Name: הערכת תכונות מבניות ב- Triticum aestivum ו - Zea mays עבור התמיינות פוטוסינתטית C3 ו- C4 באמצעות חתכים חופשיים ודקים למחצה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-12T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 4 s
Description: חקור את ההבדלים האנטומיים בין צמחי C3 ו-C4 באמצעות חתכים חופשיים ודקים למחצה ב-Triticum aestivum ו-Zea mays. השיטה מסייעת לחוקרים להבין את יעילות הפוטוסינתזה ולשפר את חוסן הגידולים לשינויי האקלים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לתוכנית H2020 של האיחוד האירופי (פרויקט GAIN4CROPS, GA מס' 862087). מרכז המצוינות AgroCropFuture Agroecology וגידולים חדשים באקלים עתידי ממומן על ידי משרד החינוך והמחקר, אסטוניה. ברצוננו להודות לפרופסור אוולין לויט-הארו על אספקת זרעים של T. aestivum ו-Z. mays, פאולה פלמט ו-Vaiko Vainola על עזרתם בהכנת חתכי עלים, ולז'ואאו פאולו דה סילבה סוזה על הסיוע בניתוח. כל התמונות התקבלו מיחידת המיקרוסקופ של האוניברסיטה האסטונית למדעי החיים תחת פרויקטים שונים.

1. תנאי גידול הצמח
<ol><li>בחר חיטה (Triticum aestivum L. Var. Winter Wheat, "Fredis") ותירס (Zea mays L. Var. Saccharata, "Golden Bantam") כצמחים מייצגים C3 ו- C4 , בהתאמה. לגדל את שני מיני הצמחים בתא גידול מבוקר סביבה מזרעים.</li>
	<li>שמור על לחות יחסית ב 55% עם טמפרטורת האוויר ב 25 °C / 18 °C (יום/לילה) עם תקופת אור 12 שעות. שמור על צפיפות שטף פוטונים פוטוסינתטי (Q) על פני השטח של הצמח ב 1200 μmol/m2/s כדי לייצג את תנאי הגידול הטבעיים שלהם. לגדל את כל הצמחים בריכוזCO2 סביבתי של 400 μmol/mol.</li>
	<li>השקו צמחיםכל יומיים במים מזוקקים ודישנו עם התמיסה של Hoagland 10 ימים לאחר הופעת השתילה. לגדל את הצמחים בתנאים הנתונים במשך 60 יום ולהשתמש עלים מורחבים לחלוטין לניתוחים מיקרוסקופיים.</li>
</ol>2. הכנה וצפייה בקטעים ביד חופשית
<ol><li>בחרו 3 עלים בוגרים שאינם מזדקנים מכל צמח ושמרו אותם במים מזוקקים. באמצעות סכין גילוח חד-צדדי חדש, בצע חיתוך פילוס אחד כדי ליצור זווית ישרה עם משטח העלה כדי להבטיח שהחתכים יהיו חתכים רוחביים המאונכים לפני השטח של העלה.</li>
	<li>הניחו את דגימת העלה על צלחת זכוכית על פיסת שעווה דנטלית כדי לייצב את הדגימה ולמנוע החלקה. חותכים על ידי הזזת הלהב ישר למטה על דגימת העלה כדי לחתוך בצורה נקייה דרך תאים. שמור את חתכי הרוחב במים מזוקקים.</li>
	<li>הרכיבו את הדגימות על מגלשת זכוכית על ידי הנחתן על טיפת מים וכיסוין בכיסוי זכוכית לצפייה והדמיה מיקרוסקופית. הימנעו מלכידת בועות אוויר.</li>
	<li>הצג את השקופית תחת מיקרוסקופ אור מורכב בהגדלה של 10x ו- 20x. שמור תמונות לפי מדריך התוכנה, יחד עם קנה המידה הרלוונטי.</li>
</ol>3. הכנת חלקים דקים למחצה
<ol><li>חתכו קטעים בגודל של כ-3X5 מ"מ מאזורים בין-קוסטליים לצד הצלע האמצעית מעלים של Z. mays ו-T. aestivum על צלחת זכוכית כמו בשלב 2.2. ודא שאורך החלק החתוך עובר לאורך גרגר העלה.</li>
	<li>מניחים את החומר הצמחי במזרק עם 1 מ"ל של חיץ קיבוע (4% אלדהיד גלוטרי בחיץ פוספט 0.1 M, pH = 6.9, טבלה 1).</li>
	<li>החזיקו את המזרק במאונך, הוציאו את האוויר, ובהחזקת אצבע על קצהו, שאבו את המזרק ליצירת ואקום. חזור על הפעולה עד שהדגימות שוכבות בתחתית המזרק, דבר המצביע על חדירה מוצלחת.</li>
	<li>העבירו את תכולת המזרק לבקבוקון זכוכית מסומן ואחסנו בטמפרטורה של 4°C למשך 48 שעות לפני השלב הבא (טבלה 2).</li>
	<li>עבור כל בקבוקון, להסיר בעדינות את הקיבוע עם פיפטה ולהוסיף את חיץ פוספט עד הדגימה מכוסה. להשאיר למשך 30 דקות. חזור על שלב זה 3x.</li>
	<li>הסר את חיץ הפוספט עם פיפטה והוסף את האוסמיום טטרוקסיד (זהירות) עד לכיסוי הדגימה. דגימות וחומר אורגני אחר יהפכו שחורים. יש להשתמש בכפפות כפולות. להשאיר למשך שעה.</li>
	<li>הסר את הפתרון הקודם עם פיפטה ולכסות את הדגימות עם מים מזוקקים. השאירו למשך 30 דקות חזור על שלב זה 3 פעמים והשתמש בכפפות כפולות.</li>
	<li>הסר את התמיסה הקודמת עם פיפטה ולכסות את הדגימות עם 50/50 מים מזוקקים אתנול פתרון. להשאיר למשך 30 דקות. חזור על שלב זה עם תמיסות מים-אתנול מזוקקות בסדרות הבאות: 30/70, 20/80, 10/90 ו-2x ב-100% אתנול. דגימות בכל אחד מתמיסות אלה ניתן להשאיר לילה ב 4 °C (75 °F).</li>
	<li>הסר את הפתרון הקודם עם פיפטה ולכסות את הדגימות עם 1/3 תמיסת שרף-אתנול. מניחים את הדגימות על צלחת מיקסר ומשאירים למשך שעתיים. חזור על שלב זה עם תמיסות שרף-אתנול בסדרות הבאות: 1/2, 1/1, 2/1, 3/1 ו-2x ב-100% שרף. דגימות בכל אחד מתמיסות אלה ניתן להשאיר לילה ב 4 °C (75 °F).</li>
	<li>מכסים את החללים של תבנית הטבעה שטוחה (16 חללים, מידות חלל: 14 L x 4.8 W x 3 D (מ"מ)) בשרף 100% ומניחים את הדגימות בקצה אחד של החלל. הכינו תוויות נייר כתובות בעיפרון לכל דגימה והניחו אותן בקצה השני של החלל.</li>
	<li>מלאו לחלוטין את כל החללים ב-100% שרף ויישרו את הדגימות והתוויות אם הן זזו. מכסים את התבנית בסרט הטבעה ועושים פולימריזציה בתנור בהתאם להנחיות מוצר שרף אקרילי.</li>
	<li>הגדר את הבלוק הפולימרי עם הדגימה במחזיק הדגימה של האולטרה-מיקרוטום. חותכים את הבלוק באמצעות סכין זכוכית מחוספסת עד שהרקמה הופכת גלויה ועודף שרף מסולק.</li>
	<li>חותכים חלקים דקים למחצה לרוחב (1 מיקרומטר) באמצעות סכין זכוכית או יהלום. אספו את המקטעים באמצעות לולאת חיסון מתכתית מפני המים והניחו אותם על מגלשת זכוכית. יבשו את המגלשה על פלטה חמה (60°C) כדי לקבע את החלקים על הזכוכית.</li>
	<li>צובעים את החלקים הקבועים בכחול טולוידין (תמיסה מימית 1%) למשך 5 שניות לפני שטיפה במים מזוקקים ומייבשים שוב על הפלטה החשמלית. הערה: יש לוודא שתהליך הקיבוע הכימי מתבצע תחת מכסה אדים. יש להחליף סכיני זכוכית מעת לעת כדי להבטיח חתכים חדים המאפשרים חתכים ללא קרעים או עיוותים.</li>
</ol>4. הדמיה של דגימות
<ol><li>הדמיה של קטעי עלים טריים<ol><li>הגדר את מיקרוסקופ האור המורכב עם התוכנה הנלווית בהתאם למדריך.</li>
		<li>הניחו את מגלשת הזכוכית על הבמה. התאם את העינית והצג את המקטע ב- 10x כדי לקבל סקירה, ולאחר מכן ביעדים של 20x ו- 40x.</li>
		<li>בכל מטרה, נווט בערוץ החי, התמקד בתחום העניין ואתר את תאי מעטפת הצרור סביב הווריד.</li>
		<li>לאחר ההתמקדות, לחץ על לחצן הקפא והוסף את קנה המידה על-ידי לחיצה על לחצן סרגל קנה המידה בכרטיסיה כלים. שמור את התמונה ב- . פורמט TIF לניתוח תמונות.</li>
	</ol></li>
	<li>הדמיה של חתכים שחדרו לשרף<ol><li>הגדר את מיקרוסקופ האור האוטומטי בקשר עם התוכנה הנלווית במחשב.</li>
		<li>טען את הערוץ השקוף והנח את השקופית על במת המיקרוסקופ. התמקד במקטע באמצעות הגדלה אובייקטיבית של 40x וכוונן את הבהירות כדי להבטיח שכל מבני התאים גלויים.</li>
		<li>הגדר את אזור המיקום של המקטע באמצעות פונקציית הנווט כדי לוודא שהמקטע כולו מצולם ולחץ על הלחצן תפר .</li>
		<li>לחץ על סיום ולאחר מכן על התחל כדי לאפשר למיקרוסקופ לצלם את המקטע כולו. פתח את תוכנת ניתוח התמונה ופתח את האריחים שצולמו במיקרוסקופ.</li>
		<li>באמצעות התכונה 'יישור', ודא שהאריחים אינם חופפים. לאחר יצירת התמונה, התאם את המיקום, הבהירות והסיבוב באמצעות הכרטיסייה התאמה.</li>
		<li>הדפס את קנה המידה על התמונה לפני השמירה ב- . פורמט TIF.</li>
	</ol></li>
	<li>מדידות אנטומיות באמצעות תוכנת ImageJ<ol><li>פתח את תוכנת ImageJ וטען את התמונה על ידי גרירתה לחלון.</li>
		<li>בעזרת הכלי קו, כיילו את קנה המידה באופן הבא: ציירו קו מעל סרגל קנה המידה, בחרו 'נתח' >'קבע קנה מידה', שנו את המרחק הידוע לאורך סרגל קנה המידה ושנו את יחידת האורך ליחידה הנכונה.</li>
		<li>מדוד את התכונה הפוטנציאלית על-ידי בחירה בכלי קו, ציור קו לרוחב אזור העניין והקשה על מקש M .</li>
		<li>למדידות שטח, בחרו בכלי בחירת מצולע וציירו מסביב לרקמה המעניינת. סיים בלחיצה על מקש M . המדידות מופיעות כחלון מוקפץ, שניתן להעתיק לגיליון אלקטרוני לצורך ניתוח נתונים נוסף.</li>
	</ol></li>
</ol>

