Name: טרנספקציה של שיבוט מולקולרי של Naegleria gruberi rDNA לתוך N. gruberi Trophozoites (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: חקור שיטת טרנספקציה יציבה ל-Naegleria gruberi טרופוזואיטים באמצעות רכיבי CERE מעגולים חוץ-כרומוזומיים. הפרוטוקול מאפשר שימור DNA זר במעברים תרביתיים ובמחזורי אנקיסטמנט-אקסיסטמנט.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

מחקרים אלה מומנו חלקית על ידי מענק מקרן ג'ורג' פ. האדיקס מאוניברסיטת קרייטון (KMD). איור 1 נוצר ב-biorender.com, ואיור 3 נוצר ב-benchling.com.

פרטי המינים, הריאגנטים והציוד ששימשו במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים. הרצף של מבנה pGRUB של 17,004 זוגות בסיסים מסופק בקובץ משלים 1.
1. טיפוח trophozoites
<ol><li>הפשירו טרופוזואיטים קפואים של N. gruberi בטמפרטורה של 37°C למשך 3 דקות.</li>
	<li>יש לחסן את הטרופוזואיטים בצלוחיות T25 בתמצית פפטון/שמרים מעובדת/חומצת גרעין/חומצה פולית/האמין עם מדיה של 10% סרום עגל עוברי (PYNFH) בתוספת חיץ של 2% (דיסודיום פוספט, אשלגן דימימן פוספט).</li>
	<li>תרבית את הטרופוזואיטים בטמפרטורה של 25°C עד ~80% במפגש, שם הם מציגים מורפולוגיה של אמבואידים (איור 2A). הערה: כאשר מחיים בתחילה תרבות של trophozoites ממצבם הקפוא, זה יכול לקחת עד 5-7 ימים עבור T25 להיות confluent. דקנט מדיה כל 3-4 ימים ולהחליף במדיה טרייה.</li>
	<li>הניחו את הצלוחיות על קרח למשך 5-10 דקות כדי לשחרר את הטרופוזואיטים המודבקים מהפלסטיק. סובבו בעדינות את הבקבוק כדי לעקור את התאים הדבקים שנותרו. לטרופוזואיטים יש כעת מורפולוגיה "מעוגלת" (איור 2B).</li>
	<li>חלקו את התרביות 1:2 עד 1:4 לצלוחיות תרבית רקמה חדשות.</li>
	<li>הסר את PYNFH והחלף אותו במדיה אנציסטמנטית סטרילית (120 mM נתרן כלורי, 0.03 mM מגנזיום כלורי, 1 mM דיסודיום פוספט, 1 mM אשלגן דימימן פוספט, 0.03 mM סידן כלורי, 0.02 mM ברזל כלורי, pH 6.8)22 כדי encyst N . gruberi. הערה: רוב הטרופוזואיטים מתכווצים עד 72 שעות (איור 2C). יש להשלים את ההתרגשות תוך 72 שעות.</li>
	<li>הסר ציסטות מצלוחיות, צנטריפוגה ב 600 x גרם למשך 10 דקות ב 20 ° C, והשהה מחדש ציסטות במדיה PYNFH עם 10% סרום עגל עובר כדי להוציא את התאים. לדגור ב 25 ° C במשך 24 שעות עד trophozoites מתחילים להופיע.</li>
</ol>2. הדבקת trophozoites
<ol><li>צלחת trophozoites לתוך צלחת 6 היטב תחתית שטוחה רקמה צלחת (1 מ"ל של 1 x 106 trophozoites / מ"ל) ותרבית ב 25 ° C.</li>
