אבחון לאחר המוות של כלבת בבעלי חיים על ידי מבחן תגובת שרשרת פולימראז LN34 המעודכן והמרובה בזמן אמת

כלבת היא קטלנית במאה אחוז ונדרשת אבחון מהיר ומדויק כדי לקבל טיפול מציל חיים לאלו שזקוקים לו ביותר. בדיקות מעבדה אמינות הן קריטיות מאוד לשליטה בכלבת. ה-CDC פיתח פרוטוקול שלב אחר שלב לבדיקות כלבת באמצעות PCR (RT-PCR) כמותי של תעתיק הפוך, באמצעות בדיקת וירוס אליסה בזמן אמת מאומתת בשם LN34, המאפשרת למעבדות לשפר את דיוק האבחון ולתמוך במאמצי מניעת כלבת.

במשך עשרות שנים, בדיקות הכלבת התבססו על בדיקות נוגדנים פלואורסצנטיות ישירות שנקראו DFA או FAT. עם זאת, מעבדות בינלאומיות רבות משתמשות גם הן ב-RT-PCR לבדיקות כלבת בשל רגישותו ודיוקו הגבוהים. בדיקת DFA לכלבת דורשת מיקרוסקופים מיוחדים, אחסון בשרשרת קירור, הכשרה מיוחדת של הצוות ותגובים חוו מחסורים בשנים האחרונות, ו-PCR ו-RT-PCR משמשים כיום באופן נרחב לבדיקות פתוגנים.

רבות מהמעבדות כבר מחזיקות בציוד ומומחיות PCR ו-RT-PCR, והתגובות הנדרשות זמינות אצל ספקים מסחריים. העלות היא מחסום מרכזי לבדיקות כלבת באזורים עם הכי הרבה מקרי כלבת בבני אדם. ה-CDC פיתח גרסה מולטיפלקס של מבחן LN34, שמשפרת את בקרות האיכות ומפחיתה עלות לכל דגימה שנבדקה.

RT-PCR מיושם יותר ויותר לאבחון כלבת כי הוא בשימוש נרחב לבדיקת פתוגנים אחרים והתוצאות קלות לפרשנות. אבל שימוש במבחן מאומת הוא חשוב מאוד, וחשוב לא פחות לוודא שהמבחן מתפקד כמצופה כמצופה. הפרוטוקול שלב אחר שלב שלנו כולל בקרות איכות, שיקולי בטיחות ושיטות עבודה מומלצות ל-PCR כדי לסייע למעבדות להתחיל.

כדי להתחיל, לבשו ציוד מגן אישי כולל משקפי בטיחות, חלוק סגור קדמי ושני זוגות כפפות. נקה וחטא את משטח העבודה עם תרכובת אמוניום רבעית, או חומר חיטוי מתאים אחר לנטרול נגיף הכלבת. פרש כרית סופגת מצופה פלסטיק על משטח העבודה, באמצעות סכין ניקויה חד-פעמית לאיסוף רקמה המייצגת חתך רוחבי מלא של גזע המוח והמוחון.

לצורך הומוגניזציה והפקת RNA, לטחון את הרקמות הנדרשות באמצעות סכין חד-פעמית. מרחו את רקמת הטחון עם מטוש והעבירו את המטוש לצינור מלא מראש בבופר הומוגניזציה וחרוזים. לאחר השלכת הכפפה החיצונית באמצעות חומר חיטוי QAC מדולל ב-1:256, נקה וחטא את תחנת העבודה, הציוד ואת צינורות הדגימה החיצוניים.

הומוגניזציה של דגימות עם מקצף חרוזים קטן למשך 60 שניות. ולבדוק את הצינורות בצורה ויזואלית. אפשר לדגימות לעמוד חמש דקות בטמפרטורת החדר.

לבסוף, נקה וחטא את תחנת העבודה, הציוד ומחוץ לצינורות הדגימה עם חומר חיטוי QAC לפני המשך לחילוץ RNA. כדי להתחיל, יש לבצע ניקוי שטח של ארון הבטיחות הביולוגית באמצעות QAC מדולל ל-1:256. בצע ניקוי נוסף להסרת אבק או מזהמים סביבתיים אחרים.

פרש משטח עבודה סופג מצופה פלסטיק על פלטפורמת העבודה. לאחר מכן, סדר את החומרים והדגימות בארון הבטיחות הביולוגית. פרש את כל צינורות האיסוף במתקן נקי לצינורות מיקרו-צנטריפוגות.

