Name: כימות מוות תאי הנגרם על ידי ציטוקינים באורגנואידים של המעי הגס האנושי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי חי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-02T13:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: חקור מנגנוני מוות תאי באורגנואידים של המעי הגס האנושי בתגובה לציטוקינים דלקתיים. שיטה זו משתמשת במיקרוסקופ פלואורסצנטי חי לכימות תגובות ברמת אורגנואיד בודד.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות למטופלים על הסכמתם מדעת והשתתפותם במחקר, ולצוות הקליני על עזרתם המצוינת. איור 1A נוצר באמצעות BioRender.com. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מקרן המדע אירלנד - כלומר פרס פיתוח קריירה (CDA) ל- K.N. (SFI-13 / CDA / 2171), מענק מרכז מחקר (SFI-12 / RC / 2273), ופרס דיבר מרכז מחקר (SFI-14 / SP / 2710) ל- APC Microbiome אירלנד. פ.פ. קיבל מימון גם מ-SFI/20/RP/9007.

כימות מוות תאי בקולונידים אנושיים בתגובה להפרעות ציטוטוקסיות

<ol><li>Patankar, J. V., Becker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+in+the+gut+epithelium+and+implications+for+chronic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Cell death in the gut epithelium and implications for chronic inflammation.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 17 (9), 543-556 (2020).</li>
<li>Zeissig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulation+of+epithelial+apoptosis+and+barrier+repair+in+active+Crohn%27s+disease+by+tumour+necrosis+factor+alpha+antibody+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Downregulation of epithelial apoptosis and barrier repair in active Crohn's disease by tumour necrosis factor alpha antibody treatment.</a> Gut. 53 (9), 1295-1302 (2004).</li>
<li>Bartee, E., Mcfadden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+synergy%3A+An+underappreciated+contributor+to+innate+anti-viral+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Cytokine synergy: An underappreciated contributor to innate anti-viral immunity.</a> Cytokine. 63 (3), 237-240 (2013).</li>
<li>Fish, S. M., Proujansky, R., Reenstra, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+effects+of+interferon+%CE%B3+and+tumour+necrosis+factor+%CE%B1+on+T84+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Synergistic effects of interferon γ and tumour necrosis factor α on T84 cell function.</a> Gut. 45 (2), 191-198 (1999).</li>
<li>Wakisaka, Y., Sugimoto, S., Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+medicine+for+Inflammatory+Bowel+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Organoid medicine for Inflammatory Bowel Disease.</a> Stem Cells. 40 (2), 123-132 (2022).</li>
<li>Flood, P., Hanrahan, N., Nally, K., Melgar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+intestinal+organoids%3A+Modeling+gastrointestinal+physiology+and+immunopathology+-+current+applications+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human intestinal organoids: Modeling gastrointestinal physiology and immunopathology - current applications and limitations.</a> Eur J Immunol. 54 (2), e2250248(2024).</li>
<li>Matsuzawa-Ishimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intestinal+organoid-based+platform+that+recreates+susceptibility+to+t-cell-mediated+tissue+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">An intestinal organoid-based platform that recreates susceptibility to t-cell-mediated tissue injury.</a> Blood. 135 (26), 2388-2401 (2020).</li>
<li>Lee, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+responses+to+IL-17+in+adult+stem+cell-derived+human+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Crohns+Colitis%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial responses to IL-17 in adult stem cell-derived human intestinal organoids.</a> J Crohns Colitis. 16 (12), 1911-1923 (2022).</li>
<li>Woznicki, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-%CE%B1+synergises+with+IFN-%CE%B3+to+induce+caspase-8-JAK1%2F2-STAT1-dependent+death+of+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">TNF-α synergises with IFN-γ to induce caspase-8-JAK1/2-STAT1-dependent death of intestinal epithelial cells.</a> Cell Death Dis. 12 (10), 864(2021).</li>
<li>Flood, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sensor-associated+type+I+interferon+signaling+is+increased+in+ulcerative+colitis+and+induces+jak-dependent+inflammatory+cell+death+in+colonic+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">DNA sensor-associated type I interferon signaling is increased in ulcerative colitis and induces jak-dependent inflammatory cell death in colonic organoids.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 323 (5), G439-G460 (2022).</li>
<li>Grabinger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+culture+of+intestinal+crypt+organoids+as+a+model+system+for+assessing+cell+death+induction+in+intestinal+epithelial+cells+and+enteropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Ex vivo culture of intestinal crypt organoids as a model system for assessing cell death induction in intestinal epithelial cells and enteropathy.</a> Cell Death Dis. 5 (5), e1228(2014).</li>
<li>Bode, K. J., Mueller, S., Schweinlin, M., Metzger, M., Brunner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast+and+simple+fluorometric+method+to+detect+cell+death+in+3D+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A fast and simple fluorometric method to detect cell death in 3D intestinal organoids.</a> Biotechniques. 67 (1), 23-28 (2019).</li>
<li>Mertens, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-repurposing+screen+on+patient-derived+organoids+identifies+therapy-induced+vulnerability+in+KRAS-mutant+colon+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Drug-repurposing screen on patient-derived organoids identifies therapy-induced vulnerability in KRAS-mutant colon cancer.</a> Cell Rep. 42 (4), 112324(2023).</li>
<li>Vandussen, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+enhanced+human+gastrointestinal+epithelial+culture+system+to+facilitate+patient-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays.</a> Gut. 64 (6), 911-920 (2015).</li>
