ניתוח אינטראקציות DNA-חלבון עם אינטרפרומטריה ביו-שכבתית מבוססת סטרפטווידין
17 בינואר 2025
מאמר זה מתאר פרוטוקול לחקר אינטראקציות דנ"א-חלבון באמצעות מערכת אינטרפרומטריה ביו-שכבתית מבוססת סטרפטווידין (BLI). הוא מתאר את השלבים והשיקולים החיוניים לשימוש בקינטיקה מחייבת בסיסית או מתקדמת כדי לקבוע את זיקת קשירת שיווי המשקל (KD) של האינטראקציה.
אינטראקציות ביומולקולות, כולל אינטראקציות חלבון-חלבון וחלבון-דנ"א, חיוניות במחקר ביוכימי. במחקר זה אנו משתמשים באינטרפרומטריה של שכבה ביולוגית, או BLI, טכניקה יעילה לניתוח אינטראקציות אלה. אנו מתמקדים בחלבון שכפול A ובזיקה הקושרת שלו לדנ"א גדיל יחיד כדי להציג את העקרונות והיכולות של BLI.
אינטרפרומטריה של שכבה ביולוגית היא שיטה קלה וחסכונית לחקר קינטיקה של חלבונים. הוא מאפשר ניטור מהיר בזמן אמת של אינטראקציות חלבונים ומציע זרימת עבודה פשוטה עם פחות מורכבות מאשר טכניקות אחרות. במעבדה שלנו אנו חוקרים את ההשפעה של שינויים לאחר תרגום על המבנה והתפקוד של החלבונים החיוניים לשמירה על יציבות הגנום.
שינויים אלה יכולים ליצור אפקטים מדורגים במסלולי שכפול ותיקון. על ידי חקר אינטראקציות חלבונים, אנו שואפים לחשוף את המנגנונים הבסיסיים השומרים על שלמות הגנום. כדי להתחיל, הכינו 12.5 ננו-מולר של שלושה מצעי פיתיון פולי dT 32 ראשוניים חד-גדיליים וארבעה ריכוזים של RPA באמצעות חיץ BLI.
באמצעות פיפטה, הוסף 250 מיקרוליטר של חיץ BLI בשתי שפופרות מיקרופוגה של 0.5 מיליליטר ותייג אותן כ- AND. בצלחת נפרדת של 96 בארות, פיפטה 200 מיקרוליטר של חיץ BLI בבאר אחת. מקם את מגש הביו-חיישנים על צלחת 96 הקידוחים כך שחיישן ביולוגי אחד יטבול במאגר ה-BLI.
בתוכנה, לחץ על אפשרות ההידרט והגדר את הטיימר ל -10 דקות. התאם את הגדרות ההפעלה עבור כל שלב, תוכנית בסיסית, שיוך ודיסוציאציה. הכה הפעל את התוכנה ופעל לפי ההוראות בהודעת הפקודה.
הניחו שני תאים במחזיק הצינור וחברו את הביו-חיישן הלח למערכת ה-BLI. החלק את מחזיק הצינור מתחת לחיישן הביולוגי במיקום A ונטר את קו הבסיס של הביו-חיישן. לאחר השלמת קו הבסיס הראשוני, פתח את המכסה והוסף ארבעה מיקרוליטרים של חיץ BLI למחזיק הטיפה.
החלק את מחזיק הטיפה ימינה מתחת לאותו חיישן ביולוגי במיקום B.לאחר סגירת המכסה, עקוב אחר עקומת BLI בתוכנה. לאחר מכן פתח את המכסה והחלף את צינור A בצינור D.החלק את הצינור החדש מתחת לביו-חיישן במיקום A לפני סגירת המכסה ונתח את שלב הדיסוציאציה בממשק. הכניסו את צינור A למחזיק הצינורות.
חבר את הביו-חיישן הלח למערכת BLI והחלק את מחזיק הצינור מתחת לביו-חיישן כפי שהוצג קודם לכן. לאחר מכן לחץ על הפעל בממשק התוכנה להגדרה בסיסית. לאחר הוספת ארבעה מיקרוליטרים של פיתיון DNA חד-גדילי ננו-מולרי 12.5 ננו-מולרי למחזיק הטיפה והחלקתו מתחת לביו-חיישן לשלב האסוציאציה, עקוב אחר עקומת BLI בתוכנה.
לאחר מכן פתח את המכסה כדי להחליף את צינור A ב- D.החלק אותו מתחת לחיישן הביולוגי והמשך בשלב הדיסוציאציה. לאחר השלמת שלב הדיסוציאציה, פתח את המכסה ונתק את הביו-סנסור. לאחר מכן הניחו את החיישן הביולוגי במגש המכיל מאגר BLI.
באמצעות פיפטה, להוסיף 250 מיקרוליטר של חיץ BLI 10 0.5 מיליליטר שחור microfuge tubes. תייג את הצינורות כ- A1 עד A5 ו- D1 עד D5. מלא את פרטי הניסוי בממשק התוכנה ולחץ על כפתור החישוב כדי לעבד את המידע. בצלחת נפרדת של 96 באר פיפטה 200 מיקרוליטר של חיץ הפשטה לתוך הבאר המתאימה למיקום של biosensor hydrated.