אנליזה מיקרוסקופית לשיפור יעילות פוטוסינתטית בגידולי C4

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

במאמר זה נדון הן בשיטות הכמותיות והן בשיטות האיכותיות למדידת אנטומיה של עלים ובדרכים שבהן ניתן לייעל אותן. יתר על כן, המתודולוגיה מיושמת על מיני יבולים מייצגים כדי לקבוע אילו תכונות אנטומיות הן השימושיות ביותר בהבחנה בין חתכי C3 ו- C4 . הבנת תכונות אלה חיונית ככל שמינים היברידיים, המכונים פוטוסינתזה C2 , הופכים לאפיק מחקר מבטיח יותר. נכון לעכשיו, רק מין יבול אחד, Diplotaxis tenuifolia (ארוגולה), זוהה כמשתמש בפוטוסינתזה C2 , אך סביר להניח שיש יותר ממה שהרשומות הנוכחיות מצביעות על25. רמות גבוהות של גיוון פוטוסינתטי תוך-ספציפי ופלסטיות קיימות בשושלות C2 . משמעות הדבר היא כי אישור התרחשות של פוטוסינתזה C2 דורש שורות מרובות של ראיות, כגון נקודת פיצוי CO2 , אנליזות אולטרה-סטרוקטורליות ואימונוהיסטוכימיה30.
חתכים חופשיים ודקים למחצה שימשו לזיהוי ומדידה של רקמות צמחים ספציפיות במשך שנים רבות, אך מאמר זה נועד לדון במקרה השימוש הספציפי של מבני עלים אנטומיים המשפיעים על התמיינות פוטוסינתטית בין צמחי יבול C3 ו- C4 . יש אזהרות גם לחלוקה חופשית וגם לחלוקה חצי דקה שצריך לקחת בחשבון. חתכים ביד חופשית, למרות שהם מהירים להשגה, עשויים לגרום לקטעי עלים עם עובי לא עקבי, מה שמעכב ניתוחים כמותיים. ניתן להימנע מכך על ידי שימוש בציוד מיוחד לחיתוך חומר צמחי טרי (למשל, ויברטומה או קריוסטט). החלקים העבים יותר מחיתוך ידני יכולים לגרום לשכבות מרובות של תאים זה על גבי זה, לטשטש את התאים ובכך את האנטומיה. אם מטרת החלוקה היא איכותית בלבד, חלקים חופשיים מציעים את היתרון של עיבוד כימי של רקמות צמחים (כלומר, היסטוכימיה)31. זה מאפשר אינדיקציה איכותית של נוכחות של תרכובות מסוימות בתאי הצמח. לעומת זאת, מקטעים דקים למחצה כמעט תמיד גורמים לקטעים עבים באופן עקבי. עם זאת, התהליכים ארוכים יותר, עדינים, ולכן נוטים לטעויות. נושאים שעלולים להתעורר, כמו גם דרכים להימנע מהם, נדונים עוד יותר.
תיקון יש להשתמש בחומר טרי הן לחלקים חופשיים והן לחלקים דקים למחצה, כלומר עלים מצמחים הרוויים מספיק. לקטעים מעלים נבולים אין שלמות מבנית מכיוון שלתאים יש לחץ טורגור מופחת. כאשר משיגים חתכים דקים למחצה מחומר משובץ שרף, חשוב לוודא שמקטעי העלה קבועים תחת ואקום כדי להחליף את האוויר בתוך העלה. זה מאפשר שלמות מבנית ואוסמוזה במהלך תהליך החדירה. אם שלב זה אינו נעשה כראוי, תאים עלולים לקרוס, מה שיוביל לחתכים שאינם מתארים במדויק את מבנה העלה האמיתי וכתוצאה מכך למדידות אנטומיות שגויות32.
לעומת זאת, לחץ ואקום גבוה עלול לפגוע בעלים עם רקמות רכות (כמו קוטילדונים), וכתוצאה מכך תאים מתכווצים או הרס הדגימות. ניתן להימנע מכך על ידי שימוש בהגדרת משאבת ואקום מתאימה או על ידי דילוג עליה לחלוטין ופשוט השריית הדגימות בתמיסת הקיבוע. אם האחרון הוא העדיף, דגימות ניתן לחתוך מכל הצדדים, כדי להקל על החדירה של קיבוע לתוך הרקמה.
טרום הסתננות עובי דופן התא והרקמה הסקלרידית הן התכונות האנטומיות המשפיעות ביותר על חלחול תמיסות המאפשרות קיבוע וחדירה אופטימליים של הדגימה. מטרתם של סקלרידים ברקמת הצמח היא תמיכה מכנית והגנה, אשר יכולה להשפיע על תהליך החדירה33. מכיוון שלרקמות אלה יש קירות תאים מעובים מאוד, חלחול של תמיסות יכול להיות מעוכב. דגימות שיש להן בעיות חדירה גורמות למקטעים דקים למחצה עם תאים שבורים וקרעים בשרף (איור 5C,D). חתך אורכי גורם לעיוות בתאים, מה שגורם להטיות בניתוחים אנטומיים ובמדידה של תכונות עלים כמו גודל תא וצפיפות תאים (איור 5F-H).