	<li>להדביק את התאים כאשר הם מגיעים 70%-80% confluent (~ 10.4 x 104 תאים / ס"מ2 באשכולות 6 בארות). חממו את מגיב הטרנספקציה לטמפרטורת החדר לפני השימוש.</li>
	<li>הכן את תערובת מגיב פלסמיד transfection כדלקמן: 75 ng של DNA פלסמיד ו 0.225 μL של מגיב transfection ב 200 μL של מדיה PYNFH ללא FBS. הכינו תערובת מגיב פלסמיד מספקת לביצוע טרנספקציה כפולה. הערה: במחקר זה נעשה שימוש בפלסמיד חיידקי המכיל שיבוט באורך מלא של N. gruberi CERE (pGRUB). פלסמיד ריק (pGEM) שימש כבקרה שלילית (איור 3).</li>
	<li>לדגור על תערובת מגיב פלסמיד transfection בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.</li>
	<li>הסר ~ 800 μL של מדיום מן monolayers trophozoite ממש לפני transfection.</li>
	<li>שים את תערובת מגיב transfection פלסמיד על trophozoites.</li>
	<li>מערבלים בעדינות את הצלחת כל 15 דקות כדי למנוע הצטברות המדיה בשולי הצלחת.</li>
	<li>לשטוף את monolayers פעם אחת עם 2 מ"ל של מדיום הצמיחה לאחר 1 שעה דגירה ב 25 °C (75 °F).</li>
	<li>יש לטפל בחד-שכבות עם 10 U DNase ב-1 מ"ל של חיץ DNase 10x למשך 15 דקות ב-37°C כדי להסיר שאריות DNA פלסמיד, לשטוף פעם אחת עם מצע צמיחה, להוסיף 2 מ"ל של מדיה טרייה ולהניח בטמפרטורה של 25°C. דוגרים על הצלחת במשך 24-36 שעות.</li>
	<li>מניחים את הצלחת על קרח למשך 10 דקות כדי לשחרר תאים.</li>
	<li>פיצול באר אחת (1:2) לשתי בארות חדשות.</li>
	<li>לאסוף trophozoites מן הבארות הנותרות למטרות ניסיוניות. הערה: כל התרבויות מבוצעות בכפילות. עבור כל מצב, באר אחת משמשת למעבר, ו -1 משמשת לבידוד CERE.</li>
</ol>3. בידוד CERE מ Naegleria
<ol><li>חשב את מספר trophozoites בכל באר המשמש לבידוד CERE על ידי טריפאן כחול הרחקה צביעה hemocytometer23.</li>
	<li>מניחים את trophozoites בצינור 2.0 מ"ל.</li>
	<li>לשטוף trophozoites פעם ב 100 mM נתרן כלורי (pH 7.5) באמצעות צנטריפוגה (600 x גרם, 10 דקות, 4 ° C). הערה: נתרן כלורי מונע מהטרופוזואיטים להיצמד לדפנות הצינור.</li>
	<li>הסר את supernatant ו resuspend cell pellets ב 100 μL של 100 mM EDTA (pH 7.5).</li>
	<li>הניחו את הצינור בבלוק חום למשך 15 דקות בטמפרטורה של 98°C כדי לשקוע בתאים ולהשבית את האנזימים בטרופוזואיטים. הערה: שלב זה משבית DNases, אשר נמצאים בשפע ב Naegleria trophozoites. DNases עלול להפריע ליכולת לזהות CERE מקורי ואת השיבוט המולקולרי בשלב 4. תפוקת הדנ"א יורדת כאשר בשלב 3.4 משתמשים ביותר מ~3 x 106 תאים .</li>