לאחר הנחת צינור A1 במחזיק הצינור, חיבור הביו-חיישן המצופה בפיתיון למערכת BLI והחלקת הצינור מתחת לביו-סנסור, לחץ על הפעל בתוכנה. לאחר השלמת שלב הבסיס הראשוני, פתח את המכסה והוסף ארבעה מיקרוליטרים של מאגר BLI למחזיק הטיפה. החלק את מחזיק הטיפה מתחת לחיישן הביולוגי ונטר את שלב השיוך בממשק BLI.
החלף את צינור A1 ב- D1. החלק אותו מתחת לחיישן הביולוגי וסגור את המכסה. לאחר מכן עקוב אחר שלב הדיסוציאציה בממשק BLI. לאחר השלמת שלב הדיסוציאציה, פתח את המכסה, הסר את החיישן הביולוגי והחזיר אותו למגש המכיל מאגר BLI.
לאחר מכן חבר את הביוסנסור המצופה בפיתיון והנח את הצינור A2 במחזיק הצינור. החלק את הצינור מתחת לחיישן הביולוגי ולחץ על הפעל את התוכנה. לאחר שלב הבסיס, הוסף ארבעה מיקרוליטרים של חמישה RPA ננו-מולארי למחזיק הטיפה.
החלק את מחזיק הטיפה מתחת לחיישן הביולוגי וסגור את המכסה. עקוב אחר עקומת השיוך בממשק התוכנה. הסר את החיישן הביולוגי וטבל אותו במאגר ההפשטה למשך 30 שניות.
לאחר מכן טבלו את החיישן הביולוגי במאגר BLI למשך שלוש דקות. בטבלה שכותרתה Run List, סמן את ההפניה לתיבה עבור ריכוז האנליט של אפס ננו-מולרי שישמש כעקומת ייחוס, סמן את התיבה, נתח, עבור כל הריכוזים של האנליט. בחר גם תחילת שיוך וגם תחילת דיסוציאציה לתיקון שלבים, בחר התאמה גלובלית לבדיקה.
לאחר מכן, לחץ על נתח כדי לעבד את הנתונים. כדי לייצא את הנתונים המותאמים, לחץ לחיצה ימנית על הגרף שנוצר מנתוני הניתוח. בחר ייצוא נתונים, לאחר מכן בחר טקסט או נתונים, לחץ על קובץ ולאחר מכן עיין כדי לשמור את הנתונים בפורמט DAT.
פתח את התוכנה ובחר קינטיקה מתקדמת מהלוח השמאלי. לאחר הנחת צלחת של 96 בארות במגש הביו-סנסור והוספת 200 מיקרוליטר של חיץ BLI לחמש בארות, הכנס את מגש הביו-חיישן לצלחת כדי ללחלח את החיישנים. בזמן שהחיישנים הביולוגיים מעניקים לחות, פיפטה 250 מיקרוליטר של BLI חוצצת לתוך 10 צינורות צנטריפוגה שחורים של 0.5 מיליליטר.
מלא את פרטי הניסוי בממשק התוכנה ולחץ על כפתור החישוב כדי לעבד את המידע. לאחר החלקת מחזיק הצינור עם צינור A1 מתחת לחיישן הביולוגי, לחץ על הפעל כדי לקבל את קו הבסיס הראשוני. הוסף ארבעה מיקרוליטרים של חיץ BLI למחזיק הטיפה.
החלק את מחזיק הטיפה מתחת לחיישן הביולוגי, סגור את המכסה ועקוב אחר העקומה לטעינה בתוכנה. השינוי הספקטרלי במהלך קשירת RPA באמצעות קינטיקה בסיסית הדגים עלייה תלוית מינון בחוזק הקשירה עם רוויה שהושגה ב -40 ננו-טוחנת. השינוי הספקטרלי במהלך קשירת RPA באמצעות קינטיקה מתקדמת הראה באופן דומה קשירה תלוית מינון, אך עם ביו-חיישנים בודדים המשמשים לכל ריכוז לשיפור הדיוק.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לחקר אינטראקציות בין DNA לחלבונים באמצעות אינטרפרומטריה של שכבת ביולוגית (BLI). הוא מדגיש את היעילות של BLI בניתוח זיקות קישור ואת ההשפעה של מודיפיקציות פוסט-טרנסלציוניות על תפקוד החלבון.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- ביוכימיה
- אינטראקציות חלבון-DNA
- קינטיקה של קישור
רקע
- אינטראקציות בין ביו-מולקולות הן קריטיות במחקר ביוכימי.
- BLI היא שיטה חסכונית לחקר קינטיקה של חלבונים.
- הטכניקה מאפשרת ניטור של אינטראקציות בזמן אמת.