חדירת שרף חתך איכותי חיוני לתצפית על רקמות אנטומיות, המושפעות ישירות מהמדיום שבו הדגימה מוטמעת. אמצעי ההטבעה הנפוצים ביותר המשמשים בהיסטולוגיה של צמחים הם שעוות פרפין, אפוקסי ושרפים אקריליים34,35. הטבעה בשעווה דורשת הכנת דגימות על ידי קיבוע כימי, וחדירה עם שעווה נוזלית, אשר מתקשות בטמפרטורת החדר. חתכים אלה בדרך כלל גורמים למקטעים בעובי של 5-10 מיקרומטר, אשר, כפי שהודגם כאן, יכולים להיות מושגים באותה מידה ביד (איור 2) ודורשים רקמה טרייה לא קבועה. במקרה זה, סידור התאים סביב מעטפת הצרור חיוני להבחנה בין צמחי C3 ו- C4, דבר הדורש שימוש במצע הטבעה חזק ונוקשה יותר. שרף אפוקסי (Spurr's resin36) ושרף אקרילי (LR White) נבדקו הן עבור קשיות, אריכות ימים, חדירת דגימה, כמו גם עמידות חתך במחקר זה. שרף אפוקסי משמש להטמעת חומר ביולוגי מזה עשרות שנים37. שרפים אקריליים הם חדשים יחסית ונחשבו בתחילה להטמעת דגימות צמחים בשל עמידותם לאורך זמן, שכן בניגוד לשרפים אפוקסיים, הם אינם דהויים כתוצאה מחשיפה לקרינת UV ונוטים פחות להתכווץ38. LR שרף אקרילי לבן (דרגה קשה) נבחר בשל נוסחתו שאינה רעילה ויציבה UV. שרפים אקריליים נוטים להיות הרבה פחות צמיגים משרף אפוקסי, מה שמאפשר חדירת דגימה מהירה יותר, וקשיות החומר מאפשרת חיתוך נקי יותר עם מיקרוטום39. איור 5C,D מראה את התוצאות של שרף אפוקסי בדגימות עלים עם כמות גדולה של רקמה מבנית, שבהן קרעים הם בלתי נמנעים בגלל הרכות של שרף אפוקסי, בהשוואה לשרף אקרילי (איור 3).
אולטרה-מיקרוטומיה חיתוך עודפי השרף עלול ליצור סדקים בשרף החודרים לתוך הדגימה. כדי להימנע מכך, חשוב לקחת בחשבון את הצפיפות והפריכות של השרף שנבחר להטמעה. חיתוך עמוק יותר לתוך הקטע צריך למנוע כל ממצאים הנגרמים על ידי יד או חיתוך סכין גס. הדגימה צריכה להיות מיושרת בניצב למחזיק הדגימה ומאומתת על ידי הגדלת ההגדלה דרך העינית, כמו גם צפייה בקטע קבוע ומוכתם. תאי צמח שאינם נחתכים בזווית ישרה לחלוטין מופיעים כתאים מחודדים שבהם קצה אחד גדול יותרמ-40 האחרים.
לאחר הכתמה כחול טולוידין (1% בתמיסה מימית) שימש להכתמת חלקים דקים למחצה שנחתכו על האולטרה-מיקרוטום. אם משאירים את הכתם להתייבש על החלק זמן רב מדי, התוצאה היא הכתמת יתר, מה שגורם לרוויית יתר של המקטע בעת הצילום (איור 5A). כאשר הכתם אינו מסונן היטב, התוצאה היא שחלקיקים לא מומסים מתייבשים על המקטע, מה שמעכב את ההדמיה של המבנים האנטומיים (איור 5B). ניתן להימנע מבעיה זו על ידי שימוש בפילטר עדין בעת הכנת תמיסה כחולה טולוידין וכן הגבלת החשיפה של החלק לכתם. הדגימות מיובשות על פלטה חמה בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס לפני הצביעה כדי להבטיח שהקטע נקשר למגלשת מיקרוסקופ הזכוכית, אך אין לחשוף אותן במשך יותר מ-10 שניות לכחול טולוידין לפני ששוטפים ומייבשים אותן שוב41 .
שיקולים במדידות אנטומיות המדידות המוצגות במאמר זה הן רק דוגמה לתכונות אנטומיות רבות שניתן להעריך כמותית באמצעות חתכים דקים למחצה, כולל שבריר ממרחב האוויר הבין-תאי, עובי מזופיל ממוצע (ללא רקמת כלי דם) ושטח פנים מזופיל החשוף לחללי אוויר בין-תאיים ליחידת שטח עלה42. עם זאת, בעוד גודל תא נדן צרור הוא אינדיקטור חשוב להבדיל בין מטבוליזם C3 ו- C4, עובי דופן תא נדן צרור הוא תכונה חשובה נוספת שלא ניתן לראות על סמך מיקרוסקופ אור בלבד, כפי שהוא קובע את מידת הדליפה של תאי מעטפת צרור, כלומר, כמות CO2 בחזרה מתפזר לתוך תאי מזופיל42, 43. דליפה גבוהה מפחיתה את יעילות הפוטוסינתזה, מכיוון שחלק גדול מהאנרגיה המשמשת לקיבועCO2 על ידי קרבוקסילאז PEP אובד 44,45,46. עבור ניתוחים אולטרה-מבניים כאלה, נדרשים מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת וניתוחי תמונה. למרות שרק מיקרוסקופ אור נלקח בחשבון במחקר הנוכחי, הפרוטוקול כולל את הטיפול באוסמיום טטרוקסיד, חומר מנוגד ומקבע המהווה אבן פינה למיקרוסקופ TEM. לכן דגימות פולימריות עדיין יכולות לשמש לניתוח TEM בכל פעם שמתעורר הצורך, גם אם לא נלקח בחשבון בזמן ההכנה.
למרות שאבחון אנטומי יכול לזהות בקלות מבנים דמויי קרנץ, ניתן לאבחן את נוכחותו של C4 על ידי מדידות חילופי גזים שיכולות להראות פיזיולוגיה טיפוסית של C4, כלומר, נקודת פיצוי CO2 נמוכה, עיכוב O2 מוגבל של פוטוסינתזה והרכב איזוטופ פחמן שונה 2,4,47.
כמו כן יש לציין כי האנטומיה של קראנץ אינה הכרחית להתפתחות פוטוסינתזה של C4, כפי שניתן לראות בגילוי של צמחים חד-תאיים C4 48,49,50. ניתוח אנטומי לבדו עשוי, אם כן, שלא להספיק כדי לגלות פיזיולוגיה של C4 בטקסים פחות נחקרים. הצימוד של אפיון אנטומי עם ניתוח פיזיולוגי מציע כלים רבי עוצמה לחקר תכונות העלים ויחסי מבנה-תפקוד שלהם הן בגידולים והן בצמחי בר.