<li>Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+and+genetic+modification+of+gastrointestinal+stem+cells+in+spheroid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture.</a> Nat Protoc. 8 (12), 2471-2482 (2013).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Woznicki, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+BCL-G+regulates+secretion+of+inflammatory+chemokines+but+is+dispensable+for+induction+of+apoptosis+by+IFN-%CE%B3+and+TNF-%CE%B1+in+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Human BCL-G regulates secretion of inflammatory chemokines but is dispensable for induction of apoptosis by IFN-γ and TNF-α in intestinal epithelial cells.</a> Cell Death Dis. 11 (1), 68(2020).</li>
<li>Edgar, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture-associated+DNA+methylation+changes+impact+on+cellular+function+of+human+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Culture-associated DNA methylation changes impact on cellular function of human intestinal organoids.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 14 (6), 1295-1310 (2022).</li>
<li>Mubaid, F., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Less+is+more%3A+Longer+exposure+times+with+low+light+intensity+is+less+photo-toxic%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Today%22%5BJournal%5D)">Less is more: Longer exposure times with low light intensity is less photo-toxic.</a> Microscopy Today. 25 (6), 26-35 (2017).</li>
<li>Ziegler, U., Groscurth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+features+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22News+Physiol+Sci%22%5BJournal%5D)">Morphological features of cell death.</a> News Physiol Sci. 19 (3), 124-128 (2004).</li>
<li>Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+changes+during+programmed+cell+deaths%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane changes during programmed cell deaths.</a> Cell Res. 28 (1), 9-21 (2018).</li>
<li>Tamura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+anticancer+agents+using+patient-derived+tumor+organoids+characteristically+similar+to+source+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol+Rep%22%5BJournal%5D)">Evaluation of anticancer agents using patient-derived tumor organoids characteristically similar to source tissues.</a> Oncol Rep. 40 (2), 635-646 (2018).</li>
<li>Karki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergism+of+TNF-%CE%B1+IFN-%CE%B3+triggers+inflammatory+cell+death%2C+tissue+damage%2C+and+mortality+in+SARS-CoV-2+infection+and+cytokine+shock+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Synergism of TNF-α IFN-γ triggers inflammatory cell death, tissue damage, and mortality in SARS-CoV-2 infection and cytokine shock syndromes.</a> Cell. 184 (1), 149-168 (2021).</li>
<li>Geary, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+synergy%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Understanding synergy.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 304 (3), E237-E253 (2013).</li>
<li>Duarte, D., Vale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+synergism+in+drug+combinations+and+reference+models+for+future+orientations+in+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Res+Pharmacol+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Evaluation of synergism in drug combinations and reference models for future orientations in oncology.</a> Curr Res Pharmacol Drug Discov. 3, 100110(2022).</li>
<li>Wong, F. C., Woo, C. C., Hsu, A., Tan, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anti-cancer+activities+of+Vernonia+amygdalina+extract+in+human+breast+cancer+cell+lines+are+mediated+through+caspase-dependent+and+p53-independent+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The anti-cancer activities of Vernonia amygdalina extract in human breast cancer cell lines are mediated through caspase-dependent and p53-independent pathways.</a> PLoS One. 8 (10), e78021(2013).</li>
<li>Ryall, K. A., Tan, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+biology+approaches+for+advancing+the+discovery+of+effective+drug+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cheminform%22%5BJournal%5D)">Systems biology approaches for advancing the discovery of effective drug combinations.</a> J Cheminform. 7, 7(2015).</li>
<li>Sukho, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cell+seeding+density+and+inflammatory+cytokines+on+adipose+tissue-derived+stem+cells%3A+An+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev+Rep%22%5BJournal%5D)">Effect of cell seeding density and inflammatory cytokines on adipose tissue-derived stem cells: An in vitro study.</a> Stem Cell Rev Rep. 13 (2), 267-277 (2017).</li>
<li>Vaughan-Jackson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Density+dependent+regulation+of+inflammatory+responses+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Density dependent regulation of inflammatory responses in macrophages.</a> Front Immunol. 13, 895488(2022).</li>
<li>Lumibao, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+extracellular+matrix+on+the+precision+medicine+utility+of+pancreatic+cancer+patient-derived+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">The impact of extracellular matrix on the precision medicine utility of pancreatic cancer patient-derived organoids.</a> bioRxiv. , 10.1101/2023.01.26.525757 (2023).</li>
<li>Lee, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-%CE%B1+induces+LGR5%2B+stem+cell+dysfunction+in+patients+with+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">TNF-α induces LGR5+ stem cell dysfunction in patients with Crohn's disease.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 13 (3), 789-808 (2022).</li>
</ol>

ק.נ. קיבלה מימון מחקר מחברת AbbVie Inc. בזמן השלמת העבודה. מימון זה היה במסגרת פרס של מרכז מחקר (SFI-14/SP/2710) ל-APC Microbiome Ireland.

