הכנת דגימות אורגנואידים ברשתית למיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת
7 ביוני 2024
פרוטוקול זה מספק הליך הכנה אופטימלי ומשוכלל לדגימות אורגנואידים ברשתית למיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. הוא מתאים ליישומים הכוללים ניתוח של סינפסות באורגנואידים רשתית בוגרים.
המחקר שלנו מתמקד בעיקר בניתוח מבנה העל הסינפטי באורגנואידים רשתית בוגרים. אנו שואפים לפתח מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת פשוט וניתן לשחזור, או TEM, שיטת הכנת דגימות לאורגנואידים ברשתית, אשר יכול להועיל מאוד לתחום המחקר של אורגנואידים ברשתית. בהשוואה לטכניקות אחרות כגון מיקרוסקופ אופטי, מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת מציע את היכולת לאפיין את מבנה העל של סינפסה אינטגרלית ואת האברונים התת-תאיים באורגנואידים ברשתית ברמה ננומטרית.
הפרוטוקול שלנו מציע תנאים אופטימליים להכנת דגימות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת של אורגנואידים ברשתית, החזרת נתונים סטטיסטיים פשוטים וידידותיים למשתמש. הממצאים שלנו מראים בבירור את המורפולוגיה של מבנה העל של סינפסה בתוך אורגנואידים ברשתית, כולל הן סינפסה קונבנציונלית והן סינפסת סרט. זה מבסס יסודות מוצקים ומציג שיטות לשחזור עבור חקירות פונקציונליות הבאות של אורגנואידים ברשתית, יחד עם הערכת היישומים הקליניים שלהם כגון סינון תרופות.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מספק הליך אופטימלי להכנת דגימות של אורגנואידי רשתית עבור מיקרוסקופיה אלקטרונית חודרית (TEM). המחקר מתמקד בניתוח המבנה העצמי הסינפטי באורגנואידי רשתית בוגרים, ומספק שיטה נוחה למשתמש המאפשרת ניתוח תת-תאי מפורט ברמת הננו.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של הרשתית
- מיקרוסקופיה אלקטרונית
רקע
- אורגנואידים של הרשתית משמשים כמודלים בעלי ערך לחקר מבני ותפקודי הרשתית.
- מיקרוסקופיה אלקטרונית חודרת (TEM) מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של רכיבים תאיים.
- המחקר נועד לשפר את טכניקות הכנת הדגימות ל-TEM לצורך ניתוח מפורט.
- אורגנואידים בוגרים של הרשתית מראים מבנים סינפטיים שניתן לאפיין באמצעות שיטה זו.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה פשוטה וניתנת לשחזור להכנת דגימות של אורגנואידים רשתית עבור TEM.
- הערכת המורפולוגיה העל-מבנית של סינפסות בתוך אורגנואידים אלו.
- הנחת התשתית למחקרי תפקוד וליישומים קליניים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שימוש באורגנוידים של רשתית שנגזרו מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושראים (iPSCs).
- הפרוטוקול כולל תהליכי קיבוע, צביעה, דהידרטציה ושיכון המותאמים ל-TEM.
- שלבים מרכזיים כוללים צביעה באוסמיום, דהידרטציה במדרג ושקיעה בשרף אפוקסי.
- התצפיות מבוצעות באמצעות מיקרוטום לחיתוכי חצי-דקים ומיקרוסקופיה אופטית לאחר ההכנה.
תוצאות עיקריות
- השיטה מדגישה בהצלחה הן סינפסות קונבנציונליות והן סינפסות מסרט (ribbon synapses) באורגנואידים של הרשתית.
- מורפולוגיות אולטרה-מבניות מוגדרות בבירור, ובכך הן מניחות בסיס מוצק למחקרי המשך.
- הממצאים תומכים ביכולת השחזור של השיטה, ובכך מאפשרים ביצוע של מחקרים פונקציונליים בהמשך.
מסקנות
- מחקר זה מאפשר ניתוח מפורט של מבנים סינפטיים בתוך אורגנואידים של רשתית באמצעות TEM.
- שיטת ההכנה המופתעת מקלה על מחקרים עתידיים של אורגנואידים תפקודיים של הרשתית.