פוטוסינתזה היא תהליך בסיסי שבו אנרגיית האור מומרת לאנרגיה כימית, ומשמשת כאבן הפינה של רשתות טרופיות יבשתיות. רוב הצמחים עוקבים אחר מסלול C3 של פוטוסינתזה, שבו המוצר הפוטוסינתטי העיקרי הוא תרכובת שלושת הפחמן גליצראט 3-פוספט. פוטוסינתזה C3 התפתחה לפני יותר מ-2 מיליארד שנה באטמוספירה השופעתCO2 ונמוכה ב-O21. האנזים הפוטוסינתטי העיקרי ריבולוז 1,5 ביספוספט קרבוקסילאז/אוקסיגנאז (רוביסקו), שהתפתח בתנאים אלה, אינו אופטימלי לתנאי CO2 גבוהים O2 הנוכחיים מכיוון שהוא מגיב באופן תחרותי עם O2, ומתחיל פוטו-נשימה2. פוטו-נשימה היא מסלול בזבזני שצורך אנרגיה במקום לייצר אותה ולשחררCO2 כתוצר לוואי. כתוצאה מכך, חיוני לשמור על ריכוז CO2 גבוה סביב רוביסקו בכלורופלסטים כדי למנוע חמצון 3,4. בשל חוסר היכולת של צמחי C3 לרכז CO2, יש משיכה משמעותית של CO2 מאוויר הסביבה לכלורופלסטים, מה שמרסן את הפוטוסינתזה ומשפיע על צמיחת הצמחים וייצור ביומסה 2,5,6.
בצמחי C3, הפוטוסינתזה מוגבלת על ידי כניסתCO2 דרך פיוניות, דיפוזיה שלו דרך מזופיל, והפעילות הביוכימית של אנזימים פוטוסינתטיים. כניסתCO2 מוגבלת תחילה על ידי מוליכות סטומטלית, הנשלטת על ידי תנאים סביבתיים כגון טמפרטורת אוויר ולחות. לאחר מכןCO2 מתפזר דרך הפאזה הגזית והנוזלית הפנימית של העלה לרוביסקו7. בצמחי C3, כל שלבי הפוטוסינתזה מתרחשים בכלורופלסטים של תאי מזופיל, וצמחים צריכים לשמור על זרימה קבועה שלCO2 מהאטמוספרה לכלורופלסטים. התלות של זמינותCO2 בכלורופלסטים בפתיחות סטומטלית, ארכיטקטורת מזופיל ומאפיינים בודדים של תאים וכלורופלסטים מותירה צמחים רגישים לאילוצים סביבתיים שבסופו של דבר משפיעים על הפוטוסינתזה, כמו זמינות מים נמוכה וטמפרטורות גבוהות 7,8,9,10, במיוחד מדגישות את פגיעותם לתנאי שינוי האקלים 11.
בהתחשב באתגרים שמציב חוסר היעילות של מסלול C3, כמו גם מגבלות בשמירה על רמות CO2 אופטימליות ורגישות לגורמים סביבתיים, בצמחים מסוימים, התפתח מסלול אחר, מסלול פוטוסינתזה C4. באופן אופייני, לצמחי C4 יש שני מסלולים ביוכימיים מופרדים מרחבית; קיבועCO2 הראשוני מתרחש בתאי מזופיל על ידי פוספונולפירובט קרבוקסילאז, שיש לו זיקה גבוהה יותר ל-CO2 מאשר רוביסקו וגם חסר פעילות חמצון. תוצר C4 שנוצר מועבר עוד יותר לתאי מעטפת צרור, שם הוא עובר דה-קרבוקסילציה, ו-CO2 משתחרר שוב ומקובע על ידי רוביסקו (C3 פוטוסינתזה)12,13,14. הזיקה הגדולה יותר של PEP carboxylase ל-CO2 ודפנות תאים עבות של תאי מעטפת צרור מאפשרת ריכוזCO2 בתאי מעטפת צרור, ולכן, צמחי C4 ממזערים את הפוטו-נשימה על ידי הפרדה מרחבית של קיבוע CO2 ומחזור קלווין. אימוץ מסלול C4 מציג את התגובה האדפטיבית של הטבע לאילוצים סביבתיים, ומציע תובנות לגבי אסטרטגיות אפשריות לשיפור פריון היבול ועמידותו בתנאי אקלים משתנים15.
האנטומיה המיוחדת של מבנה העלה בצמחי C4 מאופיינת בורידים המוקפים בתאי מעטפת צרור וסקולריים מוגדלים המכילים כלורופלסטים ובסידור רדיאלי של תאי מזופיל בטבעת חיצונית המעוצבת סביב תאי מעטפת צרור. תאי המזופיל נמצאים בסמיכות לתאי מעטפת הצרור, מה שמאפשר מעבר מהיר ורציף של מטבוליטים בין שני סוגי התאים. סידור התא אופייני לצמחי C4 ומכונה אנטומיה16 של קרנץ. במינים מסוג C3, ההתמחות והנטייה של תאי מזופיל יכולות להשתנות, אך תאי מעטפת צרור קטנים יותר באופן מובהק ויש בהם מעט כלורופלסטים או ללא כלורופלסטים כלל. אנטומיה ספציפית של Kranz מאפשרת ריכוזCO2 בכלורופלסטים בתאי מעטפת צרור שבהם נמצא האנזים C 3-carboxylating Rubisco ומעכבת למעשה את הנשימה הפוטו-רספירטיבית 4,17,18. למרות הסידור המורכב לכאורה, שינויים אלה התרחשו באופן עצמאי מספר פעמים באבולוציה של אנגיוספרם, מה שמצביע על כך שמדובר במסלול אבולוציוני אפשרי יחסית 19,20,21, וטקסות שונות הוכחו כנמצאות בשלב ביניים בין מטבוליזם פחמן C3 ו- C 4, המכונה C3-C 4 או C2, בעל יכולות ריכוז והטמעה מחדש של CO2 22,23,24,25.
צמחי C4 רבים הם גידולים בעלי חשיבות כלכלית גבוהה, והנדסה גנטית של גידולי C3, כמו אורז, כדי לשפר את החוסן האקלימי שלהם ולהבטיח את היבול הייתה נושא מעניין בעשורים האחרונים26,27. עם זאת, מאמצי ההנדסה דורשים הבנה מפורטת של האנטומיה המיוחדת של C4 וכיצד היא שולטת בפוטוסינתזה 2,28.
ביסוס האנטומיה של C4 Kranz הוא תנאי מוקדם להשגת היעד השאפתני של הנדסת פוטוסינתזה C4 לתוך C3 גידולים25. עם זאת, ההבנה הנוכחית של ויסות האנטומיה של קרנץ ושיטות לסינון מהיר של תכונותיו האנטומיות העיקריות מוגבלת, מה שמקשה על זיהוי מינים היברידיים. מחקרים קודמים הראו כי תכונות מפתח המווסתות את היעילות הפוטוסינתטית בצמחי C3 ו- C4 כוללות את המרחק הבין-ורידי, קוטר קומפלקס מעטפת הצרור וגודל תאי מעטפת הצרור14,29. ניתן לסנן תכונות אלה בקלות באמצעות חתכים חופשיים ולנתח כמותית באמצעות חתכים דקים למחצה. במאמר זה נתאר את שיטת הערכת התכונות המאפשרות אבחון התמיינות אנטומית C3 ו-C4 באמצעות מיקרוסקופ הצלבה ואור ביד חופשית, כלומר אזור מעטפת הצרור, המרחק הבין-ורידי ותדירות הוורידים.

