקודית של אוסטאוקלסטים אנושיים בעלי התמיינות iPSC. (A) צביעת TRAP לאחר התמיינות אוסטאוקלסטים מראה אוסטאוקלסטים גדולים, מרובי גרעינים, חיוביים ל-TRAP. ניתן לראות תאים חד-גרעיניים חיוביים מעט TRAP המשולבים בין אוסטאוקלסטים רב-גרעיניים. (B) בקרות שליליות ללא תוספת של RANKL המוכתמות עבור TRAP אינן מציגות אוסטאוקלסטים רב-גרעיניים מאוחים. עם זאת, ניתן לתאר מספר קטן של תאים חד-גרעיניים חיוביים במקצת TRAP. (C) תמונות מיקרוסקופ סריקה בלייזר קונפוקלי של תאים המטופויטיים ממוינים אוסטאוקלסטים על שקופית כיסוי מוכתמת עבור F-actin (אדום) ו-Cathepsin K (טורקיז) בשילוב עם כתם גרעיני DAPI (כחול) מראות אוסטאוקלסטים חיוביים גדולים מרובי גרעינים של Cathepsin K. (D) בקרות שליליות ללא תוספת של RANKL מראות דומה ל-(B) תאים חד-גרעיניים בצפיפות תאים נמוכה יותר. (E) הערכה תפקודית יכולה להתבצע על ידי הערכת פעילות ספיגה של אוסטאוקלסטים. לשם כך, התמיינות אוסטאוקלסט מבוצעת על בדיקת ספיגת עצם או מינרלים. תמונות באר אריחים שנרכשו במיקרוסקופ שדה רחב הפוך במצב ניגודיות פאזה מתארות אזורי ספיגה גדולים של שכבת מינרל הסידן פוספט. ניתן לכמת עוד יותר את פעילות הספיגה על ידי מדידת אזור הספיגה על פני השטח הכולל. (F) בקרות שליליות ללא תוספת של RANKL אינן מציגות אזורי ספיגה מחדש. פסי קנה מידה: A, B = 100 מיקרומטר, C, D = 50 מיקרומטר, E, F = 1 מ"מ. התמונות נערכו מנתונים שפורסמו בעבר33. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66527/66527fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

פרוטוקול זה מציג את ההתמיינות של אוסטאוקלסטים אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) ומתאר שיטות לאפיון אוסטאוקלסטים ומבשרי אוסטאוקלסט.

This protocol details the propagation and passaging of human iPSCs and their differentiation into osteoclasts. First, iPSCs are dissociated into a ...

