Name: בידוד תאי אנדותל של לבלב עכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-21T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: למדו שיטת בידוד תאי אנדותל מלבלב עכבר באמצעות פריקה עדינה ומיון מגנטי. הפרוטוקול מאפשר חקר מרקרים משטחיים ופרופילים תרשימיים של תאי אנדותל לבלב לצורך הבנת מחלות פנקריאטיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>ייעול מיצוי תאי אנדותל בלבלב בעכבר לחקר מחלות

<table><tbody><tr><td>1.5 מ"ל eppendorf</td><td>ארה"ב מדעי</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 10 ס"מ</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-202</td><td></td></tr><tr><td>25G מחטים</td><td>BD</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>2X Taq Pro אוניברסלי SYBR qPCR Master Mix</td><td>Vazyme</td><td>Q712-03-AA</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל eppendorf</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>14282300 צלחת 6 בארות</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>07-000-208</td><td></td></tr><tr><td>70 ומיקרו; m מסננת</td><td>פישר</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-CD31-ביוטין</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>REA784</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין מטופל בהלם חום</td><td>פישר</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher</td><td>BP510</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>אפנדורף</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קולגן סוג 1, מעור עגל</td><td>סיגמא אולדריץ'& נ.ב.פ;</td><td>C9791</td><td>מגיב מצורף בפרוטוקול</td></tr><tr><td>קולגנאז סוג 1&nbsp;</td><td>וורת'ינגטון ביו</td><td>LS004197</td><td></td></tr><tr><td>רוזנת מונה תאים אוטומטי</td><td>תרמו פישר&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>תרמו פישר&nbsp;</td><td>D1306</td><td>אימונופלואורסצנציה</td></tr><tr><td>אזמל בטיחות חד פעמי</td><td>Myco Instrumentation</td><td>6008TR-10</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I&nbsp;</td><td>רוש</td><td>260913&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (Ca2+, Mg2+)</td> <td>תרמו פישר&nbsp;</td><td></td><td></td>14080055</tr><tr><td>אתנול</td><td>פישר</td><td>BP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>פישר</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>אינקובטור</td><td></td><td></td><td>נשמר ב-37 מעלות; C 5% CO2</td></tr><tr><td>LS עמודות</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>M199</td><td>Sigma</td><td>M2520-1L</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand עם מפריד QuadroMACs&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>בינוני 199</td><td>סיגמא אולדריץ'&nbsp;</td><td>M2520-10X</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-חרוזים אנטי ביוטין</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>Leica</td><td></td><td>להערכת מורפולוגיה של תאים</td></tr><tr><td>קורנינג</td><td>מים בדרגה מולקולרית</td><td>46-000-CM</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>ניו ברונסוויק Innova 44/44R שייקר אורביטלי&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PECAM1 (CD31) נוגדן</td><td>Abcam</td><td>ab56299</td><td>אימונופלואורסצנטי</td></tr><tr><td>PECAM1 (CD31) נוגדן</td><td>R& D Systems</td><td>AF3628</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח (10X) (ללא Ca2+, ללא Mg2+)</td> <td>Genesee Scientific</td><td>25-507-XB</td><td></td></tr><tr><td>פריימר 36B4 עכבר קדימה</td><td>IDT</td><td></td><td>AGATTCGGGATATGCTGTTGGC</td></tr><tr><td>פריימר 36B4 עכבר Revese &nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td>TCGGGTCCTAGACCAGTGTTC</td></tr><tr><td>פריימר Kdr עכבר קדימה&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td>TCCAGAATCCTCTCTCCATGC</td></tr><tr><td>פריימר Kdr עכבר הפוך</td><td>IDT</td><td></td><td>AAACCTCCTGCAAGCAAATG</td></tr><tr><td>פריימר Nkx6.1 עכבר הפוך&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td>CACGGCGGACTCTGCATCACTC</td></tr><tr><td>פריימר Nxk6.1 עכבר קדימה</td><td>IDT</td><td></td><td>CTCTACTTTAGCCCCAGCG</td></tr><tr><td>פריימר PECAM1 עכבר קדימה</td><td>IDT</td><td></td><td>ACGCTGGTGCTATGCAAG</td></tr><tr><td>פריימר PECAM1 עכבר הפוך</td><td>IDT</td><td></td><td>TCAGTTGCTGCCCATCATCA</td></tr><tr><td>RNase ZAP</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>RNase מים ללא Takara</td><td></td><td>RR036B</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים ארוכים סטריליים 12 אינץ'</td><td>FST</td><td>91100-16</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים עדינים סטריליים</td><td>FST</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>מספריים עדינים סטריליים</td><td>FST</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>כלי תרבית רקמות 2 ס"מ</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-260</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol מגיב</td><td>פישר</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>טריפן בלו</td><td>קורנינג</td><td>MT25900CI</td><td></td></tr><tr><td>מעכב טריפסין&nbsp;</td><td>Roche</td><td>10109886001</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>VE-Cadherin Antibody</td><td>Abcam</td><td>ab33168</td><td>אימונופלואורסצנטי</td></tr><tr><td>אמבט מים</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד תאי אנדותל של לבלב עכבר