פותחו מספר שיטות לניתוח כמותי של מוות תאי באורגנואידים במעי. בחינת השיבוש במורפולוגיית אורגנואיד המעי על ידי מיקרוסקופ אור היא גישה פשוטה לכימות ההשפעות של חומרים ציטוטוקסיים11. עם זאת, שינויים מורפולוגיים אינם מדידה ישירה של מוות תאי, והשיטה היא כמותית למחצה בלבד. שיטה נוספת היא להעריך פעילות מטבולית אורגנואידית באמצעות בדיקת MTT או ATP10,11. חשוב לציין כי בדיקות אלה יכולות לקבוע רק שינויים בכדאיות התא ויש לאמת אותן באמצעות בדיקת מוות תאי. בדיקות מוות פלואורומטריות אחרות של תאים באמצעות צבעים קושרי DNA דווחו12,13. גישה ללא הדמיה באמצעות קורא מיקרו-לוחות פלואורסצנטי אפשרית ומאפשרת תפוקה גבוהה12. עם זאת, שיטה זו מודדת את האות הממוצע של באר שלמה, מה שהופך אותה ללא מתאימה לאוכלוסיות הטרוגניות. זה גם דורש שימוש בקורא microplate עם התאמת גובה Z. ניתן להשתמש בטכניקות מבוססות הדמיה פלואורסצנטית לניתוח אורגנואיד יחיד וללכידת נתונים תאיים/תת-תאיים ומורפולוגיים. מערכות הדמיה קונפוקליות אוטומטיות בעלות תוכן גבוה (HCI) יכולות להפיק כמויות גדולות של נתונים בתפוקה גבוהה13. למרבה הצער, HCI קונפוקלי זקוק לציוד מיוחד, משתמש בפרוטוקולים מורכבים, בדרך כלל דורש תוכנת ניתוח תמונה מסחרית, והוא יקר.
הפרוטוקול שלנו לניתוח כמותי של מוות תאי קולונואיד במספר נקודות זמן הוא פשוט, פשוט וזול. עם זאת, בהשוואה למערכות HCI אוטומטיות וקורא צלחות, היא גוזלת זמן ומפחיתה את התפוקה. מגבלה נוספת של השיטה שלנו היא השימוש בשדה רחב לעומת מיקרוסקופיה קונפוקלית. מיקרוסקופ קונפוקלי מתאים יותר להדמיית דגימות תלת-ממדיות עבות כגון אורגנואידים מכיוון שהוא מפחית אות מחוץ למיקוד ויכול לרכוש מקטעים אופטיים טוריים (ערימות Z). עם זאת, הדמיה קונפוקלית דורשת בדרך כלל זמני רכישה ארוכים יותר ולייזרים בעוצמה גבוהה המגבירים את הפוטוטוקסיות / הלבנה. חשוב לציין כי צבעי מוות פלואורסצנטיים של תאים כמו SYTOX Green מתאימים רק למדידת צורות של מוות תאי כאשר יש אובדן שלמות קרום התא כגון נמק, נמק משני מאוחר הקשור לאפופטוזיס, נקרופטוזיס ופירופטוזיס21. ישנן כמה צורות של מוות תאי מוסדר שבו קרום התא נשאר בלתי חדיר לפחות בשלבים המוקדמים של מוות תאי, כגון אפופטוזיס תלוי קספאז. עם זאת, פרוטוקול זה יכול להיות שונה בקלות כדי לשלב גם הדמיה של קספז 3/7 פעילות פלואורסצנטית כתב22. זה יספק נתונים נוספים שיעזרו לאפיין את שיטת המוות התאית הספציפית.
השתמשנו בפרוטוקול שלנו כדי להדגים את האינטראקציה הסינרגטית ציטוטוקסית בין הציטוקינים IFN-γ ו-TNF-α (איור 2C), עליה דיווחנו בעבר באורגנואידים 9,10 שמקורם בחולי CD. הרלוונטיות הפיזיולוגית של צורה זו של סינרגיזם הודגמה גם במודלים מורינים של לימפוהיסטיוציטוזה המופגוציטית ואלח דם23. מספר מודלים וגישות ייחוס מתמטיות יושמו לכימות סינרגיה בין שילובים של חומרים ביולוגיים 24,25. הם נבדלים זה מזה מבחינת מורכבותם, מספר הגורמים שהם לוקחים בחשבון, והסף להחשיב אינטראקציה כסינרגטית24,25. מודלים מסוימים דורשים ידע מוקדם על החומרים הביולוגיים שנבדקו, מניחים הנחות מסוימות לגבי פעילות הסוכנים, ויכולים לדרוש עקומות מנה-תגובה מקיפות לכל טיפול יחיד ומשולב25. השיטה שבחרנו למדידת סינרגיה היא שינוי של מודל