הכנת מודל עכברים של דלקת לבלב חריפה חמורה באמצעות שילוב של Caerulein ו Lipopolysaccharide הזרקה intraperitoneal

הטיפול בדלקת לבלב חריפה קשה בשל שיעורי תמותה גבוהים באמצעות מודלים של בעלי חיים, במיוחד עכברים עם רקע נבחר C57BL/6J. אנו חוקרים את SAP כפתולוגי כדי לזהות מטרות טיפוליות ולפתח טיפולים חדשים, ומספקים שיטת פולימיקה במחקר SAP אחד.

מחקר זה חשף ביטוי גבוה של גנים HMGB1 פגע בדלקת הלבלב, מה שמרמז על הקשר שלו לאבן הדלקתית של דלקת לבלב חריפה חמורה. הפרוטוקול שלנו כולל Caerulein כדי לגרום להתכווצות כיס המרה ולשבש את הצום בעכברים, מה שמוביל לנזק לרקמת הלבלב על ידי חסימת הפרשת נוזלי העיכול. בשילוב עם הזרקת LPS, גרמנו לדלקת לבלב חמורה עם אי ספיקת איברים בעכברים. גישה זו אינה פולשנית וקלה ליישום עם מחזורים קצרים ויכולת חזרה גבוהה.

[מדגים] כדי להתחיל, מדוד ורשום את משקל עכבר הניסוי. להזרקה תוך-צפקית של Caerulein, תפוס והחזק את העכבר כשהבטן פונה כלפי מעלה והראש ממוקם נמוך יותר מהזנב. החזיקו את המזרק ביד ימין והכניסו את המחט לעור התת עורי בצד שמאל של הקו הלבן בבטן. הזיזו את המחט קדימה כשלושה עד חמישה מילימטרים והכניסו אותה לחלל הבטן בזווית של 45 מעלות. שמור את המחט נייחת והזריק לאט את ה-Caerulein. משוך החוצה את המחט, ואז עסה בעדינות ולחץ על מקום ההזרקה בעזרת צמר גפן סטרילי כדי לפזר את התרופה במלואה לחלל הבטן. 12 שעות לאחר ההזרקה, הניחו את העכבר במרכז הרשת בקופסת הניסוי עם הפנים הרחק מהנסיין. הפעל את תוכנת מעקב הווידאו והגדר את הניטור לארבעה שדות ראייה בו זמנית. סמן את האורך והרוחב של אובייקט הניסוי שיכול לנוע בתוך הקופסה במסך הניטור בזמן אמת. הקלט את פעילות העכבר למשך 15 דקות. שינויים מקרוסקופיים שנמדדו במודל עכברי פגיעת הלבלב במהלך חמשת המחזורים הראו כי עכברים בקבוצת פגיעת הלבלב 5 שמרו על רמה נמוכה של מרחק תנועה תוך שלוש דקות, בעוד שיחס חוסר התנועה תוך שלוש דקות גדל עם כל מחזור שלאחר מכן. קבוצת פגיעות לבלב 5 הראתה את מרחק התנועה הכולל הקטן ביותר בהשוואה לקבוצות הניסוי האחרות, וההבדל היה מובהק סטטיסטית. מלבד קבוצת הביקורת ופגיעות הלבלב 1, כל הקבוצות הראו צמיחה שלילית במשקל בערך D, כאשר קבוצת פגיעות הלבלב 5 הראתה את השינוי הגדול ביותר. ניתוח שיעור ההישרדות הצביע על שיעור תמותה של 80% בקבוצת פגיעת הלבלב 5 ביום החמישי, בניגוד לקבוצות האחרות שלא הראו הבדל משמעותי מהביקורת. לאחר 36 שעות של הזרקה תוך צפקית של Caerulein, המתת חסד ואבטח את העכבר במצב שכיבה על צלחת קצף. בצע חתך חציוני בבטן והפוך את צינור המעי הדק ימינה כדי לחשוף את הלבלב. נתק את התריסריון ואת צינור הפילורי. אתר את המעי הדק מתחת ללבלב, ואז שחרר לחלוטין את רקמת הלבלב לאורך צינור המעי. בעזרת מלקחיים ללא שיניים, מהדקים את הטחול ומושכים בעדינות כלפי מעלה. נתח בחדות את רקמת הרצועה האחורית של הלבלב עד לראש הלבלב. ואז נתק את צינור המרה וכלי הדם. הסר את רקמת הלבלב מחלל הבטן וייבש את לחות פני השטח בנייר סופג. מדוד ורשום את משקל רקמת הלבלב. לאחר הכנת חלקי פרפין, יש להסיר שעווה מרקמות הלבלב פעמיים בקסילן למשך חמש דקות כל אחת. טפלו בכל חלק ב -100 מיקרוליטר חלבון K ודגרו בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. מוסיפים לרקמה את הכמות הנדרשת של 3% מי חמצן ודוגרים למשך 20 דקות כדי לחדור אליה במלואה. מכסים את כל שטח הדגימה ב -50 מיקרוליטר של מאגר שיווי משקל ודוגרים למשך 10 דקות. לאחר מכן הוסיפו 56 מיקרוליטר של מאגר דגירה TDT לכל דגימת רקמה ודגרו למשך שעה. שטפו את חלקי הרקמה ארבע פעמים עם PBS למשך חמש דקות כל אחד לפני הדגירה למשך 30 דקות ב-100 מיקרוליטר של תמיסת תגובת Streptavidin-HRP. לצביעת DAB, הוסף 50 מיקרוליטר DAB לכל קטע רקמה. טבלו את החלקים בתמיסת צביעה של המטוקסילין למשך שלוש עד חמש דקות לפני שטיפה במים טהורים. ייבשו את הדגימות בארבעה סיבובים של אתנול נטול מים טרי למשך חמש דקות כל אחד. בצע בדיקה היסטולוגית תחת מיקרוסקופ אור לבן. צביעת TUNEL על רקמות הלבלב של עכברים חשפה עלייה בנמק תאי בקבוצת פגיעה בלבלב 5, עם ערכי קשקשת אפורים גבוהים משמעותית ושיעורי נמק חיוביים בהשוואה לקבוצות אחרות. אימונובלטינג חלבון העריך את ביטוי Caspase-3, סמן לנמק תאי, והראה עלייה משמעותית ברקמות קבוצת פגיעה בלבלב 5. ציטומטריית זרימה של תרחיפי תאי לבלב, המסומנת ב-Nexin 5 fit CPI, הצביעה על שיעור תמותה גבוה משמעותית של תאים בקבוצת פגיעה בלבלב 5 בהשוואה לאחרים, עם מובהקות סטטיסטית.