Isolation of Mouse Pancreatic Endothelial Cells

בעקבות פרוטוקול זה, ניתן לקבל כ 2 x 106 תאים חיים בעת איגום 3 לבלב עכבר, ו 750,000 תאים מלבלב עכבר יחיד. כדי לאמת את ההעשרה של EC, ביצענו את הניתוחים הבאים: 1) PCR כמותי: בהשוואה לדגימות הזרימה (FT) (כלומר, השברים שאינם קשורים לנוגדנים CD31), לשברי EC היו רמות גבוהות משמעותית של Pecam1 (קידוד CD31) ו - Kdr (קידוד VEGFR2), שני גנים של סמן EC33, ורמות נמוכות יותר של NK6 homeobox 1 (Nkx6.1), גורם שעתוק בתאים האנדוקריניים של הלבלב (איור 4A); 2) כתמים מערביים: דגימות מועשרות ב-EC משלושה תכשירים (pEC-1-3) הראו אותות חזקים של CD31 בגודל הצפוי (~130 kDa). לשם השוואה, דגימות הקלט וה-FT הראו אות CD31 מינימלי. כבקרה חיובית, ליזטים של תאי MS1, קו תאי pEC, הראו גם אות CD31 חזק (איור 4B); 3) צביעה כחולה של טריפאן: מצאנו שהכדאיות של תאים מבודדים הייתה בסביבות 50% (איור 4C); 4) ציטומטריית זרימה בעקבות פרוטוקול15 שפורסם: באמצעות gating על אוכלוסיית התאים החיים (איור 4D), מצאנו שתאי CD31+ היו ב-88% ותאי TdTomato+ היו ב-76%. שימו לב, רוב התאים המבודדים מבטאים במשותף CD31 ו-TdTomato (איור 4E). כבקרות שליליות, תאי MS1 לא מוכתמים ו- MS1 מודגרים עם IgG לא הראו תאים חיים כפי שמסומן על ידי CD31. כבקרה חיובית, כלומר תאי MS1 מוכתמים עבור CD31 הראו קרוב ל-100% תאי CD31+ חיים (איור 4F). תרבינו גם את התאים המבודדים, ביצענו צביעה אימונופלואורסצנטית של PECAM1 בעקבות פרוטוקול36 שפורסם, וצילמנו את TdTomato, שהראה אותות חזקים של שני הסמנים בתאים המבודדים, מה שמרמז על נוכחות ECs (איור 4G).
<img alt="דיאגרמת לבלב הממחישה ECs תוך-איים לחקר מבנה כלי הדם וניתוח אינטראקציה תאית." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66690/66690fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 
איור 1: איור של וסקולריזציה של איי לבלב ולבלב . תיאור ציורי של תאי אנדותל הלבלב (ECs) ותאי EC בתוך איון. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66690/66690fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="תרשים הכנת לבלב חד-תאי; צנטריפוגה, תיוג CD31-ביוטין, ניתוח זרימה." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66690/66690fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 
איור 2: מבט כולל על זרימת עבודה. 1) דיסקציה של הלבלב, 2) עיכול מכני, 3) דגירה של אנזימים, 4) צנטריפוגה, 5א) סילוק סופרנטנט ו-5ב) עיכול קולגנאז משני של כדורי התא עם טריטורציה לסינון ב-6), 7), ו-8) בנייה מחדש של כדוריות וקשירת נוגדנים, 9) דגירה של מיקרו-כדוריות, 10) העשרת עמודת MACS, 11) ספירת תאים לצורך כדאיות, ו-12) אנליזה במורד הזרם. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66690/66690fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="דיסקציה של רקמות המציגה את תהליך הקציר, הבידוד והחיתוך של הלבלב במחקר ביולוגי." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66690/66690fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 
איור 3: שלבי עיבוד רקמות. תמונות של (A) חלל הבטן, (B) לבלב העכבר המבודד, ו-(C) לבלב העכבר החתוך. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66690/66690fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="ביטוי גנים, ניתוח CD31, DAPI, מיון תאים, פלואורסצנציה ותוצאות ציטומטריית זרימה." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66690/66690fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 