	<li>צנטריפוגה את הצינורות במהירות הגבוהה ביותר (16,000 x גרם) ב 4 ° C במשך 10 דקות כדי להשליך את הפסולת.</li>
	<li>מעבירים את הסופרנאטנטים לצינור חדש.</li>
	<li>אתנול מזרז את supernatants עם 0.5 נפחים של 7.5 M אמוניום אצטט (pH 7.5), 3 נפחים של אתנול מוחלט, ו 1 μL של 10 מ"ג / מ"ל גליקוגן כנשא.</li>
	<li>הפוך את הצינור מספר פעמים ומקם את הצינור ב -80 ° C לפחות 1 שעה או לילה.</li>
	<li>מחממים את הדגימות לטמפרטורת החדר.</li>
	<li>צנטריפוגה את הצינורות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות ב 16,000 x גרם.</li>
	<li>מוציאים את הסופרנאטנט ושוטפים את הגלולה עם 70% אתנול בצנטריפוגה למשך 5 דקות במהירות של 16,000 x גרם (בטמפרטורת החדר).</li>
	<li>מוציאים אתנול ומייבשים את הגלולה באוויר למשך 5 דקות.</li>
	<li>יש להשהות מחדש את הגלולה המיובשת במים סטריליים שעברו דה-יוניזציה (DI). נרמול נפח ל 10,000 trophozoites לכל μL.</li>
	<li>יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש ב-PCR.</li>
</ol>4. זיהוי PCR של trophozoites שעבר טרנספורמציה
<ol><li>השתמש ב-20,000 תאים מקבילים לדנ"א, פריימרים של 600 ננומטר (טבלה 1) ו-Taq פולימראז ובצע את ה-PCR24. הערה: פריימרים המבחינים בין CERE מקורי לבין CERE משוכפל מפורטים בטבלה 1, וכך גם תנאי ה-PCR. איור 3 מראה את מיקום הפריימרים על המבנים. PCR ידרוש אופטימיזציה בהתאם לפריימרים המשמשים, כמו גם לתמהיל ה- PCR הספציפי בו נעשה שימוש.</li>
	<li>יש לחמם במיקרוגל 0.8% אגרוז בבסיס טריס אחד, חומצה אצטית וחיץ EDTA (TAE) עד להמסת האגרוז.</li>
	<li>מצננים את האגרוז ל~50 מעלות צלזיוס בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>יוצקים את התמיסה לתוך מגש יציקת ג'ל המכיל מסרק כדי ליצור בארות.</li>
	<li>הניחו לג'ל לשבת בטמפרטורת החדר עד להתייצבות.</li>
	<li>מניחים את הג'ל במנגנון האלקטרופורזה.</li>
	<li>יש להכניס 1x TAE לתא האלקטרופורזה עד לכיסוי הג'ל.</li>
	<li>הסירו את המסרק.</li>
	<li>הוסיפו 6x צבע (0.25% ברומפנול כחול, 0.25% קסילן ציאנול, 30% גליצרול) לדגימות והעמיסו את הג'ל. השתמש בסולם DNA כדי לקבוע את גודל מוצר ה- PCR.</li>
	<li>חבר את האלקטרודה, הפעל את ספק הכוח והפעל את הג'ל ב 80 V למשך ~ 1.5-2 שעות.</li>
	<li>כבה את החשמל והסר את הג'ל.</li>
	<li>הכתימו את הג'ל בצבע DNA (למשל, 10 μL של 10 מ"ג/מ"ל אתידיום ברומיד) ב-100 מ"ל של מי DI למשך 10 דקות.</li>
	<li>יש להכתים את הג'ל למשך 20 דקות במי DI.</li>
	<li>דמיינו ג'ל על מערכת אור אולטרה סגול (UV) ותיעדו את התוצאות.</li>
</ol>