<table><tbody><tr><td>דיסודיום מימן פוספט דיהידראט (Na2HPO42H2O) PENTA טהור</td><td>, CZ</td><td>10028-24-7</td><td></td></tr><tr><td>סרט הטבעה, 7.8 מיל עובי, 8 x 12.5, (203 x 318 מ"מ)</td> <td>ACLAR, US</td><td>10501-10</td><td></td></tr><tr><td>אתנול, abs. 100% a.r.</td><td>Chem-Lab NV, BE</td><td>CL00.0505.1000</td><td>סכנה: נוזל ואדים דליקים מאוד.</td></tr><tr><td>EVOS Invitrogen FL Auto 2 מערכת הדמיה</td><td>Thermo Fisher Scientific, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תבנית PTFE שטוחה עם מסגרת מתכת, 16 חללים</td><td>PELCO, ארה"ב</td><td>10501</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקון זכוכית 2 מ"ל</td><td>VWR מדעי החיים, ארה"ב</td><td>548-0045</td><td></td></tr><tr><td>גלוטרלדהיד 50% פתרון</td><td>VWR מדעי החיים, ארה"ב</td><td>23H2856331</td><td>סכנה: קטלנית בשאיפה. רעיל בבליעה. גורם לכוויות קשות בעור ולנזק לעיניים. עלול לגרום לגירוי בדרכי הנשימה. ללבוש כפפות מגן, ביגוד מגן, עיניים והגנה על הפנים.</td></tr><tr><td>סכין יהלום היסטו</td><td>דיאטומה, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LEICA EM UC7</td><td>Leica Vienna, AT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LR שרף לבן בדרגה קשה</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית, ארה"ב</td><td>14383</td><td>סכנה: גורם לגירוי בעור. גורם לגירוי חמור בעיניים עלול לגרום לגירוי בדרכי הנשימה. עלול לגרום לנמנום או סחרחורת ללבוש כפפות מגן, ביגוד מגן, הגנה על העיניים והפנים.</td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ</td><td>Normax, PT</td><td>5470308A</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse E600 ו-Nikon DS0Fi1 5 MP</td><td>Nikon Corporation, JP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Osmium Tetroxide (OsO4)</td><td>Agar Scientific Ltd, GB</td><td>R1019</td><td>סכנה: קטלנית במקרה של בליעה, במגע עם העור או במקרה של שאיפה. גורם לכוויות עור חמורות ולנזק לעיניים ללבוש כפפות מגן כפולות, ביגוד מגן, הגנה על העיניים והפנים.</td></tr><tr><td>קצות פיפטות ופיפטות</td><td>תרמו סיינטיפיק, FI</td><td>KJ16047</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דימימן פוספט דיהידראט (NaH2PO4 . 2H2O) טהור</td><td>PENTA, CZ</td><td>13472-35-0</td><td></td></tr><tr><td>מזרק 10 מ"ל</td><td>Ecoject, DE</td><td>20010</td><td></td></tr><tr><td>כחול טולואידין, כיתה כללית</td><td>פישר סיינטיפיק, GB</td><td>2045836</td><td></td></tr></tbody></table>