איור 4: אימות של שברי EC מבודדים מלבלב עכבר. (A) qPCR של דגימות FT ומקטע EC מועשר ב-CD31 להעשרה. Pecam1 (CD31), Kdr (VEGFR2) ו- Nkx6.1 (גורם שעתוק ספציפי ללבלב β תאים)33. * מציין p &lt;0.05 בהשוואה ל-FT בהתבסס על בדיקות t . n = 3-4 דגימות מאוגמות, המורכבות מ-3 עכברים כל אחת. (B) כתם מערבי של CD31. pEC-1-3 מציין ECs מועשרים מ-3 דגימות עכבר נפרדות. ליזטים של 30 מ"ג הועמסו על כל נתיב, ואחריו צביעת פונסו S. (C) ספירת תאים וצביעה כחולה טריפאן של pECs מועשרים לבדיקת כדאיות. (D) אסטרטגיית גאטומטריית זרימה עבור pECs עכבר מוכתמים על ידי 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ונוגדן CD31. (E) היסטוגרמות ציטומטריית זרימה של MS1 לא מוכתם (למעלה משמאל), MS1 מוכתם בנוגדן משני AlexaFluor-488 (בקרת IgG; למעלה מימין), MS1 מוכתם ב-CD31 (למטה משמאל), ו-pECs העכבר המבודדים מוכתמים ב-CD31 (למטה מימין). (F) אחוז התאים החיים שכומתו באמצעות ציטומטריית זרימה. (G) אימונופלואורסנציה של ביטוי CD31 (ירוק) עם DAPI (כחול) כתם נגדי וכתב פלואורסצנטי אנדוגני TdTomato (אדום). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66690/66690fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית CD31 / CD144 / DAPI, ניתוח ביטוי גנים UMAP של Cdh5, Pecam1." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66690/66690fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> 
איור 5: ספציפיות CD31 ו-CD144 בלבלב עכבר. (A) אימונופלואורסצנטיות של לבלב עכבר עם CD31 (מגנטה) ו-CD144 (ציאן), עם כתם נגדי DAPI. התמונה צולמה באמצעות עדשת 10x תחת מיקרוסקופ הפוך פלואורסצנטי רחב. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. קווים מקווקווים תוחמים את אזור האיון. (B) Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) המציג ביטוי Cdh5 ו-Pecam1 באיונים ECs מעכברי C57BL6 שזוהו על ידי scRNA-seq (GSE128565)37. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66690/66690fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>אנזים</td>
			<td>שימוש</td>
			<td>טמפרטורה וזמן</td>
			<td>הפניה</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>קולגנאז I</td>
			<td>דיסוציאציה של תא בודד, העשרת EC בלבלב שלם</td>
			<td>37°C, 20 דקות</td>
			<td>פרוטוקול זה</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>קולגנאז IV</td>
			<td>בידוד האי ודיסוציאציה לא אנזימטית</td>
			<td>37°C, 20 דקות</td>
			<td>46</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>קולגנאז + טריפסין</td>
			<td>בחינת תאים דוקטליים בלבלב עכבר</td>
			<td>37°C, 30 דקות</td>
			<td>47</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>קולגנאז B</td>
			<td>השעיית תא בודד של הלבלב</td>
			<td>37°C, 30 דקות</td>
			<td>48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase NBI</td>
			<td>בידוד איילט</td>
			<td>37°C, 30 דקות</td>
			<td>49</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>קולגנאז P</td>
			<td>Acinar קיימא השעיה</td>
			<td>37°C, 15 דקות</td>
			<td>45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>קולגנאז XI</td>
			<td>בידוד איילט</td>
			<td>37°C, 15 דקות</td>
			<td>35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>דיספסי</td>
			<td>מתלה תא יחיד</td>
			<td>37°C, 45 דקות</td>
			<td>24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ליבראסה</td>
			<td>מתלה תא יחיד</td>
			<td>37°C, 10 דקות</td>
			<td>25, 48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>טריפסין</td>
			<td>דיסוציאציה של תא בודד, לבלב שלם</td>
			<td>4 °C, O/N</td>
			<td>28</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
טבלה 1: סיכום פרוטוקולים שונים המשמשים לעיבוד דגימות לבלב עכבר.