אוסטאוקלסטים הם סוג תא רב-גרעיני המשמש בדרך כלל חוקרים בתחומים כגון חקר מחלות עצם, חקר סרטן, הנדסת רקמות ומחקר אנדופרוטזה. עם זאת, התמיינות אוסטאוקלסטים יכולה להיות מאתגרת, שכן יש צורך באיחוי של קודמנים. בנוסף, הבחנה בין אוסטאוקלסטים אנושיים לבין IPSCs דורשת שימוש במגוון גורמים ביולוגיים בזמן הנכון.כשמדובר בתאים ראשוניים אנושיים. CD34+תאי דם חד-גרעיניים היקפיים הם כיום סוג התא הנפוץ ביותר להתמיינות לאוסטאוקלסטים. עם זאת, גישה זו מוגבלת על ידי ההטרוגניות בתוך אוכלוסיית CD34+ ויכולת ההתרחבות המוגבלת שלהם.IPSCs אנושיים מהווים מקור חלופי לאוסטאוקלסטים. מכיוון שניתן להפיץ אותם ללא הגבלת זמן, הם מאפשרים הרחבה ושדרוג של ייצור אוסטאוקלסט. זה מאפשר הבחנה של מספר גדול של אוסטאוקלסטים, מה שמקל על מחקר אוסטאוקלסט.כאן, הפוסט-דוקטורנט שלנו אלכסנדר בלומקה והדוקטורנטית ג'סיקה סיימון, מדגימים את ההבחנה בין אוסטאוקלסטים לבין IPSCs אנושיים. התחל להעביר IPSCs על ידי הסרת אזורים מובחנים או אזורים עם צברי IPSC מתים רבים מתחת לסטריאומיקרוסקופ באמצעות קצה פיפטה P-10 או P-20 או מגרד תאים. אזורים מובחנים ייראו צפופים יותר ובצבע לבן יותר.שטפו את התאים המנותקים עם מדיום ישן, ולאחר מכן שטפו את התאים המנותקים שנותרו עם PBS פעמיים. לאחר מכן, להוסיף מיליליטר אחד של חמש יחידות לכל מיליליטר dispase לכל באר לבאר. את שולי המושבות המתרוממות מהצלחת ניתן לראות תחת הסטריאומיקרוסקופ לאחר שלוש עד חמש דקות.בזהירות להסיר את dispase ולהוסיף מיליליטר אחד של DMEM/F-12 עם HEPES 15 מילימולרי. השתמש בכלי העברת תאי גזע או מרים תאים חד פעמי כדי לחתוך את האגרגטים לגודל קטן. העבר את המדיה עם אגרגטים לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר באמצעות פיפטה סרולוגית חמישה מיליליטר או P-1000 עם קצה רחב משעמם.שטפו את הבאר עם DMEM/F-12 והעבירו את המדיה לצינור ה-15 מיליליטר. צנטריפוגה את צברי IPSC פרוסים ב 200 G במשך שלוש דקות. הסר את הסופרנאטנט עם פיפטה מזכוכית פסטר והוסף שני מיליליטר של מדיום ללא סרום IPSC אנושי כדי לעקור ולהשהות מחדש את ה- IPSCs באמצעות פיפטה סרולוגית של חמישה מיליליטר או P-1000 עם קצוות רחבים.שאפו את שאריות תמצית קרום הבסיס מלוחות הבאר המצופים מראש, והוסיפו מיליליטר אחד של מדיום ללא סרום IPSC אנושי לכל באר של צלחת שש הקידוחים. העבר IPSCs לתוך בארות חדשות של צלחת שש בארות כך שהנפח הסופי יהיה שני מיליליטר של מדיום ללא סרום IPSC אנושי לכל באר באמצעות P-1000 עם קצוות רחבים. בהתאם לקו IPSC, יש למטב את יחסי הפיצול.כאן נעשה שימוש ביחס פיצול של 1:6. מערבלים את צלחת הבאר כדי לפזר את התאים באופן שווה על פני הצלחת לאחר העברת האגרגטים. השראת גוף עוברית.