מלא מראש צינור מיקרו צנטריפוגה אחד בנפח 1.5 מיליליטר עם 300 מיקרוליטר של 100% אתנול לכל דגימת מוח. צנטריפוגה את דגימות המוח ההומוגניות בטמפרטורה של 10,000 עד 16,000 גרם למשך שתי דקות בצנטריפוגה מיקרו-שולחנית. העבר את הסופרנטנט הורוד השקוף לצינור סטרילי חדש המכיל 100% אתנול, פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב ולהעביר 600 מיקרוליטר מתערובת הסופרנטנט אתנול לעמוד סיבוב בצינור איסוף.

צנטריפוגה למשך דקה אחת עד שהנוזל עובר דרך העמוד, זרקו את הזרימה והעבירו כל עמודה לצינור איסוף חדש. הוסף 400 מיקרוליטר של בופר RNA לפני שטיפה לכל עמודה. צנטריפוגה את התערובת ב-10,000 עד 16,000 גרם למשך 30 שניות וזרקו את הזרימה.

החזר כל עמודה לאותו צינור איסוף וחזר על שלב הכביסה המקדימה בפעם השנייה. לאחר מכן, הוסיפו 700 מיקרוליטר של בופר שטיפת RNA לכל עמודה. צנטריפוגה ב-10,000 עד 16,000 G לשתי דקות.

ולהעביר בזהירות את זה לצינור נטול RNase. השליכו את הזרימה ואת צינור האיסוף, ואז הסירו והשליכו כפפות חיצוניות. עכשיו הוסיפו 50 מיקרוליטר של מים ללא DNase ו-RNase ישירות למטריצת העמודה ודגרו אותה למשך 30 שניות.

אחר כך צנטריפוגה ב-10,000 עד 16,000 G לדקה אחת. העבר בזהירות את ה-RNA לצינור מיקרו צנטריפוגה חדש עם בורג עליון שטוח תחת המסומן כמיקרו צנטריפוגה לבדיקת RT-PCR. כדי להתחיל, יש להפשיר בופר RT-PCR בשלב אחד, ללא בקרת תבנית, מים ללא נוקלאז, פריימרים וגשושים על קרח, במרחב ההכנה של התערובת הראשית.

מניחים את האנזים RT-PCR בשלב אחד על הקרח. חשב את נפח כל מגיב עבור תערובות המאסטר A המולטיפלקס והבטא של LN34. סמן בארות לכל דגימה בשלוש עותקים עבור מבחן המולטיפלקס LN34 באמצעות מפת לוחות באר של 96.

לאחר מערבולת וסיבוב, פזר 23 מיקרוליטר של LN34 Multiplex Master Mix לכל LN34 שהוקצה טוב. כדי להגדיר תגובות שליליות לבקרת תבניות, הוסף שני מיקרוליטרים של מים בדרגת PCR לכל באר בקרה שלילית של תבנית. הנח את לוח 96 בארות על הקרח.

נקה את תחנת העבודה עם 70% אתנול. כעת, במסגרת העבודה של מהדורת התבנית, הפשרה של דגימות RNA ושליטה חיובית לשימוש חד-פעמי של RNA מלאכותי על קרח. לאחר מערבולת, צינורות צנטריפוגה קצרים המכילים דגימות RNA, מפילים פיפטות של שני מיקרוליטרים של דגימה או RNA בקרה חיובית אל הבאר המתאימה.

לאחר הוספת כל הדגימות, מניחים את כיסוי הדבק האופטי מעל הבארות כדי לאטום אותן לחלוטין. צנטריפוגה את הפלטה ב-500 גרם למשך דקה בטמפרטורת החדר, והניחו את הפלטה האטומה במכשיר PCR בזמן אמת או כמותי שמכויל ל-fam ול-VIC Hex Die. כוון את המכשיר לפרמטרי המחזור המתאימים.

לאחר סיום הריצה, הגדר את ערכי הסף ל-0.2 עבור LN34 ו-0.05 עבור אקטין בטא. בדוק את עקומות הדגימה של הבקרה אם יש בעיות איכות. מבחן LN34 הראה עקומות הגברה מוצלחות עם תוצאות חיוביות שחצו את הסף בערכי סף מחזוריים שונים כאשר נבחנים בסולם לוגריתמי.

ועקומות הגברה סיגמואידית בקנה מידה ליניארי הן עבור LN34 והן עבור בטא אקטין. תוצאות שליליות הציגו קווים שטוחים ללא הגברה. זוהו עקומות הגברה חריגות כאשר חלקן הציגו עליות פלואורסצנציה ליניאריות במקום סיגמואידיות, מה שמעיד על תוצאות לא טיפוסיות.

הגרפים הרב-רכיביים המתאימים הציגו אותות פלואורסצנטיים גליים לא סדירים במקום עקומות חלקות צפויות. הדגשת הצורך לנתח גרפים של הגברה במקום להסתמך רק על ערכי סף המחזור.