- מודיפיקציות פוסט-טרנסלציונליות עשויות להשפיע על מבנה החלבון ותפקודו.
מטרת המחקר
- להדגמת העקרונות של BLI.
- לניתוח זיקת הכשירה (binding affinity) של חלבון שחזור A ל-DNA גדילי יחיד.
- לספק תזרים עבודה פשוט למחקר אינטראקציות בין חלבונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מערכת אינטרפרומטריה של שכבת ביולוגית (BLI) המבוססת על סטרפטאווידין.
- ניתוח קינטיקה של קישור בסיסי ומתקדם.
- ניטור בזמן אמת של אינטראקציות חלבון-DNA.
- הערכת זיקה של קישור בשיווי משקל (K D ).
תוצאות עיקריות
- הדגמה מוצלחת של BLI לבדיקת אינטראקציות בין DNA לחלבון.
- קביעת זיקת קישור עבור replication protein A.
- תובנות לגבי ההשפעה של מודיפיקציות פוסט-טרנסלציוניות.
- תיקוף של BLI כשיטה מהימנה לניתוח קינטיקה של חלבונים.
מסקנות
- BLI הוא כלי יעיל לחקר אינטראקציות בין ביו-מולקולות.
- השיטה מפשטת את ניתוח קינטיקת הקישור.
- הבנת אינטראקציות בין חלבונים ל-DNA חיונית למחקר על יציבות הגנום.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ניתוח כמותי של אינטראקציות DNA-חלבון הוא יסודי עבור תיקוף מטרות (target validation) והפחתת סיכונים מכניסטיים בשלבים מוקדמים של גילוי תרופות. ביולייר אינטרפרומטריה (BLI) מבוססת סטרפטאווידין מאפשרת מדידה של קינטיקת קישור בזמן אמת וללא סימון, ובכך תומכת בביטחון חיזוי בחקירת מסלולים ובמיון פורטפוליו. היכולת להסיק קבועים קינטיים מדויקים מאיצה את קבלת ההחלטות בנקודות מפנה קריטיות במו"פ של ביו-פרמה.&ד'.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פארמה&ד'
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה כמותית של השערות לגבי קישור חלבון-DNA הרלוונטיות לתפקוד מסלול ביולוגי.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי אספקת קינטיקה של אסוציאציה ודיסוציאציה בזמן אמת.
- מסייע בתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות קביעה מדויקת של KD.
- משפר את הביטחון החזוי לקידום מטרות בצינור הגילוי.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מכין בדיקות קישור DNA-חלבון שעברו תיקוף עבור תהליכי סינון המשכיים.
- מספק תוצאות קינטיות כמותיות הניתנות לשחזור לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה.
- מאפשרת הערכה מהירה וניתנת להרחבה (scalable) של אינטראקציות קישור תחת תנאים מרובים.
- תומך בהערכה מהימנה של תרכובות על ידי מזעור מורכבות הבדיקה והשונות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מקשר בין ממצאים מכניסטיים למסלולים רלוונטיים למחלה על ידי הבהרת הדינמיקה של אינטראקציית חלבון-DNA.
- מספק רצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות תמיכה במחקרי סמנים ביולוגיים ומסלולים.
- מפחית את הסיכון התרגומי על ידי מתן אפשרות להערכה כמותית ואסורה של אינטראקציות מולקולריות.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline & Workflow)
ניתוח אינטראקציית DNA-חלבון המבוסס על BLI משתלב ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות ראשונית, דרך זיהוי מובילים (lead identification) ועד לתיקוף פרה-קליני.
- ביולוגיה של תגליות: תומכת בחקירה מונחית-השערות של קישור חלבון-DNA ומנגנוני מסלולים.
- סריקה: מספקת נתונים קינטיים כמותיים וסטנדרטיים לצורך מוכנות ושחזור של הבדיקה.
- אנליטיקה: מספקת קבועי קישור (association), פירוק (dissociation) ושיווי משקל לצורך ניתוח השוואתי בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשרת תובנות מנגנוניות למערכות רלוונטיות למחלה ולאסטרטגיות של סמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה לשימוש חוזר עבור מחקרים מגוונים של אינטראקציות חלבון-DNA וחלבון-חלבון.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרה.
- ערך תפעולי: מייעל תהליכי עבודה באמצעות בדיקות קינטיות סטנדרטיות, הניתנות לשחזור ולהרחבה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) וקידום תיק נכסים ביעילות הונית.
- השפעה על תיק הנכסים: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים ובקידום נכסים בשלבי הגילוי.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתכנון בדיקות קינטיות ובפירוש נתונים.
- נדרשת גישה למכשור BLI ולתוכנה אנליטית תואמת.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית עבור פרוטוקולי בדיקה וניתוח נתונים.
- עשוי לדרוש התאמה עבור סובסטרטים שונים של חלבונים או DNA ומערכות מודל שונות.
- תלוי באיכות הביוסנסור ובאופטימיזציה של הבאפר לקבלת תוצאות הניתנות לשחזור.