שימוש בווקטור מבוסס CERE לטרנספקציה של Naegleria gruberi Trophozoites

<ol><li>De Jonckheere, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+do+we+know+by+now+about+the+genus+Naegleria%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Parasitol%22%5BJournal%5D)">What do we know by now about the genus Naegleria.</a> Exp Parasitol. 145, Suppl S2-S9 (2014).</li>
<li>De Jonckheere, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+century+of+research+on+the+Amoeboflagellate+genus+Naegleria%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Protozool%22%5BJournal%5D)">A century of research on the Amoeboflagellate genus Naegleria.</a> Acta Protozool. 41, 309-342 (2002).</li>
<li>Fulton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+differentiation+in+Naegleria+gruberi%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cell differentiation in Naegleria gruberi.</a> Annu Rev Microbiol. 31, 597-629 (1977).</li>
<li>Grace, E., Asbill, S., Virga, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naegleria+fowleri%3A+Pathogenesis%2C+diagnosis%2C+and+treatment+options%5BTitle%5D)+AND+%22AAC%22%5BJournal%5D)">Naegleria fowleri: Pathogenesis, diagnosis, and treatment options.</a> AAC. 59 (11), 6677-6681 (2015).</li>
<li>Moseman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Battling+brain-eating+amoeba%3A+enigmas+surrounding+immunity+to+Naegleria+fowleri%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Battling brain-eating amoeba: enigmas surrounding immunity to Naegleria fowleri.</a> PLOS Pathog. 16 (4), e1008406(2020).</li>
<li>Marciano-Cabral, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+Naegleria+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Biology of Naegleria spp.</a> Microbiol Rev. 52 (1), 114-133 (1988).</li>
<li>Piñero, J. E., Omaña-Molina, M., Chávez-Munguía, B., Lorenzo-Morales, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naegleria+fowleri%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Naegleria fowleri.</a> Trends Parasitol. 35 (10), 848-849 (2019).</li>
<li>Zysset-Burri, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+pathogenicity+factors+of+the+free-living+amoeba+Naegleria+fowleri%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of pathogenicity factors of the free-living amoeba Naegleria fowleri.</a> BMC Genomics. 15, 496-510 (2014).</li>
<li>Liechti, N., Schürch, N., Bruggmann, R., Wittwer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+Naegleria+lovaniensis%2C+the+basis+for+a+comparative+approach+to+unravel+pathogenicity+factors+of+the+human+pathogenic+amoeba+N.+fowleri%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genom%22%5BJournal%5D)">The genome of Naegleria lovaniensis, the basis for a comparative approach to unravel pathogenicity factors of the human pathogenic amoeba N. fowleri.</a> BMC Genom. 19, 654-665 (2018).</li>
<li>Liechti, N., Schürch, N., Bruggmann, R., Wittwer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopore+sequencing+improves+the+draft+genome+of+the+human+pathogenic+amoeba+Naegleria+fowleri%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Reports%22%5BJournal%5D)">Nanopore sequencing improves the draft genome of the human pathogenic amoeba Naegleria fowleri.</a> Sci Reports. 9, 16040-16049 (2019).</li>
<li>Fritz-Laylin, L. K., Ginger, M. L., Walsh, C., Dawson, S. C., Fulton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Naegleria+genome%3A+A+free-living+microbial+eukaryote+lends+unique+insights+into+core+eukaryotic+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Naegleria genome: A free-living microbial eukaryote lends unique insights into core eukaryotic cell biology.</a> Res Microbiol. 162, 607-618 (2011).</li>
<li>Clark, C. G., Cross, G. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rRNA+genes+of+Naegleria+gruberi+are+carried+exclusively+on+a+14-kilobase-pair+plasmid%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">rRNA genes of Naegleria gruberi are carried exclusively on a 14-kilobase-pair plasmid.</a> Mol Cell Biol. 7 (9), 3027-3031 (1987).</li>
<li>Clark, C. G., Cross, G. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+ribosomal+RNA+genes+are+a+general+feature+of+schizopyrenid+amoebae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Protozool%22%5BJournal%5D)">Circular ribosomal RNA genes are a general feature of schizopyrenid amoebae.</a> J Protozool. 35 (2), 326-329 (1988).</li>
<li>Dao, F. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identify+origin+of+replication+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+two-step+feature+selection+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Identify origin of replication in Saccharomyces cerevisiae using two-step feature selection technique.</a> Bioinformatics. 35 (12), 2075-2083 (2019).</li>
<li>Mullican, J. C., Chapman, N. M., Tracy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+genome+sequence+of+the+circular+extrachromosomal+element+of+Naegleria+gruberi+strain+EGB+ribosomal+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Announc%22%5BJournal%5D)">Complete genome sequence of the circular extrachromosomal element of Naegleria gruberi strain EGB ribosomal DNA.</a> Genome Announc. 6 (6), e00020-e00021 (2018).</li>