הערכת תכונות מבניות ב- triticum aestivum ו - zea mays עבור התמיינות פוטוסינתטית c3 ו- c4 באמצעות חתכים חופשיים ודקים למחצה

Assessing Structural Traits in Triticum aestivum and Zea mays for C3 and C4 Photosynthetic Differentiation Using Free-hand and Semi-thin Sections

היעילות המשופרת של פוטוסינתזה C4 , בהשוואה למנגנון C3 , נובעת מיכולתו לרכזCO2 בתאי מעטפת צרור. היעילות של פוטוסינתזה C4 ויעילות השימוש הפנימי במים קשורות ישירות לחלקם של תאי עלי מזופיל וצרור, גודל וצפיפות של נדן צרור, וגודל, צפיפות ועובי דופן התא של תאי מעטפת צרור. ניתוח מיקרוסקופי מהיר של תכונות אלה יכול להתבצע על מקטעים חופשיים ודקים למחצה באמצעות מיקרוסקופ אור קונבנציונלי, ומספק מידע רב ערך על יעילות פוטוסינתטית בגידולי C4 באמצעות זיהוי ובחינה של סוגי תאים ספציפיים. בנוסף, מוצגות טעויות בהכנת חתך חופשי וחצי דק המשפיעות על מדידות אנטומיות ואבחנות סוג התא, כמו גם כיצד להימנע משגיאות אלה. גישה מיקרוסקופית זו מציעה אמצעי יעיל לאיסוף תובנות על הסתגלות פוטוסינתטית לשונות סביבתית ומסייעת בסינון מהיר של יבולים לאקלים עתידי.

