מבחן במבחנה לחקר נדידת טסיות הדם באמצעות קשירה של אבידין-ביוטין מתפקדת RGD

טסיות דם חיוניות במניעת אובדן דם לאחר פגיעה בכלי הדם, להילחם בזיהומים ולשמור על שלמות כלי הדם במהלך דלקת. בעוד שתקעים המוסטטיים דורשים הפעלה וצבירה קולקטיבית של טסיות דם, תפקידם בהגנה על כלי הדם המודלקים מבוצע ברמת התא הבודד. בהקשר זה, מחקרים אחרונים מצאו כי טסיות דם יכולות לנדוד באופן אוטונומי, תהליך התלוי בחישה מכנית של המיקרו-סביבה הדביקה שלהן.

גישה זו מאפשרת בקרה מדויקת על תכונות הדבק של המצע ומשמשת כבדיקה חוץ גופית פשוטה לחקר המנגנונים העומדים בבסיס נדידת טסיות הדם. התוצאות מצביעות על כך שטסיות נודדות נקשרות לליגנדים של אינטגרין יכולות להפעיל כוח המסוגל לשבש את הקשר אבידין-ביוטין. בדיקה זו מספקת שיטה פשוטה ואמינה להמחשת נדידת טסיות הדם.

בשילוב עם הדמיית תאים חיים, זה יעזור לנו להבין טוב יותר את יחסי הגומלין והוויסות של רכיבי שלד תאים שונים בתפקוד טסיות חשוב זה. כדי להתחיל, כיסוי זכוכית סוניקט מחליק פנימה 20% חומצה חנקתית למשך דקה אחת, ואחריו סוניקציה באיזופרופנול, אתנול ומים למשך דקה אחת כל אחד. טפל בהחלקות הכיסוי הנקיות מראש עם פלזמת חמצן במנקה פלזמה למשך שתי דקות, ולאחר מכן הרכיב אותן עם שקופיות דביקות.

כעת מלאו את התעלה ב -2.5 מיקרוליטר של PLL-PEG-ביוטין מדולל ב -97.5 מיקרוליטר PLL-PEG ודגרו במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, ואז שטפו שלוש פעמים עם PBS. לאחר מכן, הוסיפו 100 מיקרוליטר של neutravidin-FITC ודגרו במשך 30 דקות בחושך בטמפרטורת החדר, ואז שטפו שלוש פעמים עם PBS. לבסוף, הוסיפו 100 מיקרוליטר של ביוטין cyclo-RGD, דגרו במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ושטפו שלוש פעמים עם PBS.

לאחר הרדמת העכבר והסרת עור בית החזה, הכנס את המחט בין הצלעות השנייה והשלישית בצד שמאל של עצם החזה כדי לשאוב דם מהלב. מערבבים את הדם עם מיליליטר אחד של המאגר והצנטריפוגה של טירוד ב-70 גרם למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר כשהבלם כבוי, ואז לוקחים את החלק העליון המכיל פלזמה עשירה בטסיות. מערבבים עם שלושה מיליליטר של חוצץ Tyrode ומוסיפים 100 ננוגרם למיליליטר פרוסטציקלין כדי למנוע הפעלת טסיות דם.

לאחר מכן, צנטריפוגה בחום של 1200 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הכדור ב-500 מיקרוליטר של המאגר של טירוד. לאחר מכן, בעזרת המוציטומטר, מדוד את ספירת טסיות הדם.

כדי להתחיל, קחו טסיות דם של עכברים בתעלות ציפוי cRGD של ביוטין-נויטרווידין-ביוטין והקליטו נדידת טסיות חיות באמצעות מיקרוסקופ הפוך המצויד באינקובטור במה. כדי לספור את מספרי ההידבקות או ההעברה של טסיות הדם, לחץ לחיצה ימנית על התפריט הנפתח של כלי הנקודות בסרגל הכלים ובחר בכלי מרובה הנקודות. חלץ את מרחק הנדידה מדגימות קבועות על ידי מדידת אורך נתיב הנדידה המוטבע בציפוי neutravidin-FITC.

לחץ לחיצה ימנית על התפריט הנפתח של כלי הקו הישר בסרגל הכלים ובחר בכלי קו היד החופשי. כדי לכמת את צורת טסיות הדסיות, בחרו 'תמונה', 'כוונן' ו'סף' בסרגל הכלים ליצירת מסיכות בינאריות באמצעות פילוח טסיות פלואורסצנטיות. בחר מתארי צורה ב-Analyze and Set Measurements, ולאחר מכן בחר Display Results using Analyze and Analyze Particles.

טסיות הדם הראו נדידה אופטימלית בריכוז של 2.5% PLL-PEG-ביוטין. הנדידה הופחתה בצפיפות ליגנד נמוכה וגבוהה יותר. טסיות הדם מתפשטות בצורה לא מספקת בצפיפות ליגנד של 1%, המסומנת על ידי שטח והיקף נמוכים, מה שמרמז על הפעלת אינטגרין לא מספקת.

בצפיפות של 2.5% ליגנד, טסיות הדם מתפשטות ביעילות, משבשות את ליגנדות cRGD ונודדות. צפיפות ליגנד גבוהה גרמה לטסיות להתפשט ללא קיטוב, מה שהפחית את הנדידה עקב כישלון לשבור ליגנדים cRGD.