<li>Mullican, J. C., Drescher, K. M., Chapman, N. M., Tracy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+genome+sequence+of+the+Naegleria+fowleri+%28strain+LEE%29+closed+circular+extrachromosomal+ribosomal+DNA+element%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Resource+Announce%22%5BJournal%5D)">Complete genome sequence of the Naegleria fowleri (strain LEE) closed circular extrachromosomal ribosomal DNA element.</a> Microbiol Resource Announce. 9 (49), e01055(2020).</li>
<li>Nguyen, B. T., Chapman, N. M., Tracy, S., Drescher, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extrachromosomal+elements+of+the+Naegleria+amoebae%3A+How+little+we+know%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">The extrachromosomal elements of the Naegleria amoebae: How little we know.</a> Plasmid. 115, 102567(2021).</li>
<li>Nguyen, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+sequence+of+the+closed+circular+extrachromosomal+element+%28CERE%29+of+Naegleria+australiensis+De+Jonckheere+%28strain+PP+397%29%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Resource+Announce%22%5BJournal%5D)">Complete sequence of the closed circular extrachromosomal element (CERE) of Naegleria australiensis De Jonckheere (strain PP 397).</a> Microbiol Resource Announce. 12, e0032123(2023).</li>
<li>Nguyen, B. T., Chapman, N. M., Stessman, H. A. F., Tracy, S., Drescher, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+sequence+of+the+closed+circular+extrachromosomal+element+of+Naegleria+jadini+Willaert+and+Ray+%28Strain+ITMAP400%29%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Resource+Announce%22%5BJournal%5D)">Complete sequence of the closed circular extrachromosomal element of Naegleria jadini Willaert and Ray (Strain ITMAP400).</a> Microbiol Resource Announce. 12 (4), 0006123(2023).</li>
<li>Nguyen, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+sequence+of+the+closed+circular+extrachromosomal+element+%28CERE%29+of+Naegleria+pringsheimi+De+Jonckheere+%28strain+Singh%29%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Resource+Announce%22%5BJournal%5D)">Complete sequence of the closed circular extrachromosomal element (CERE) of Naegleria pringsheimi De Jonckheere (strain Singh).</a> Microbiol Resource Announce. 13 (4), (2024).</li>
<li>Mullican, J. C., Chapman, N. M., Tracy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+single+origin+of+replication+in+the+Naegleria+gruberi+extrachromosomal+DNA+element%5BTitle%5D)+AND+%22Protist%22%5BJournal%5D)">Mapping the single origin of replication in the Naegleria gruberi extrachromosomal DNA element.</a> Protist. 170, 141-152 (2019).</li>
<li>Sohn, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+liquid+media+for+encystation+of+pathogenic+free-living+amoebae%5BTitle%5D)+AND+%22Korean+J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Efficient liquid media for encystation of pathogenic free-living amoebae.</a> Korean J Parasitol. 55 (3), 233-238 (2017).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Curr Protoc Immunol. 111, 1-3 (2001).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+Chain+Reaction%3A+Basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Polymerase Chain Reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> J Vis Exp. (63), e3998(2012).</li>
<li>Jeong, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+nfa1+gene+cloned+from+pathogenic+Naegleria+fowleri+in+non-pathogenic+N.+gruberi+enhances+cytotoxicity+against+CHO+target+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Expression of the nfa1 gene cloned from pathogenic Naegleria fowleri in non-pathogenic N. gruberi enhances cytotoxicity against CHO target cells in vitro.</a> Infect Immun. 73 (7), 4098-4105 (2005).</li>
<li>Clark, C. G., Cross, G. A. M., De Jonckheere, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+evolutionary+divergence+in+the+genus+Naegleria+by+analysis+of+ribosomal+DNA+plasmid+restriction+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of evolutionary divergence in the genus Naegleria by analysis of ribosomal DNA plasmid restriction patterns.</a> Mol Biochem Parasitol. 34 (3), 281-296 (1989).</li>
<li>De Jonckheere, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+variation+in+the+ribosomal+internal+transcribed+spacers%2C+including+the+5.8S+rDNA%2C+of+Naegleria+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Protist%22%5BJournal%5D)">Sequence variation in the ribosomal internal transcribed spacers, including the 5.8S rDNA, of Naegleria spp.</a> Protist. 149 (3), 221-228 (1998).</li>
<li>Rawal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+prediction+of+G4+DNA+as+regulatory+motifs%3A+Role+in+Escherichia+coli+global+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Genome-wide prediction of G4 DNA as regulatory motifs: Role in Escherichia coli global regulation.</a> Genome Res. 16 (5), 644-655 (2006).</li>
<li>Yadav, V. K., Abraham, J. K., Mani, P., Kulshrestha, R., Chowdhury, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QuadBase%3A+Genome-wide+database+of+G4+DNA+-+occurrence+and+conservation+in+human%2C+chimpanzee%2C+mouse+and+rat+promoters+and+146+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">QuadBase: Genome-wide database of G4 DNA - occurrence and conservation in human, chimpanzee, mouse and rat promoters and 146 microbes.</a> Nucleic Acids Res. 36, D381-D385 (2007).</li>
</ol>