מקדם האינטראקציה התרופתי (CDI), ששימש בעבר למדידת ההשפעות המעכבות של שילובי תרופות כימותרפיות על התפשטות קו תאים סרטניים26. ה-CDI הוא מודל עצמאות של בליס; כאשר מחשבים את ההשפעה המשולבת החזויה של שתי הפרעות, עצמאות בליס מניחה שהן מכוונות למסלולים נפרדים ויש להן מנגנוני פעולה עצמאיים27. כדי שאינטראקציה בין הפרעות תהיה סינרגטית, ההשפעה המשולבת בפועל חייבת להיות גדולה יותר מהאפקט החזוי. מודל זה מתאים למערך הניסויי שלנו מכיוון ש- IFN-γ ו- TNF-α ידועים כבעלי קולטנים שונים ורכיבי איתות במורד הזרם. יתר על כן, עצמאות בליס מאפשרת חישוב מקדם אינטראקציה לכימות סינרגיזם ואינה דורשת מערכי נתונים של תגובת מינון.
ישנם מספר גורמי מפתח שיש לקחת בחשבון כדי להבטיח תוצאות אופטימליות עבור פרוטוקול זה. חשוב שקולונואידים יופצו לצפיפות גבוהה (איור 1Bi), שהם בקוטר של כ-25-50 מיקרומטר, והם מתרבים באופן פעיל לפני שהם מנסים לזרוע תאים. השימוש בתרביות תת-אופטימליות של קולונואידים לבדיקות עלול לגרום למספר תאים לא מספיק, התאוששות קולונואידים נמוכה וניסויים לא עקביים. לקבלת תוצאות הניתנות לשחזור, חשוב גם לזרוע את צפיפות הקולונואידים באופן עקבי בין ניסויים. הוכח בעבר כי תגובת המבחנה לציטוקינים דלקתיים יכולה להיות מושפעת מצפיפות זריעת תאים28,29. בעיה נפוצה נוספת היא היווצרות בועות אוויר בכיפת BME, אשר יכולות להשפיע על ההדמיה. ניתן למנוע זאת על ידי שימוש בטכניקת הפיפטינג ההפוך. טכניקה זו גם מביאה לזריעה עקבית יותר.
יתר על כן, אם מדמים מספר נקודות זמן, הכינו תנאי רעילות מרבית לכל נקודת זמן. Triton-X 100, חומר פעילי שטח לא יוני, משמש בדרך כלל כבקרה חיובית (תנאי רעילות מרבית) עבור בדיקות ציטוטוקסיות. התוספת של Triton-X 100 שוכבת והורגת את הקולונואידים, ומאפשרת לצבע המוות הפלואורסצנטי להיכנס לתאים. שימוש בתנאי רעילות מרבית מנקודת זמן מוקדמת יותר יגרום לנורמליזציה לא מדויקת ולא עקבית של נתונים עקב דעיכת האות הפלואורסצנטי לאורך זמן.
נקודה אחרונה שיש לקחת בחשבון היא הבחירה של BME המשמש לתרבית קולונואידים. ישנם מספר יצרנים מסחריים של BME; עם זאת, עבור הפרוטוקול שלנו, בדקנו רק את המותג הכלול בטבלת החומרים. מחקר שנערך לאחרונה באמצעות אורגנואידים של סרטן הלבלב שמקורם בחולים מצא כי המקור המסחרי של BME שינה את שיעורי התרבות התא, אך לא הייתה לו השפעה משמעותית על התגובה לתרופות כימותרפיות או ביטוי גנים30. בהתחשב בכך, אנו מצפים שמגמת התוצאות תהיה דומה בין מותגי BME עבור הפרוטוקול שלנו, אך אנו ממליצים להשתמש באותו מותג באופן עקבי.
הדגמנו כיצד פרוטוקול זה יכול לשמש לניתוח של IFN-γ ו- TNF-α המושרה למוות תאי באמצעות קולונואידים שמקורם בחולה CD. אורגנואידי מעיים שמקורם במטופל הם כלי רב עוצמה לחקר CD מכיוון שהם שומרים על מאפיינים רבים של המחלה, כולל רגישות מוגברת להשפעות ציטוטוקסיות של TNF-α31. עם זאת, ניתן לשנות את הפרוטוקול בקלות כדי לחקור השפעות ציטוטוקסיות של הפרעות שאינן ציטוקינים או מצבי מחלה שאינם IBD כגון סרטן המעי הגס (בדקנו בהצלחה את הפרוטוקול באמצעות קולונואידים שאינם IBD). אנו מאמינים ששיטה זו שימושית לכל תחום מחקר העוסק במנגנוני מוות תאי, תפקוד מחסום אפיתל או אימונולוגיה של רירית המעי.