שאפו את המדיום הישן מתרבויות IPSC ושטפו את הבארות עם DPBS. מוסיפים חצי מיליליטר שחומם מראש לטמפרטורת החדר לכל באר של צלחת בת שש בארות ומערבלים את כלי התרבית כדי לצפות את כל משטח הבאר. לדגור על כלי התרבית ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש עד שמונה דקות.הסר את כלי הדם מהאינקובטור, שאף את התמיסה והוסף תווך שלב ראשון לבארות המורכב מ- 50 ננוגרם למיליליטר חלבון מורפוגני עצם אנושית 4, 50 ננוגרם למיליליטר גורם גדילה אנדותל כלי דם אנושי 165, 20 ננוגרם למיליליטר גורם תאי גזע אנושיים, ומעכב ROCK 10 מיקרומולרי Y-27632. נתקו תאים בעדינות על ידי שטיפת הבאר עם מדיום שלב ראשון. משוך תאים לתוך צינור חרוט.הוסף תווך שלב אחד חדש לבארות ונתק את כל התאים שנותרו באמצעות מגרד תאים. לאחר העברת כל התאים לצינור, צנטריפוגה ב 200 G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי להניע את התאים. שאפו והשעו מחדש את התאים בסך הכל שני מיליליטר בשלב אחד מאוזן מראש.ספירת תאים באמצעות המוציטומטר או מכשיר ספירת תאים אוטומטי זרע 12, 500 תאים לכל באר בצלחת עגולה בעלת חיבור נמוך במיוחד 96 בארות ב -100 מיקרוליטר של מדיום שלב ראשון. תחת המיקרוסקופ, תאים יופיעו באופן מפוזר לאורך כל התמיסה. צנטריפוגה את לוחות 96 בארות במשך שלוש דקות ב 100 G לאחר צנטריפוגה, התאים צריכים להתחיל להידמות ספרואידים כאשר מסתכלים תחת המיקרוסקופ.מניחים את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס. שנה חצי מהמדיום ביום הראשון וביום השני עם מדיה בשלב הראשון. השתמשו בפיפט רב-ערוצי כדי להשליך מדיום ישן לתוך צלחת פטרי.לאחר השלכת המדיה מלוח 96 הקידוחים, בדוק אם יש EBs שאולי הוסרו בטעות. העבירו את ה-EBs שהוסרו בטעות בצלחת הפטרי בחזרה באמצעות התמיינות המטופויטית פיפטה P-1000. מילוי מראש של צלחת שש בארות עם שלושה מיליליטר של שלב שני בינוני, אליו שני מילימולרי ultraglutamine, 55-micromolar בטא-mercaptoethanol, 25 ננוגרם למיליליטר, אינטרלוקין-3 אנושי, ו 100 ננוגרם למיליליטר מושבת מקרופאגים אנושיים גורם מגרה מושבה.באמצעות P-1000 וקצה רחב נושא, להעביר שמונה EBs לתוך כל באר של צלחת שש בארות. לאחר ההעברה, בדקו בעין מתחת למיקרוסקופ הסטריאו שיש שמונה EBs בכל באר. לאחר חמישה עד שבעה ימים, אוכלוסיית תאים צפה המורכבת מתאים המטופויטיים אמורה להיות גלויה.תקופת ההתמיינות ההמטופויטית יכולה להיות מגוונת, החל משבעה ימים. הבחנה במשך 10 ימים הראתה אוכלוסייה hematopoietic המורכבת CD45 + CD14 + ו CD11b + תת-אוכלוסיות. לאחר חמישה ימי טיפול במדיום שלב שני, בצע שינוי מדיום על ידי הסרה זהירה של המדיום הישן וניפוקו לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר.מיד להוסיף מיליליטר אחד של שלב חדש שני בינוני לבארות. על מנת להציל תאים המטופויטיים צפים שאולי כבר קיימים, סובבו את הצינור עם המדיום הישן ב 300 גרם במשך חמש דקות. הוסף תווך שלב שני חדש לצינור והשהה מחדש על מנת לנתק תאים שהיו עשויים להיות מועברים עם התווך הישן.הוסף שני מיליליטר של מדיום שלב שני חדש עם תאים שמורים לכל באר, שהיה מלא בעבר במיליליטר אחד של מדיום שלב שני. ביום ה-10 של התמיינות המטופויטית, תאים המטופויטיים צפים נקצרים על ידי איסופם לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר וניתן להקפיא אותם בחזרה באמצעות 10% DMSO, 50% FBS ו-40% בינוניים, או להשתמש בהם באופן מיידי כדי להמשיך ולהתמיין תאים לאוסטאוקלסטים. התבגרות M-CSF והתמיינות אוסטאוקלסט.תאי זרע ב 200, 000 תאים לסנטימטר בריבוע ולטפל במשך שלושה ימים עם אלפא MEM בתוספת 10% FBS ו 50 ננוגרם למיליליטר M-CSF. על מנת לבצע בדיקות פונקציונליות או הדמיה, נתק את התאים שהתבגרו MCSF על ידי שטיפה עם P-1000 עם קצה רחב משעמם. מעבירים תאים מנותקים עם מדיום ישן לתוך צינור ומסתובבים למטה ב 300 G במשך חמש דקות.השהה מחדש והמיס את גלולת התא עם אלפא MEM טרי בתוספת 10% FBS, 50 ננוגרם למיליליטר M-CSF ו-80 ננוגרם לליגנד RANK מיליליטר. זרעו מחדש תאים ב 200, 000 תאים לסנטימטר בריבוע להתמיין במשך שבעה עד תשעה ימים. אוסטאוקלסטים מרובי גרעינים מופיעים בדרך כלל בסביבות היום החמישי עד השביעי.תוצאות מייצגות. ניתן לנתח את הרכב אוכלוסיית התאים ההמטופויטיים שנוצרה באמצעות ציטומטריית זרימה. כאן, תאים hematopoietic להראות אוכלוסייה גדולה של CD45 + תאים מקדימים.אוכלוסיות תאים המבטאות את הסמנים המונוציטים CD14 ו- CD11b מהוות בדרך כלל שליש מכלל האוכלוסייה בהשוואה לבקרות איזוטיפ. ניתן לראות תחת המיקרוסקופ אוסטאוקלסטים ממוינים סופניים שמקורם ב-IPSC כתאים מרובי גרעינים חיוביים ל-TRAP. מיקרוסקופ קונפוקלי מראה צביעת תאים עבור קתפסין K.בדיקות פונקציונליות כגון בדיקות ספיגת עצם או מינרלים מאפשרות כימות נוסף של פעילות אוסטאוקלסט.כאן, בורות ספיגה נראים לעין לאחר הסרת אוסטאוקלסט בוגר עם 10% אקונומיקה לפני ההדמיה, בעוד שמבשרי אוסטאוקלסט M-CSF שטופלו ללא תוספת של ליגנד RANK אינם מראים בורות ספיגה. מסקנה. פרוטוקול זה מאפשר בידול חזק ואמין של אוסטאוקלסטים אנושיים ויכול לספק פתרון מדף למחלות עצם או מחלות הכרוכות בהסתיידות עודפת. אנו משתמשים באוסטאוקלסטים כדי להנדס אותם עוד יותר לתוך תאי ה-RANK שלנו המשתמשים בתחום איתות תוך-תאי שניתן להפעיל בשילוב עם גורם כימי לדימריזציה להפעלת אוסטאוקלסטים מבוקרת ובלתי תלויה באוסטאופרוטגרין.