לא הוכרז על ניגוד עניינים כספי.

הפרוטוקול המתואר כאן הוא פשוט מאוד, אם כי סביר להניח שכל מבנה ידרוש מידה מסוימת של אופטימיזציה, במיוחד של יחס מגיב DNA-transfection, בהתאם לאופי המבנה והמין של Naegleria בשימוש. בדקנו רק מגיב טרנספקציה אחד זמין מסחרית באמצעות פרוטוקול זה, אך סביר להניח שכמה אחרים עשויים להיות יעילים. בהתחשב בכך שיבוט באורך מלא של CERE משמש, המכיל מקור פונקציונלי של שכפול ובכך לשכפל באופן אוטונומי, המבנה מחזיק בכל מכונות השכפול האיקריוטיות הדרושות. אם שיבוט חלקי היה מוכנס לווקטור pGEM, השיבוט הנגוע היה צפוי ללכת לאיבוד זמן קצר מא...

הסוג Naegleria מכיל מעל 45 מינים, אם כי לא סביר שכל בני המין זוהו1. Naegleria יכול להתקיים בצורות שונות: כמו trophozoites (אמבות), כמו flagellates, או, כאשר המשאבים מוגבלים מאוד, כמו ציסטות 1,2,3,4. הסוג Naegleria מוכר בזכות מין אחד מסוכן במיוחד, Naegleria fowleri, המכונה "אמבה אוכלת מוח" (נסקר ב-1,2,3,4,5,6,7), שהיא הגורם לדלקת קרום המוח האמבית הראשונית הקטלנית כמעט באופן אוניברסלי.
Naegleria מקודדים את rDNA שלהם על CERE הממוקם בגרעין. ריצוף מלא של הגנום של שלושה מיני Naegleria מאשר את היעדר rDNA בגנום הגרעיני 8,9,10,11. בהתבסס על רצפי CERE מוגבלים באורך מלא, אורך CERE נע בין 10 kbp ל- 18 kbp בקירוב. CERE מכל מין של Naegleria נושא rDNA cistron יחיד (המכיל את ה- DNA הריבוזומלי 5.8, 18 ו- 28S) על כל אחד מכ- 4,000 CERE לכל תא 12,13,14. מלבד rDNA, לכל CERE יש רצף גדול שאינו rDNA (NRS). גדלי CERE משתנים בין מינים; ההבדלים נובעים בעיקר מהאורך המשתנה של ה-NRS, שכן רצפי ה-rDNA שמורים מאוד בסוג 1,15,16,17,18,19,20. המיפוי של מקור יחיד של שכפול DNA בתוך N. gruberi CERE NRS21 מספק תמיכה חזקה להשערה כי Naegleria CERE משכפל ללא תלות בגנום הגרעיני.
N. gruberi היא אמבה לא פתוגנית המשמשת לעתים קרובות לחקר ביולוגיה Naegleria . פיתחנו מתודולוגיה לשינוי N . gruberi trophozoites עם שיבוט CERE מאותו מין כדי לבחון את ההשערה כי Naegleria amoebae לסבול ולשכפל באופן עצמאי CERE בתוך trophozoites. זה הושג על ידי הפיכת N. gruberi עם שיבוט באורך מלא של N. gruberi CERE לטרופוזואיטים ובעקבות גורלו של שיבוט CERE התורם על ידי תגובת שרשרת פולימראז (PCR). סקירה כללית של הפרוטוקול מתוארת באיור 1. הנתונים המוצגים כאן מראים כי ניתן לאתר את השיבוט התורם באמצעות לפחות שבעה מעברים בתרבית רקמה, כמו גם להישמר באמצעות אנציסטמנט וריגוש. מחקרים אלה מהווים את הבסיס לאמצעי לנתח כיצד CERE משתכפל, כמו גם לחקור את השימוש בו כווקטור כדי להדביק Naegleria.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Bio Rad</td><td>161-3102</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום אצטט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A-7330</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלורי</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>C-4901</td><td></td></tr><tr><td>צלוחיות תרבית</td><td></td> קרח <td></td> כתוש, צלחת תרבית T-75 Thermo Scientific 130190<td></td></tr><tr><td></td>, 6 בארות קורנינג 3506 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D-4527</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 0.5 מ'</td><td>Affymetrix</td><td>15694</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר ג'ל אלקטרופרזיס</td><td>אמרשם ביוסיינסס</td><td>80-6052-45</td><td></td></tr><tr><td>צינורות אפנדורף, 1.5 מ"ל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>צינורות אפנדורף, 2 מ"ל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>05-408-138</td><td></td></tr><tr><td>אתנול, 100%</td><td>Decon Laboratories</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>אתידיום ברומיד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>E-8751</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Gibco</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>חומצה פולית</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>F7876-25G</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Plus סולם</td><td>תרמו מדעי</td><td>SM1331</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית קרחונית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>UN2789</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq ירוק PCR מאסטר מיקס</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>חימום בלוק</td><td>תרמו מדעי</td><td>88871001</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>1483</td><td></td></tr><tr><td>Hemin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51280</td><td></td></tr><tr><td>ברזל כלוריד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>372870-256</td><td></td></tr><tr><td>ליגאז</td><td>NEB</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>Magneisum Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>MySpin 12</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>Nikon</td><td>TMS</td><td></td></tr><tr><td>N. gruberi</td><td>ATCC</td><td>30224</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nucleic Chem Impex Int' l</td><td>#01625</td><td></td></tr><tr><td>פפטון</td><td>גיבקו</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>pGEM</td><td>Promega</td><td>P2251</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P0662-500G</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac HC אלקטרופרזיס יחידת אספקת חשמל</td><td>ביו ראד</td><td>1645052</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>MCB ריאגנטים</td><td>SX0420</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט, דו-בסיסי</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2554</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה שולחנית</td><td>eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>Tris, בסיס</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>טריפן כחול, 0.4%</td> <td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>ViaFect Reagent</td><td>Promega</td><td>E4981</td><td></td></tr><tr><td>משקל</td><td>משקל Denver Instruments</td><td>APX-60</td><td></td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>גיבקו</td><td>212750</td><td></td></tr></tbody></table>