אפיתל המעי יוצר מחסום פיזי חדיר למחצה בין התוכן של לומן המעי לבין הרקמות הבסיסיות. כדי לשמור על מחסום זה ביעילות, תאי אפיתל המעי (IECs) עוברים תחלופה תאית גבוהה במיוחד, עם מחזור מתמשך של מוות והתחדשות תאים. עם זאת, במהלך הפרעות דלקתיות, כגון מחלות מעי דלקתיות (IBD), רמות גבוהות יותר של מוות תאים חריגים להתרחש1. זה עשוי לקדם התמוטטות של תפקוד מחסום והפעלה של המערכת החיסונית, מה שמעורר דלקת נוספת. במחלת קרוהן (CD), סוג של IBD, הוכח כי איתות ציטוקינים תורם לרמות מוגברות של מוות IEC2. על ידי חקר האופן שבו איתות ציטוקינים גורם למוות תאי של IECs, אנו מקווים כי ניתן לפתח טיפולים משופרים עבור חולים עם IBD והפרעות דלקתיות אחרות במעיים1.
במחקר ביולוגיה וגילוי מטרות תרופות, סינרגיה מובנת בדרך כלל כמתרחשת כאשר מערכת ביולוגית המטופלת בשילובים של גירויים בודדים מראה תגובה לשילוב שהיא גדולה יותר מההשפעות המוספות המשולבות של הגירויים הבודדים בלבד. אינטראקציות סינרגטיות בין ציטוקינים תועדו היטב בהנעת תגובות אנטי-ויראליות מולדות3. ציטוקינים ידועים גם כגורמים למוות תאי באופן סינרגטי, כולל ב-IECs4. עם זאת, התפקיד שאיתות ציטוקיני ציטוטוקסי סינרגטי ממלא בהפרעות דלקתיות במעי כגון IBD אינו נחקר מספיק.
אורגנואידים אנושיים במעיים הם מיקרו-רקמות תלת-ממדיות המיוצרות במבחנה ונוצרות מתאי גזע אפיתליאליים במעי. ניתן לגדל אורגנואידים במעי מביופסיות רירית המעי המתקבלות מחולים עם IBD ולשמור על מאפיינים רבים של המחלה 5,6. אורגנואידים הוכיחו את עצמם כמערכת מודל אידיאלית לחקר ציטוטוקסיות ציטוקינים בהקשר של דלקת מעיים 7,8. בעבר, הקבוצה שלנו אפיינה את השפעות ההרג הסינרגטיות של הציטוקינים הרלוונטיים ל- IBD IFN-γ ו- TNF-α באורגנואידים של המעי הגס (קולונואידים) שמקורם בחולי CD 9,10. עם זאת, המנגנונים המדויקים המעורבים בתיווך צורה זו של מוות תאי סינרגטי נותרו חמקמקים. יש גם הרבה יותר אינטראקציות ציטוקסינים ציטוטוקסיות לא מאופיינות הרלוונטיות להפרעות דלקתיות במעי.
מספר פרוטוקולים זמינים לחקר מוות תאי באורגנואידים במעיים 10,11,12,13; עם זאת, לכל אחד מהם יש חסרונות. חלק מהטכניקות הללו מודדות רק את יכולת הקיום של התא ואינן מודדות מוות תאי ישירות, אינן מסוגלות להעריך תגובות של אורגנואיד יחיד, או דורשות ציוד יקר ופרוטוקולים מורכבים. יש צורך במתודולוגיות חזקות ופשוטות כדי לכמת את האינטראקציות בין מוות תאי אורגנואידים לבין אינטראקציות perturbagen באורגנואידים במעי. הפרוטוקול שאנו מציגים הוא גישה פשוטה וזולה למדידת תגובות אורגנואידים בודדים לציטוקינים ציטוטוקסיים, אך ניתן להשתמש בו לכל סוג של גירוי או הפרעה. אנו גם מדגימים כיצד להשתמש במודל הסינרגיה של עצמאות Bliss כדי לחשב מקדם של אינטראקציה perturbagen (CPI) המתאר אינטראקציות ציטוקסינים ציטוטוקסיים.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>מתקדם 12634010</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B Solution</td><td>Sigma-Merck</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>Sigma-Merck</td><td>SML0788</td><td></td></tr><tr><td>BioRender</td><td>Science Suite Inc.</td><td>N/A</td><td>תוכנת איור מדעית</td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>Sigma-Merck</td><td>A2058</td><td>בעיקרו נטול IgG, אנדוטוקסין נמוך</td></tr><tr><td>B27 תוסף</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>Sigma-Merck</td><td>SML1046</td><td></td></tr><tr><td>Costar 48-well Clear TC-מטופל צלחות באר מרובות, עטופות בנפרד,</td><td>קורנינג</td> סטרילי <td>3548</td><td></td></tr><tr><td>תמצית קרום הבסיס של Cultrex, סוג 2, Pathclear</td><td>R& D Systems</td><td>3532-010-02</td><td>תמצית קרום הבסיס</td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד</td><td>סיגמא-מרק</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco &prime; s פוספט חוצץ</td><td>מלח Sigma-Merck</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>EVOS FL מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך דיגיטלי</td><td>Invitrogen</td><td>AMF4300</td><td>מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי הפוך</td></tr><tr><td>דיגיטלי EVOS 40x אובייקטיבי, פלואוריט, LWD, ניגודיות פאזה</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMEP4683</td><td>מרחק עבודה ארוך 40x פלואורסצנטי אובייקט</td></tr><tr><td>Fiji/ImageJ (גרסת Windows)</td><td>תוכנת קוד פתוח</td> N<td>/A</td><td>תוכנה לניתוח תמונה</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Sigma-Merck</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת ג'נטמיצין</td><td>Sigma-Merck</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>מגיב דיסוציאציה עדין של תאים</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>100-0485</td><td>מגיב דיסוציאציה של תאים ללא אנזימים</td></tr><tr><td>GlutaMAX-1</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>תוסף דיפפטיד L-alanyl-L-גלוטמין</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5 (גרסת Windows)</td><td>Dotmatics</td><td>N/A</td><td>תוכנת גרפיקה וסטטיסטיקה נתונים</td></tr><tr><td>Greiner 15 מ"ל צינור צנטריפוגה פוליפרופילן, סטרילי עם תחתית חרוטית & פקק בורג</td><td>Cruinn</td><td>188261CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>EGF רקומביננטי אנושי (ללא בעלי חיים)</td> <td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetylcysteine</td><td>Sigma-Merck</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>ניקוטינאמיד</td><td>Sigma-Merck</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Normocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-nr-05</td><td>טווח רחב מגיב אנטי מיקרוביאלי</td></tr><tr><td>Nunc Edge 96-Well, Nunclon Delta-Careated, Flat-Bottom Microplate</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15543115</td><td></td></tr><tr><td>תוסף N2</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי IFN-gamma חלבון</td><td>R& D Systems</td><td>285-IF</td><td>Resuspend ב-0.1% PBS/BSA</td></tr><tr><td>רקומביננטי חלבון TNF-אלפא אנושי</td><td>מסונן סטרילי D Systems</td><td>210-TA</td><td>השעיה בסטרילי מסוננת 0.1% PBS/BSA</td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma-Merck</td><td>S7067</td><td></td></tr><tr><td>Snap Cap צינורות מיקרוצנטריפוגה עם שמירה נמוכה</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>3451</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX כתם חומצת גרעין ירוקה - תמיסה של 5 מ"מ בצבע מוות תאי</td><td>פלואורסצנטי</td>DMSO <td>Invitrogen</td><td>S7020</td>, מגן מפני אור</tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Merck</td><td>93420</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue solution</td><td>Sigma-Merck</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Tryple Express</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td>מגיב דיסוציאציה אנזימטי</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-10071</td><td>מעכב ROCK-I ו-ROCK-II</td></tr></tbody></table>