איור 1A מראה את הכיוון הנכון לחיתוך העלה הן עבור חתך טרי והן עבור מיקרוסקופ אור. את השיטה לחיתוך מקטעים טריים באמצעות סכין גילוח חד-צדדי ויריעת שעווה דנטלית ניתן לראות באיור 1B. המקטעים המתקבלים מוצגים באיור 1C.
איור 2 מראה חתכים חופשיים של עלים מייצגים של צמח C.3 T . aestivum וצמח C4 Z. mays. תאי מעטפת צרור נראים סביב הווריד, כאשר לתירס יש תאים עגולים וירוקים יותר, מה שמצביע על נוכחות גבוהה יותר של כלורופלסטים. ניתן לקבל עובי עלה ושטח נדן צרור כולל מתמונות אלה; עם זאת, אפיון נוסף של מזופיל אינו אפשרי בשיטה זו.
איור 3 מראה חתכים דקים למחצה של T. aestivum ו-Z. mays. בשיטה זו, כל רקמות העלה גלויות ומדידות. האנטומיה של קראנץ ניכרת אצל Z. mays, עם תאי מזופיל מסודרים סביב הוורידים. מעטה הצרור מוגדל ומלא בכלורופלסטים, בעיקר מרוכזים לכיוון תאי המזופיל. זה מאפשר חילוף מהיר של מטבוליטים בין תאי מעטפת צרור ותאי מזופיל. מתמונות אלה נמדדו התכונות המבניות הבאות של העלים: מרחק בין-ורידי בין ורידים קטנים וגדולים, קוטר נדן הצרור, שטח נדן צרור כולל, אזור הוורידים, חלק משטח תאי מעטפת הצרור, אזור תאי מעטפת צרור, תדירות ורידים בטווח של 500 מיקרומטר ועובי עלה. תרשימי קופסאות באיור 4 מראים את ההבדל בתכונות כאלה בין T. aestivum ו-Z. mays. כל התכונות מלבד אחת, המרחק הבין-ורידי בין ורידים גדולים, שונות באופן משמעותי ברווח בר-סמך של 95% עם ערך p &lt; 0.05.
איור 4 מראה אוסף של תרשימי קופסאות המייצגות את הבדלי התכונות האנטומיות בין T. aestivum ו-Z. mays, ומדגימים את ההבדלים בין מבני מעטפת צרור C3 ו-C4 . קיימת הבחנה משמעותית בין המרחקים הבין-ורידיים בין מיני הגידולים, קוטר נדן הצרור (באותם תנאי גידול), שבר תאי מעטפת הצרור והחומר הלא-פוטוסינתטי (כלומר, ורידים), ותדירות הוורידים ברוחב חתך של 500 מיקרומטר - כל אלה מעידים מאוד על הצפוי בין אנטומיה של עלה C3 ו-C4 .
איור 5 מראה כמה דוגמאות לטעויות שסביר שיתרחשו בעת חיתוך או הכנת הדגימות. האנטומיה של העלה בתמונות אלה מוסווית או מעוותת ולכן אינה אמינה לאפיון. הכתמת יתר בכחול טולוידין יכולה להתרחש במקטעים שנחתכו עם האולטרה-מיקרוטום שבהם הכתם נשאר זמן רב מדי, ובכך לטשטש את מבנה התא (איור 5A,B). טעויות נפוצות יכולות להתרחש במהלך פרוטוקול חדירה שבו השרף אינו חודר במלואו לרקמות העלה (איור 5C,D). חתכי עלים שנחתכים לאורך הגרגר יוצרים תאים מלבניים שבהם לא ניתן לאתר או למדוד נכון את תאי מעטפת המזופיל והצרור (איור 5F,G,H).
ניתוחים סטטיסטיים נערכו ב-R (גרסה 4.3.1) כדי ליצור קופסאות. תכונות אנטומיות של עלים נמדדו בטריפליקט (3 עלים לצמח, 3 צמחים לכל מין).
<img alt="הגדרת כרומטוגרפיה של חתך עלה; מיצוי פיגמנט ירוק. תרשים שלבים להפרדת פיגמנטים." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66843/66843fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> איור 1: שיטה נכונה לחיתוך חתכי עלים טריים. (A) כיוון חתכי העלה לצורך קבלת חתך רוחב. (B) טכניקה לחיתוך עלים באמצעות סכין גילוח חד-צדדי על פיסת שעווה שטוחה. (C) חתכי הרוחב המתקבלים מופיעים כרסיסי עלים דקים המוכנים להרכבה על מגלשת זכוכית ולצפייה מתחת למיקרוסקופ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66843/66843fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="מיקרוסקופ חתך של מבנה עלי הצמח, קשקשים של 50 מיקרומטר ו-100 מיקרומטר, פירוט רקמת כלי הדם." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66843/66843fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> איור 2: חתכים ביד חופשית של עלים מייצגים. (A) צמח C3 Triticum aestivum (הגדלה פי 400); ו-(B) הצמח C4 Zea mays at (הגדלה פי 200). סוג התא מסומן על ידי חצים, כאשר V = וריד, BSC = תא נדן צרור, ו- MC = תא מזופיל. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66843/66843fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="דיאגרמת אנטומיה של צמחים המציגה חתך צרור כלי דם עם תוויות לרקמות ומבנים." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66843/66843fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> איור 3: חתכים דקים למחצה. (A) Zea mays ו-(B) Triticum aestivum כדי להראות את ההבדלים במעטה צרור ובמיקומי הכלורופלסט במינים C4 עם אנטומיה של Kranz (A) ו-C3 ללא אנטומיה של Kranz (B). קיצורים: Tl = עובי עלה, BS = נדן צרור, SV = וריד קטן, ID = מרחק בין-ורידי ו-LV = וריד גדול. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66843/66843fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="תרשימי קופסה המשווים בין T. aestivum ו-Z. mays באמצעות מבחן T; המדדים כוללים SY-HD, LV-ID ו-VBA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66843/66843fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> איור 4: תרשימי קופסה המראים את ההבדל בתכונות אנטומיות בין Triticum aestivum ו-Zea mays. (A) מרחק בין-ורידי בין ורידים קטנים, (B) מרחק בין-ורידי בין ורידים גדולים, (C) קוטר נדן צרור, (D) שטח נדן צרור כולל, (E) אזור ורידים, (F) חלק מאזור תאי מעטפת צרור, (G) אזור תאי מעטפת צרור, (H) תדירות ורידים בטווח של 500 מיקרומטר ו-(I) עובי העלה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66843/66843fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="תמונות מיקרוסקופיות של חתכי רקמת צמחים, המדגישות את מבנה התא והאנטומיה." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66843/66843fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> איור 5: דוגמאות לטעויות נפוצות שעלולות להתרחש בעיבוד רקמות, המסומנות על-ידי חיצים אדומים. צביעת יתר בדגימות המשובצות בשרף אקרילי לבן LR (A) Triticum aestivum ו-(B) Zea mays; קרעים בשרף במקטעים המשובצים בשרף האפוקסי של Spurr (C) Ceratozamia robusta ו-(D) Dioon mejiae; T. חתכים חופשיים המראים (E) חתך רוחב ו-(F) חתך אורך; הטיה בחתך עקב חתכים אלכסוניים ב-(G) Annona muricata ו-(H) Encephalartos villosus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66843/66843fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>תמיסה</td>
			<td colspan="3">הכנה</td>
			<td>נפח סופי</td>
		</tr><tr><td>בסיס למאגר 1</td>
			<td colspan="3">להמיס 7.12 גרם של Na2HPO4 . 2H2O ב-200 מ"ל מים מזוקקים</td>
			<td>200 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>בסיס למאגר 2</td>
			<td colspan="3">להמיס 7.12 גרם של NaH2PO4 . 2H2O ב 200 מ"ל של מים מזוקקים</td>
			<td>200 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>תמיסת חיץ פוספט</td>
			<td colspan="3">מערבבים 36 מ"ל של בסיס 1, 14 מ"ל של בסיס 2 ו 50 מ"ל של מים מזוקקים</td>
			<td>100 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>פתרון קיבוע</td>
			<td colspan="3">יש לערבב 9.25 מ"ל של 5% גלוטראלדהיד (זהירות: ראו טבלת חומרים), 12.5 מ"ל של חיץ פוספט ו-28.25 מ"ל מים מזוקקים. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.</td>
			<td>50 מ"ל</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: מתכון לפתרון הקיבוע.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td colspan="2">צעד</td>
			<td colspan="6">תיאור</td>
			<td>משך</td>
			<td>חוזר</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td colspan="2">שטיפה עם חיץ</td>
			<td colspan="6">הסר בעדינות את הקיבוע עם פיפטה והוסף את חיץ הפוספט עד לכיסוי הדגימה. להשאיר למשך 30 דקות.</td>
			<td>30 דק'</td>
			<td>פי 3</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td colspan="2">צביעה עם 1% אוסמיום טטרוקסיד</td>
			<td colspan="6">(זהירות: ראו טבלת חומרים): הסירו את חיץ הפוספט עם פיפטה והוסיפו את האוסמיום טטרוקסיד עד לכיסוי הדגימה. דגימות וחומר אורגני אחר יהפכו שחורים. יש להשתמש בכפפות כפולות.</td>
			<td>60 דק'</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td colspan="2">שטיפת הדגימות במים מזוקקים</td>
			<td colspan="6">הסר את הפתרון הקודם עם פיפטה ולכסות את הדגימות עם מים מזוקקים. להשאיר למשך 30 דקות. חזור על שלב זה 3x. יש להשתמש בכפפות כפולות.</td>
			<td>30 דק'</td>
			<td>3 פעמים</td>
		</tr><tr><td>4</td>
			<td colspan="2">חדירת סדרת אתנול</td>
			<td colspan="6">הסר את התמיסה הקודמת עם פיפטה ולכסות את הדגימות עם 50/50 מים מזוקקים אתנול פתרון. להשאיר למשך 30 דקות. חזור על שלב זה עם תמיסות מים-אתנול מזוקקות בסדרות הבאות: 30/70, 20/80, 10/90 ו-100% אתנול.</td>
			<td>30 דק'</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td colspan="2">חדירת סדרת שרף-אתנול</td>
			<td colspan="6">הסר את הפתרון הקודם עם פיפטה ולכסות את הדגימות עם 1/3 תמיסת שרף-אתנול. מניחים את הדגימות על צלחת מיקסר ומשאירים למשך שעתיים. חזור על שלב זה עם תמיסות שרף-אתנול בסדרות הבאות: 1/2, 1/1, 2/1, 3/1 ו-100% שרף.</td>
			<td>120 דק'</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>6</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td colspan="6">מאחסנים במקרר 72 שעות לפני פילמור</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>7</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td colspan="6">פילמור חלקי עלים שחדרו בהתאם למפרט המוצר כדי לקבל דגימות משובצות שרף.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>טבלה 2: פרוטוקול חדירת שרף.