differentiation-characterization-osteoclasts-from-human-induced

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

Osteoclasts הוא תא resorbing-עצם העיקרי בגוף. יכולת לבודד osteoclasts במספרים גדולים הביאה התקדמות משמעותית בהבנה של ביולוגיה האוסטאוקלסטים. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה לבידוד, טיפוח וכימות פעילות האוסטאוקלסטים במבחנה.

גזירה האוסטאוקלסטים מעכבר מח עצם

איתות חריץ הוא צורה של תקשורת סלולרית המסתמכת על מגע ישיר בין תאים. כדי לגרום כראוי לאיתות Notch במבחנה, יש להציג ליגנדים של Notch לתאים במצב משותק. פרוטוקול זה מתאר שיטות לגירוי חוץ גופי של איתות Notch במבשרי אוסטאוקלסטים של עכברים.

גירוי של מערכת איתות Notch עכבר osteoclast המבשר

אנו מציגים פרוטוקול ליצירת השושלת chondrogenic מן הדם ההיקפי האנושי (PB) באמצעות תאי גזע pluripotent המושרה (iPSCs) בשיטה ללא אינטגרציה, הכוללת גבריות הגוף (EB) היווצרות, הרחבת תאים fibroblastic, אינדוקציה chondrogenic.

הבדל Chondrocytes מ היקפי דם הנגזרות האדם תאים Pluripotent Pluripotent Induced

במאמר זה, נציג שיטות כדי לבודד, להבדיל תאי סטרומה מח עצם של תאי גזע hematopoietic עצמות ארוכות העכבר. שני פרוטוקולים שונים מוצגים מניב אוכלוסיות תאים שונים עבור הרחבת ובידול לתוך תאי העצם, adipocytes ו osteoclasts.

בידוד, תרבות, התמיינות של תאי סטרומה מח עצם ו אוסטאוקלסט אבות של עכברים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לדור של pluripotent המושרה בתאי גזע (iPSCs) מ תסמונת לי-פראומני, היא תורשתית (הסימולטור) החולה נגזר fibroblasts, הבידול של iPSCs באמצעות גזע mesenchymal (MSCs) תאי העצם, מידול vivo tumorigenesis באמצעות תאי העצם של החולה-derived הסימולטור.

מידול אוסטאוסרקומה באמצעות תאי גזע Pluripotent נגזר החולה המושרה תסמונת לי-פראומני, היא תורשתית

אוסטאופנוקיים הם מקרופאג polykaryons רקמות שמקורם השושלת המונציט מקרופאג של תאי גזע המטפאות. פרוטוקול זה מתאר כיצד לבודד את התאים מח עצם כך כמויות גדולות של אוסטאוקלמות מתקבלים תוך צמצום הסיכון של תאונות שנמצאו בשיטות מסורתיות.

בידוד, טיהור, והבידול של אוסטאוקלסט מקדים של מח עצם חולדה

אוסטאוקלסטים הם תאי מפתח סופחי עצם בגוף. פרוטוקול זה מתאר שיטה אמינה להבחנה חוץ גופית של אוסטאוקלסטים ממונוציטים של דם היקפי אנושי. שיטה זו יכולה לשמש ככלי חשוב להבנה נוספת של הביולוגיה של אוסטאוקלסטים בהומאוסטזיס ובמחלות.

הבחנה של אוסטאוקלסטים פונקציונליים ממונוציטים של דם היקפי אנושי CD14+

פרוטוקול זה מתאר ומשווה שתי שיטות מייצגות להבחנה של hiPSCs לתאי סטרומה מזנכימליים (MSCs). השיטה החד-שכבתית מאופיינת בעלות נמוכה יותר, תפעול פשוט יותר ובידול אוסטאוגני קל יותר. שיטת הגופים העובריים (EBs) מאופיינת בצריכת זמן נמוכה יותר.

השוואה בין שתי שיטות מייצגות להתמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם לתאי סטרומה מזנכימליים

כאן, אנו מתארים פרוטוקול חזק לגזירת קרדיומיוציטים אנושיים המשלב התמיינות לבבית מווסתת מולקולות קטנות וטיהור קרדיומיוציטים בתיווך חסך גלוקוז, המאפשר ייצור של קרדיומיוציטים מטוהרים למטרות מודלים של מחלות לב וכלי דם וסינון תרופות.

גזירה של שריר לב נקי במיוחד מתאי גזע האנושי המושרה pluripotent באמצעות בידול מאופנן מולקולה קטן ולאחר גלוקוז רעב

קוצים הדנדריטים של נוירונים פירמידה הם האתרים של רוב סינפסות המעוררות בקליפת המוח של יונקים. שיטה זו מתארת ​​ניתוח כמו 3D של מורפולוגיות עמוד השדרה בנוירונים glutamatergic הפירמידה אנושיים בקליפת המוח שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרה.

כימות תלת ממדיות של קוצים הדנדריטים מפירמידת נוירונים שמקורם בתאי גזע האנושי המושרה pluripotent

למד את הפרוטוקול להפקת אוסטאוקלסטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים של בני אדם (iPSCs) ואפיון תאים אלו. שיטה זו מספקת פתרון אמין למחקר מחלות עצם והנדסת רקמות.

התמיינות ואפיון אוסטאוקלסטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

גלה סרטונים נוספים