כימות מוות תאי הנגרם על ידי ציטוקינים באורגנואידים של המעי הגס האנושי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי חי

Quantification of Cytokine-Induced Cell Death in Human Colonic Organoids Using Live Fluorescence Microscopy

מוות מוגבר של תאי אפיתל במעי (IEC) מוגבר בחולים עם מחלות מעי דלקתיות (IBD) כגון קוליטיס כיבית (UC) ומחלת קרוהן (CD). זה יכול לתרום לפגמים בתפקוד מחסום המעי, החמרה של דלקת, ואימונופתוגנזה של המחלה. ציטוקינים וליגנדות קולטני מוות אחראים חלקית לעלייה זו בתמותה בחברת החשמל. ציטוקינים רלוונטיים ל-IBD, כגון TNF-α ו-IFN-γ, הם ציטוטוקסיים לחברת החשמל הן באופן עצמאי והן בשילוב. פרוטוקול זה מתאר בדיקה פשוטה ומעשית לכימות ציטוטוקסיות הנגרמת על ידי ציטוקינים באורגנואידים של המעי הגס שמקורם בחולי CD באמצעות צבע מוות של תאים פלואורסצנטיים (SYTOX Green Nucleic Acid Stain), מיקרוסקופ פלואורסצנטי חי ותוכנת ניתוח תמונה בקוד פתוח. אנו גם מדגימים כיצד להשתמש במודל המתמטי של עצמאות בליס כדי לחשב מקדם של אינטראקציית הפרעה (CPI) בהתבסס על ציטוטוקסיות אורגנואידית. מדד המחירים לצרכן יכול לשמש כדי לקבוע אם אינטראקציות בין שילובי ציטוקינים או סוגים אחרים של הפרעות הן אנטגוניסטיות, תוספתיות או סינרגטיות. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם כדי לחקור את הפעילות ציטוטוקסית של ציטוקינים והפרעות אחרות באמצעות אורגנואידים המעי הגס שמקורם במטופל.