The pancreas is a vital organ for maintaining metabolic balance within the body, in part due to its production of metabolic hormones such as insulin and ...

isolation-of-mouse-pancreatic-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

איי הלבלב, המכונים גם איי לנגרהנס, הם אשכול של תאים אנדוקריניים המייצר הורמונים לוויסות גלוקוז ופונקציות ביולוגיות חשובות אחרות. פרוטוקול זה מסביר שיטה לבידוד איי הלבלב על ידי החדרת קולגנאז תחילה דרך אמפולה של Vater כדי לעכל את רקמת הלבלב האקסוקרינית וצנטריפוגה הדרגתית צפיפות פשוטה כדי לטהר את האיים מעכברים.

בידוד איי הלבלב באמצעות זילוח Collagenase: שיטה אנזימטית לבידוד תאי איון הלבלב

בפרסום זה, אנו מתארים הליך מהיר ונוח לבידוד ותאי לבלב acinar העיקריים culturing מהלבלב העכברי. שיטה זו מהווה גישה רבת ערך כדי ללמוד את הפיסיולוגיה של תאי לבלב אקסוקרינית רגילים / untransformed העיקריים טריים.

בידוד והתרבות של תאי לבלב הראשיים acinar עכבר

אנו מציגים כאן פרוטוקול לבידוד איים ממודל העכבר של סוכרת מסוג 2, Leprdb ופרטים על בדיקת תאים חיים למדידת הפרשת אינסולין מאיים שלמים המשתמשת במיקרוסקופ 2 פוטונים.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; עכבר דגם של סוכרת מסוג 2: בידוד לבלב וLive- תא 2-פוטון הדמיה של איי שלמים

פרוטוקול זה מוכן לחלוק את השיטה שלנו לבידוד תאי אנדותל כליליים של עכברים לצורך הדמיה או לביצוע ניסויים ביולוגיים מולקולריים.

בידוד של תאי האנדותל העכבר כלילי

אנו מתארים פרוטוקול בזאת לבידוד איים שלמים מעכברים בילוד. Pancreata היו מעוכל חלקית עם collagenase, ואחריו כביסה בחירה ידנית. 20 - 80 אשכולות איון ניתן להשיג לכל לבלב מעכברים שזה עתה נולדו, אשר מתאימים מספר מחקרי איון.

בידוד יעיל של איי פונקציונלית מן היילודים עכבר לבלב

זה פרוטוקול בידוד של איון תיאר תוואי הרומן של הזרקה הקולגן כדי לעכל את רקמת אקסוקרינית הליך מעבר הדרגתי פשוטה כדי לטהר את איונים מעכברים. זה כרוך בעיכול אנזימטי, הפרדת הדרגתי/טיהור, ואיסוף ביד איון. בידוד מוצלח יכול להניב 250 – 350 באיכות גבוהה, באופן מלא של איונים לכל עכבר.

פרוטוקול פשוט יעילות גבוהה לבידוד איון הלבלב של עכברים

כאן אנו מציגים פרוטוקול בידוד תאי הלבלב איון העכבר לסינון את inductions ROS מאת ואינטראקציות על מנת לזהות פוטנציאל diabetogenic xenobiotic כימיקלים.

הקרנה מבוססת תא מאתר הלבלב איון Diabetogenic כימיקלים סביבתיים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור דימות וכימות הדינמיקה סידן באוכלוסיות תאים הטרוגנית, כגון תאים איון הלבלב. כתבים פלורסנט מועברים לתוך שכבת היקפי של תאים בתוך איון, אשר לאחר מכן מאויית והתמונה, ועל ניתוח לתאים של הדינמיקה של עוצמת הניאון מבוצעת.

הדמיה של סידן דינמיקה באוכלוסיות משנה של תאים הלבלב איון של העכבר

כאן אנו מתארים ומדגימים פרוטוקול לבידוד תאי אנדותל סינוסואידליים ראשוניים בכבד עכבר (LSEC). הפרוטוקול מבוסס על זלוף קולגן בכבד, טיהור תאים לא-פרנצ'ימליים על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה ובחירת חרוזים מגנטיים CD146. אנו גם מנצלים את הפנוטיפ ומאפיינים את ה-LSECs המבודדים הללו באמצעות ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק.

בידוד ואפיון של תאי אנדותל סינוסואידליים ראשוניים בכבד של עכבר

במאמר זה, תאי אנדותל ריאתיים ראשוניים בודדו וגודלו בתרבית מעכברים ילודים.

בידוד תאי אנדותל ריאה ראשוניים של עכבר

מחקר זה פיתח שיטה פשוטה לחילוץ יעיל של איים ראשוניים תפקודיים ותאי אקינר מהלבלב בעכבר, ומציע כלי חשוב לחקר תקשורת בין-תאית בפתוגנזה של סוכרת מונעת מדלקת לבלב חריפה.

שיטה פשוטה ומהירה לבידוד סימולטני של איים ראשוניים ותאי אצינר ראשוניים בלבלב מעכברים

למדו שיטת בידוד תאי אנדותל מלבלב עכבר באמצעות פריקה עדינה ומיון מגנטי. הפרוטוקול מאפשר חקר מרקרים משטחיים ופרופילים תרשימיים של תאי אנדותל לבלב לצורך הבנת מחלות פנקריאטיות.

בידוד תאי אנדותל של לבלב עכבר

גלה סרטונים נוספים