- ההשלכות של המחקר משתרעות על הבנת מנגנונים עצביים ויישומים קליניים פוטנציאליים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ניתוח אולטרה-מבני ברזולוציה גבוהה של אורגנואידים של הרשתית מאפשר הפחתת סיכונים מכנית ותיקוף של מטרות בשלבים מוקדמים של גילוי תרופות פתלמיות. פרוטוקולים להכנת דגימות למיקרוסקופיה אלקטרונית בשידור (TEM) עבור אורגנואידים של הרשתית מספקים תובנות כמותיות וניתנות לשחזור לגבי הארכיטקטורה הסינפטית, ובכך תומכים בביטחון חיזוי במערכות רלוונטיות למחלה. יכולת זו מחזקת את הרצף התרגומי מהביולוגיה של הגילוי להערכה של מודלים פרה-קליניים בתיקי מחקר של הרשתית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר ויזואליזציה ישירה של האולטרה-מבנה הסינפטי לצורך תיקוף של מטרות תפקודיות.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי הבחנה בין סינפסות סרט (ribbon synapses) לסינפסות קונבנציונליות במודלים של אורגנואידים.
- מספק מדדי ייחוס מורפולוגיים כמותיים לבחינת השערות בביולוגיה של הרשתית.
סקרינג ופיתוח בדיקות
- מגדיר זרימות עבודה מאושרות להכנת דגימות עבור בדיקות דימות עקביות בשלבים הבאים.
- מסייע בהערכה הדירה של הבשלת אורגנואידים ושל השלמות הסינפטית.
- מאפשר סטנדרטיזציה של טיפול בדגימות לצורך סריקה ניתנת להרחבה של פנוטיפים רשתיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה את anultrastructure של האורגנואיד למאפיינים של רשתית אנושית הרלוונטיים למחלה לצורך פיתוח של ביומרקרים תרגומיים.
- תומכת ברצף מהגילוי in vitro ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי אספקת נקודות סיום מורפולוגיות חסונות.
- מפחיתה עמימות ביולוגית בבחירת מודל לפיתוח תרופות Oftahalmic.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
פרוטוקול זה להכנת דגימות ל-TEM משתלב ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי מתן אפשרות לניתוח מורפולוגי ברמת ביטחון גבוהה של אורגנואידים רטינליים המופקים מ-iPSCs.
- ביולוגיה של הגילוי: מספקת ראיות ישירות להיווצרות והבשלת מגעים סינפטיים במערכות אורגנואידים.
- סריקה: מספקת פלטי דימות כמותיים וניתנים לשחזור לצורך ניתוח השוואתי בין תנאים שונים.
- אנליטיקה: תומכת בהערכה סטטיסטית של מורפולוגיה וצפיפות סינפטית בקבוצות ניסוייות.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין ממצאים in vitro לנקודות סיום פרה-קליניות באמצעות התאמה אולטרה-מבנית.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פרוטוקול סטנדרטי וניתן לחזור, הניתן להתאמה למגוון פלטפורמות של אורגנואידים רשתיים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי במידול מחלות רשתית ובתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והסטנדרטיזציה של זרימות עבודה בדימות אולטרה-מבני.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות של go/no-go על ידי הפחתת אי-ודאות מכניסטית בשלבי הגילוי המוקדמים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים של מטרות ומודלים של רשתית לצורך קידום.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהכנת דגימות ל-TEM ובניתוח דימויים תת-תאיים.
- מחייב גישה לציוד ייעודי לקיבוע, טמינה ומיקרוסקופיה.
- מצריך סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי טיפול בדגימות והדמיה.
- ניתן להתאמה למערכות אורגנואידים שונות המופקות מ-iPSC באמצעות אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- תלוי בבקרת איכות של ריאגנטים וחומרי טמינה לצורך שחזוריות.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:38
Retinal Organoid Fixation and Post Fixation Procedure for TEM Sample Preparation
2:39
Staining, Dewatering, and Infiltration of Fixed Retinal Organoids for TEM Sample Preparation
4:24
Retinal Organoid Embedding and Semi‐Thin Slice Positioning for Transmission Electron Microscopy