באמצעות פרוטוקול זה, הדגמנו כיצד ניתן להשתמש בקולונידים של חולי CD כדי לחקור את ההשפעות ציטוטוקסיות של הציטוקינים הרלוונטיים ל- IBD IFN-γ ו- TNF-α על אפיתל ראשוני. השתמשנו בצבע מוות פלואורסצנטי זמין מסחרית (SYTOX Green Nucleic Acid Stain), שיכול להיכנס רק לתאים בעלי קרום תא פגוע, שם הוא מופעל על-ידי קשירה לחומצות גרעין. טיפלנו יחד בקולונואידים עם ציטוקינים וצבע המוות של תאים פלואורסצנטיים וביצענו הדמיה חיה של תאים ב-8 שעות וב-24 שעות במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי הפוך. תמונות כיסוי שידור/פלורסנט מייצגות בשעה 8 שעות מצביעות על כך שרק הקולונואידים המטופלים ב- IFN-γ + TNF-α חיוביים לאות פלואורסצנטי; אולם יש רק מספר קטן של תאים פלואורסצנטיים (איור 2A). Blebing תאים, אינדיקטור מורפולוגי של מוות תאי20, ניתן לראות גם במצב IFN-γ + TNF-α. לאחר 24 שעות, קולונואידים שטופלו ב-IFN-γ + TNF-α מציגים אזורים גדולים חיוביים לאות פלואורסצנטי (איור 2A). יש גם התמוטטות ברורה במורפולוגיה של הקולונואיד - הלומן המרכזי אינו נראה עוד, ומחסום האפיתל שובש לחלוטין.
כדי לכמת את אות צבע המוות של התא, השתמשנו בתוכנת ניתוח תמונות בקוד פתוח כדי לחשב את עוצמת הפלואורסצנט של כל קולונואיד. לאחר מכן נרמלנו את הנתונים על ידי ביטוי הממוצע של כל מצב כאחוז מהטיפול ברעילות מרבית. לאחר 8 שעות, מוות הומיאוסטטי או תאי רקע בקולונואידים של בקרת BSA היה נמוך יחסית (7.7% מהרעילות המרבית) (איור 2B). לא היו שינויים מובהקים סטטיסטית ברמות המוות של תאים בשלב זה; אולם מצבים שטופלו ב-TNF-α הראו עלייה קטנה בציטוטוקסיות (איור 2B). לאחר 24 שעות, רמות המוות של תאים עלו בכל המצבים שטופלו בציטוקינים. עם זאת, היה שינוי מזערי במוות תאי עבור מצב בקרת BSA בין נקודות זמן (7.5% מהרעילות המרבית לאחר 24 שעות). הקולונואידים שטופלו ב- IFN-γ + TNF-α היו בעלי העלייה הגדולה ביותר ברמות המוות של תאים בהשוואה לבקרת BSA (29.4% מהרעילות המרבית). ההבדל ברמות המוות התאית בין הטיפול המשולב לבין הטיפול בציטוקינים בודדים (IFN-γ, TNF-α) היה משמעותי ביותר. תוצאות אלה מצביעות על האפשרות של אינטראקציה סינרגטית ציטוטוקסית בין IFN-γ ו- TNF-α לאחר 24 שעות.
השתמשנו במדד המחירים לצרכן כדי לכמת את האינטראקציות ציטוטוקסיות בין טיפולי ציטוקינים ולקבוע אם הם סינרגטיים. אינטראקציות בין ציטוקינים נחשבות סינרגטיות כאשר ערך המדד הוא &lt;1, תוסף כאשר =1, או אנטגוניסטי כאשר &gt;1. חישבנו את ערכי מדד המחירים לצרכן לכל נקודת זמן (איור 2C). ב-8 שעות, ערך המדד הצביע על סינרגיזם קל (0.99), כאשר ערך המדד ירד משמעותית ב-24 שעות (0.83). ניתוח זה אישר כי האינטראקציה בין IFN-γ ו- TNF-α ב -24 שעות הייתה סינרגטית. יתר על כן, הוא ממחיש כיצד בהקשר זה סינרגיזם בין IFN-γ ו- TNF-α תלוי זמן.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66759/66759fig01v2.jpg"> איור 1: סכמטיות של זרימת עבודה ניסיונית ופתרון בעיות. (A) סקירה סכמטית של פרוטוקול. (ב) תמונות מייצגות. (בי) תמונה במיקרוסקופ אור הממחישה את הצפיפות האופטימלית של התרבית ואת הגודל האופטימלי של קולונואידים לפני המעבר לבדיקה. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. (Bii) תמונת מיקרוסקופ אור הממחישה גודל אופטימלי של מקטעי קולונואידים לאחר דיסוציאציה; קטעים מודגשים באדום. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (Biii) תמונה במיקרוסקופ אור של מורפולוגיית קולונואיד נמקית לאחר טיפול MT (עם Triton X-100). סרגל קנה מידה = 25 מיקרומטר. (Biv) תמונה במיקרוסקופ אור של שני קולונואידים החופפים באותו מישור מוקד. סרגל קנה מידה = 25 מיקרומטר. (Bv) תמונה במיקרוסקופ אור של פסולת תאי קולונואיד נוכחים לאחר מעבר; פסולת מודגשת באדום. סרגל קנה מידה = 25 מיקרומטר. קיצורים: החזר השקעה = אזור עניין; MFI = עוצמת פלואורסצנטיות ממוצעת; MT = רעילות מרבית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66759/66759fig01largev2.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66759/66759fig02v2.jpg"> איור 2: ניתוח כמותי של מוות תאי המושרה על-ידי ציטוקינים בקולוניואידים של CD בבני אדם. (A) תמונות מיקרוסקופיות חיות מייצגות של קולונואידי CD שטופלו בכתם חומצת גרעין ירוקה SYTOX (צבע מוות של תאים פלואורסצנטיים) וציטוקינים בשעה 8 ו-24 שעות; ערוצי שידור ו- GFP (צבע ירוק) שכבת-על. קולונואידים טופלו באופן הבא: 1) PBS/BSA, 2) 10 ng/mL IFN-γ, 3) 10 ng/mL TNF-α, 4) 10 ng/mL IFN-γ + 10 ng/mL TNF-α. פסי קנה מידה = 25 מיקרומטר. (B) ניתוח כמותי של קולונואידים CD שטופלו בצבע מוות של תאים פלואורסצנטיים וציטוקינים בשעה 8 ו-24 שעות; הנתונים מבוטאים כאחוז ממצב MT. N = 2 קווי קולונואיד CD, 11-16 קולונואידים מצולמים לכל מצב. (C) מדד המחירים לצרכן מחושב לפי נקודת זמן באמצעות מערך הנתונים מקווי קולונואיד B, N = 2 CD. הנתונים באים לידי ביטוי כאמצעים ± SE. ב- B, ניתוח ANOVA דו-כיווני בוצע ואחריו בדיקות בונפרוני לאחר מכן, *P &lt; 0.05, ***P &lt; 0.001 כפי שצוין. קיצורים: CD = מחלת קרוהן; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; מדד המחירים לצרכן = מקדם האינטראקציה perturbagen; PBS = מלח חוצץ פוספט; BSA = אלבומין בסרום בקר; TNF-α = גורם נמק גידולי-אלפא; IFN-γ = אינטרפרון-גמא; MT = רעילות מרבית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66759/66759fig02largev2.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
טבלה 1: הרכב אמצעי תרבות לפרוטוקול. להכנת Organoid Proliferation Media, שלבו מדיה מותנית L-WRN עם מדיה ללא סרום 1:1, ולאחר מכן הוסיפו תוספים. יש להשתמש ב-Organoid Proliferation Media תוך שבועיים מרגע ההכנה. שים לב שכל המדיה המלאה צריכה להיות מאוחסנת ב- 4 ° C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66759/66759_Table%201%20(1).xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
טבלה 2: פריסת צלחות ניסיונית של 96 בארות וטיפולי ציטוקינים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66759/66759_Table%202%20(1).xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה וחסכונית לחקור ולכמת מוות תאי באורגנואידים אנושיים של המעי הגס בתגובה להפרעות ציטוטוקסיות כגון ציטוקינים. הגישה משתמשת בצבע מוות פלואורסצנטי של תאים (SYTOX Green Nucleic Acid Stain), במיקרוסקופ פלואורסצנטי חי ובתוכנת ניתוח תמונות בקוד פתוח כדי לכמת תגובות אורגנואיד יחיד לגירויים ציטוטוקסיים.

Intestinal epithelial cell (IEC) death is increased in patients with inflammatory bowel diseases (IBD) such as ulcerative colitis (UC) and Crohn's disease ...

quantification-cytokine-induced-cell-death-human-colonic-organoids

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן, פרוטוקול למסוק, לתחזק ולטפל organoids הקטנה עכבר מעיים עם דפוסים מולקולריים הקשורים הפתוגן (PAMPs) ו חיידקי ליסטריה מתואר, כמו גם דגש על ביטוי גנים וטכניקות נורמליזציה ראויות חלבון.