טרנספקציה של שיבוט מולקולרי של naegleria gruberi rdna לתוך n. gruberi trophozoites

Transfection of a Molecular Clone of Naegleria gruberi rDNA into N. gruberi Trophozoites

כל הגנים הריבוזומליים של Naegleria trophozoites נשמרים ב-DNA ריבוזומלי חוץ-כרומוזומלי סגור (rDNA) המכיל יסוד (CERE). בעוד שמעט ידוע על CERE, ניתוח רצף גנום מלא של שלושה מיני Naegleria מראה בבירור כי אין rDNA cistrons בגנום הגרעיני. יתר על כן, מקור DNA יחיד של שכפול מופה ב- N. gruberi CERE, מה שתומך בהשערה כי CERE משתכפל ללא תלות בגנום הגרעיני. מאפיין CERE זה מצביע על כך שייתכן שניתן יהיה להשתמש ב- CERE מהונדס כדי להחדיר חלבונים זרים לטרופוזואיטים Naegleria . כצעד הראשון בחקר השימוש ב-CERE כווקטור בנגלריה, פיתחנו פרוטוקול להעתקת N. gruberi עם שיבוט מולקולרי של N. gruberi CERE המשובט לתוך pGEM7zf+ (pGRUB). לאחר הטרנספקציה, pGRUB זוהה בקלות ב- N. gruberi trophozoites במשך שבעה קטעים לפחות, כמו גם באמצעות אנציסטמנט והתרגשות. כביקורת, טרופוזואיטים הודבקו בווקטור עמוד השדרה, pGEM7zf+, ללא רצפי N. gruberi (pGEM). pGEM לא זוהה לאחר המעבר הראשון לאחר טרנספקציה לתוך N. gruberi, מה שמצביע על חוסר יכולתו להשתכפל באורגניזם אאוקריוטי. מחקרים אלה מתארים פרוטוקול טרנספקציה עבור Naegleria trophozoites ומראים כי רצף פלסמיד חיידקי ב- pGRUB אינו מעכב העברה ושכפול מוצלחים של שיבוט CERE הנגוע. יתר על כן, פרוטוקול טרנספקציה זה יהיה קריטי להבנת הרצף המינימלי של CERE המניע את השכפול שלו בטרופוזואיטים, כמו גם בזיהוי אזורים רגולטוריים ברצף הלא ריבוזומלי (NRS).

PCR של טרופוזואיטים שעברו טרנספורמציה עם pGRUB מדגים שה-CERE הנגוע מזוהה דרך לפחות שבעה מעברים של הטרופוזואיטים, כמו גם אנציסטמנט והתרגשות (איור 4). הפריימרים המשמשים ב-PCR מתאימים הן לווקטור pGEM והן לרצף CERE, ובכך מבטיחים שה-PCR לא יזהה CERE מקורי. PCR בעקבות טרנספקציה של pGEM לטרופוזואיטים הצביע על כך ש-pGEM היה שלילי (איור 4), מה שמצביע על כך שהפלסמיד הריק לא נשמר על ידי האמבות. איור 4 מראה ש-pGEM אבד בקטע הראשון – הקטעים הבאים...

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה להעברת טרופוזואיטים Naegleria gruberi עם מבנה הנשמר לאורך טרופוזואיטים חולפים במבחנה, כמו גם באמצעות אנציסטמנט והתרגשות.

טרנספקציה של שיבוט מולקולרי של Naegleria gruberi rDNA לתוך N. gruberi Trophozoites

All ribosomal genes of Naegleria trophozoites are maintained in a closed circular extrachromosomal ribosomal DNA (rDNA) containing element (CERE). While ...

transfection-molecular-clone-naegleria-gruberi-rdna-into-n-gruberi

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

טכניקה זו ממחישה דרך יעילה כדי להכין את השכפול פגום מניות retroviral קידוד oncogene אדם, לאחר מכן נעשה שימוש לזירוז המחלה myeloproliferative במודל עכבר.

הפקה של רטרווירוס שכפול פגומים-by transfection חלוף של תאים 293T

Transfection אסטרטגיה אופטימיזציה עבור הביטוי הקלטה של ​​אלקטרו Voltage-מגודרת ערוצי רקומביננטי יון ב HEK-293T תאים

אנו מציגים תפוקה גבוהה פרוטוקול אופטימיזציה שלנו nucleofection כדרך יעילה של transfecting העיקרי האדם מונוציטים הנגזרות תאים דנדריטים עם ה-DNA או פלסמיד siRNA או ללא גרימת התבגרות התא. בנוסף, אנו מספקים ראיות השתקת siRNA מוצלח של הגן ממוקד חבל, אני ב-mRNA והן רמות החלבון.

פרוטוקול אופטימיזציה עבור transfection יעילה של תאים דנדריטים ללא ההבשלה Cell

אנו מתארים שיבוט מולקולרי של הנגיף maedi-visna המבטא GFP ו מדבק לחלוטין. שכפול של וירוס זה ניתן לגילוי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ו cytometry הזרימה.

הפצת ועל גילוי Clone מולקולרית זיהומיות של וירוס Maedi-visna המבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק

טכניקה זו מספקת שיטה לקצור, לנרמל ולכמת צמיחה תאית של חיידקים פתוגנים כי הם מראש מעובדים בתאי פונדקאי protozoan טבעיים לפני הזיהומים של תאי יונקים. שיטה זו יכולה להיות שונה כדי להתאים מגוון רחב של תאי מארח לבמה יחול כמו גם סוגי תאי היעד.

זיהומים של תאי יונקים צייתנים עם חיידקי protozoan דרוך-

כאן אנו מדווחים שיטה לשימוש בסוג I וסוג...

מניפולציה גנטית ב<em&gt; Δku80</em&gt; זנים לאנליזה גנומית תפקודית של<em&gt; Toxoplasma gondii</em

הגירת neuroblast היא צעד חיוני בנוירוגנזה לאחר לידה. הפרוטוקול מתואר כאן ניתן להשתמש בם כדי לחקור את התפקיד של רגולטורים מועמד של הגירת neuroblast ידי העסקת nucleofection DNA / RNA סיכת הראש קטן (shRNA) וassay הגירת 3D עם neuroblasts מבודדת מהזרם הנודדות מקורי לאחר הלידה המכרסם.

Nucleofection של neuroblasts מכרסמים לחקר הגירת neuroblast<em&gt; במבחנה</em

תאי גליומה GL261 מספקים מודל שימושי של בעלי חיים בעלי יכולת חיסונית של גליובלסטומה. מטרות פרוטוקול זה הן להדגים טכניקות מתאימות לניטור צמיחת גידול תוך גולגולתי באמצעות הדמיית ביולומינסנציה in vivo, ולאמת את התועלת של תאי GL261 שעברו שינוי בלוציפראז לחקר אימונולוגיה של גידול וגישות אימונותרפיות לטיפול בגליובלסטומה.

הדמיה פליטת אור של דגם עם מערכת חיסון בבעלי חיים לגליובלסטומה

כאן, סיפקנו שיטה כדי להשיג שינוי יציב של העוף Eimeria טפילים על-ידי נוקלאונופיטים sporozoites או הדור השני merozoites. טפילים מהונדסים גנטית שונה ביטוי הטרוולוגי הגנים ניתן להשתמש ככלי משלוח החיסון.

נוקלאופלוט ובהפצת Vivo של העופות האימריריה טפילים

מלריה מועברת באמצעות חיסון של שלב sporozoite של פלסמודיום על ידי יתושים נגועים. פלסמודיום מהונדס איפשר לנו להבין טוב יותר את הביולוגיה של המלריה ותרם ישירות למאמצי פיתוח החיסון למלריה. כאן, אנו מתארים מתודולוגיה יעילה ליצירת פלסמודיום ברגהיי sporozoites מהונדס.

יצירת פלסמודיום מהונדס גנטית ברגהיי ספורוזואיטים

וירוס רקומביננטי הקשור באדנו (rAAV) נמצא בשימוש נרחב להעברת גנים קליניים ופרה-קליניים. שימוש לא מוערך מספיק עבור rAAVs הוא התמרה חזקה של תאים בתרבית ללא צורך בטיהור. עבור חוקרים חדשים ב-rAAV, אנו מספקים פרוטוקול לשיבוט קלטות טרנסגניות, ייצור וקטורים גולמיים והתמרה של תרביות תאים.

ביטוי טרנסגנים בתאים בתרבית באמצעות וקטורים נגיפיים רקומביננטיים לא מטוהרים הקשורים באדנו

חקור שיטת טרנספקציה יציבה ל-Naegleria gruberi טרופוזואיטים באמצעות רכיבי CERE מעגולים חוץ-כרומוזומיים. הפרוטוקול מאפשר שימור DNA זר במעברים תרביתיים ובמחזורי אנקיסטמנט-אקסיסטמנט.

טרנספקציה של שיבוט מולקולרי של Naegleria gruberi rDNA לתוך N. gruberi Trophozoites

גלה סרטונים נוספים