ה<em&gt; Ex Vivo</em&gt; גירוי קולטן הכרת תרבות תבנית של עכבר המעיים Organoids

Efferocytosis, הסרת phagocytic בתאים אפופטוטיים להיפגע, הוא נדרש כדי לשמור על הומאוסטזיס, בהנחייתם של רצפטורים, איתות המסלולים המאפשרים זיהוי, היבלעות של הפנמה של מוות תאים. במסמך זה, אנו מציגים מיקרוסקופ פלורסצנטיות פרוטוקול עבור כימות של efferocytosis וכן את פעילותם של efferocytic איתות המסלולים.

כימות של Efferocytosis על-ידי קרינה פלואורסצנטית תא בודד מיקרוסקופ

נתאר כאן פרוטוקול לחקור cytotoxicity של טרום הופעל CD8+ T תאים נגד תאים סרטניים על ידי גילוי אפופטוטיים להיפגע סרטן תאים באמצעות בזמן אמת מיקרוסקופ. פרוטוקול זה יכול לחקור מנגנונים מאחורי מיאלואידית הנוצרות על-ידי תאי T cell דיכוי והערכת תרכובות שמטרתה חידוש תאי T באמצעות המצור של תאים חיסוניים מיאלואידית מדכאים.

זיהוי בזמן אמת של הגידול Vitro תאים אפופטוזיס שנגזרות CD8+ T תאים ללמוד פונקציות החיסונית מדכא גידולים הסתננות התאים מיאלואידית

פרוטוקול זה מתאר את התצורה של היווצרות droplet (LD) של השומנים במבנה המעי האנושי על גירוי עם חומצות שומן. אנו דנים כיצד משתמשים באותה שיטת לכימות היווצרות LD, וכיצד ניתן להשתמש בה עבור הקרנת תפוקה גבוהה עבור תרופות המשפיעות על היווצרות LD.

שיטת פלואורסצנטית מבוססת על האפיון והקוונפיקציה של היווצרות Droplet ליפיד בגוף מעיים אנושי

הפרוטוקול המוצג משתמש cy, לנסות לכמת את מספר התאים מתרבים ומתים בתוך העכבר התרבותי enteroids. שיטה זו שימושית להערכת ההשפעות של טיפול תרופתי בשגשוג והישרדות של אורגנואיד.

קוונפיקציה של מתרבים ותאים מתים ב Enteroids

כאן אנו מציגים פרוטוקול שלב אחר שלב ליצירת אורגנואידים רשתית אנושיים בוגרים ומשתמשים בהם בבדיקת רעילות קולטני אור כדי לזהות מועמדים תרופתיים למחלת רשתית ניוונית הקשורה לגיל טלנגיאקטזיה מקולרית מסוג 2 (MacTel).

מסכי רעילות באורגנואידים ברשתית אנושית לגילוי תרופות

אורגנואידים במעיים שמקורם בביופסיה וטכנולוגיות של איברים על שבבים משולבים בפלטפורמה מיקרופיזיולוגית כדי לשחזר את פונקציונליות המעי הספציפית לאזור.

שילוב של אורגנואידים אנושיים וטכנולוגיית איברים על שבב כדי ליצור מודל של פונקציונליות ספציפית לאזורי מעיים

כאן אנו מציגים פרוטוקול לחקר קצב התחלת מוות תאי מתוכנת על ידי הדמיה רציפה של עלים מחוסנים לאחר השראת מוות תאי.

חקר התחלת מוות תאי באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי

במאמר זה אנו מציגים שיטה לזיהוי תרכובות המווסתות את מנגנון ADCC, מנגנון חשוב להרג תאים סרטניים של נוגדנים אנטי-סרטניים. ההשפעה ציטוטוקסית של תאי NK נמדדת בספרואידים של תאי סרטן השד בנוכחות Trastuzumab. ניתוח תמונה מזהה רוצחים חיים ומתים ותאי מטרה בספרואידים.

כימות ציטוטוקסיות תאית תלוית נוגדנים במודל ספרואידי גידול: יישום לגילוי תרופות

אורגנואידים סרטניים שמקורם בחולה הם מערכת מודל מתוחכמת למחקר בסיסי ותרגומי. מאמר שיטות זה מפרט את השימוש בדימות תאים חיים פלואורסצנטיים מרובים להערכה קינטית בו זמנית של פנוטיפים אורגנואידים שונים.

הדמיה מרובת תאים חיים לתגובות תרופתיות במודלים אורגנואידים שמקורם בחולה של סרטן

מחקר זה משתמש בסמנים מבוססי פלואורסצנטיות מרובי כתמים של מוות תאים ואפופטוזיס בשילוב עם מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי להעריך אפופטוזיס המושרה על ידי ציטוקינים ומוות ספציפי לתאי β באיי הלבלב. הוא חושף שינויים מרחביים וזמניים במוות תאים ואפופטוזיס בתגובה לגירויים חוץ-תאיים.

טיפול באי לבלב מבודד ומדידת אפופטוזיס

חקור מנגנוני מוות תאי באורגנואידים של המעי הגס האנושי בתגובה לציטוקינים דלקתיים. שיטה זו משתמשת במיקרוסקופ פלואורסצנטי חי לכימות תגובות ברמת אורגנואיד בודד.

כימות מוות תאי הנגרם על ידי ציטוקינים באורגנואידים של המעי הגס האנושי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי חי

גלה סרטונים נוספים