הערכת ההבדלים האנטומיים בין חתכי העלים C3 ו- C4 מסייעת להבין את יעילות הפוטוסינתזה. מאמר זה מתאר הכנה ובדיקה של חתכי עלים חופשיים ודקים למחצה, יחד עם האזהרות בהכנה למיני היבול Triticum aestivum ו-Zea mays.

הערכת תכונות מבניות ב- Triticum aestivum ו - Zea mays עבור התמיינות פוטוסינתטית C3 ו- C4 באמצעות חתכים חופשיים ודקים למחצה

The enhanced efficiency of C4 photosynthesis, compared to the C3 mechanism, arises from its ability to concentrate CO2 in bundle sheath cells. The ...

assessing-structural-traits-triticum-aestivum-zea-mays-for-c3-c4

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

טכניקת התערבות RNA פעמיים תקועה (dsRNAi) היא מועסק ללמטה להסדיר את אנזים cinnamoyl תירס רדוקטאז גן (ZmCCR1) לתוכן ליגנין צמח נמוך יותר. ליגנין למטה תקנה מקיר התא דמיינו ידי ניתוח מיקרוסקופי ולכמת בשיטת Klason. שינויי הלחנה בhemicellulose ותאיים גבישים מנותחים.

ליגנין Down-תקנה של<em&gt; Zea mays</em&gt; באמצעות dsRNAi וKlason ליגנין ניתוח

פרוטוקול זה מתאר שיטת חיתוך רקמות פשוטה של חיתוך היברידי שימושית עבור רקמות צמחים סרבניות. קטעי רקמה באיכות טובה מאפשרים מחקרים אנטומיים ומחקרים ביולוגיים אחרים כולל הכלאה באתרה (ISH).

-Cut ההיברידי: שיטת חתך משופרת עבור דוגמאות רקמות צמח סרבן

לכימות חלוקת התאים והתרחבותם יש חשיבות מכרעת להבנת צמיחת הצמח השלם. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לחישוב פרמטרים תאיים הקובעים את קצב גידול עלי התירס ומדגישים את השימוש בנתונים אלה לחקירת מנגנוני ויסות צמיחה מולקולרית על ידי הכוונת אסטרטגיות דגימה ספציפיות לשלב ההתפתחות.

ניתוח קינמטית של חטיבה ואת הרחבת תא: כימות הבסיס הנייד של אזורי התפתחותית צמיחת הדגימה<em&gt; Zea Mays</em&gt; מותיר

אנו מספקים שיטה כדי לשפר את הניגודיות הקליטה רנטגן רקמת תירס מתאים סריקת טומוגרפיה microcomputed רגיל. על סמך CT תמונות, אנחנו מציגים את ערכה של זרימות עבודה של עיבוד תמונה עבור חומרים תירס שונים ביעילות לחלץ פנוטיפים מיקרוסקופיים של וסקולריים צרורות של תירס.

טכניקות Phenotyping בקנה מידה מיקרון של חבילות וסקולריים תירס מבוסס על צילום רנטגן טומוגרפיה Microcomputed

פרוטוקול זה מאפשר הכנת קטעים רוחביים של זרעי דגנים (למשל, אורז) לניתוח של מורפולוגיה של אנדוספרם וגרגר עמילן באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת.

חתך רוחבי של אורז בוגר (Oryza sativa L.) גרעינים לסריקת הדמיית מיקרוסקופיה אלקטרונית באמצעות טיפים פיפטה כתמיכה ללא תנועה

טכניקה זו מאפשרת הכנה מהירה ופשוטה של סעיף שרין בגודל זרע כולו לתצפית וניתוח של תאים, גרגרי ענבן, וגופים חלבון באזורים שונים של הזרע.

שיטת מקטע יבש פשוטה לקבלת מקטע שרב בגודל זרע שלם ויישומיו

פרוטוקול זה נועד לספק נהלים מפורטים לאיסוף, תיקון ותחזוקה של דגימות צמחים מיקוהטרוטרופיים, תוך יישום טכניקות מיקרוסקופיה שונות כגון מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת והולכה, מיקרוסקופיית אור, קונפוקלית ופלואורסצנטית כדי לחקור התיישבות פטרייתית ברקמות צמחים ובזרעים שנבטו בפטריות מיקוריזאליות.

טכניקות מיקרוסקופיה לפענוח התיישבות פטרייתית ברקמות צמחים מיקוהטרוטרופיים ונביטה סימביוטית של זרעים

מוצגת שיטה להדמיה בעלות נמוכה של צמחים למדידת פנוטיפים, יחד עם שיטות עבודה מומלצות ללכידת תמונות וצינור ניתוח תמונה לכימות תכונות הצמח. שיטות אלה יושמו למדידת פנוטיפים של תירס (Zea mays) תחת חום, בצורת ותנאי עקה אביוטיים משולבים.

הדמיה וניתוח לכימות תירס (Zea mays) פנוטיפים של מתח אביוטי

פרוטוקול זה מציג שיטה השוואתית להערכת תכונות סטומטליות ואפידרמליות בשני מינים מובחנים, באמצעות פילינג אפידרמלי, טכניקות ניקוי וניתוח תמונות בעזרת בינה מלאכותית. המטרה היא לאפשר כימות בתפוקה גבוהה וניתנת לשחזור של מבנים תאיים הבסיס לתפקוד הפיוניתי ליישומים חקלאיים ולמחקר צמחי רחב.

אפיון תכונות פטיחות ואפידרמליות באמצעות פילינג, ניקוי וניתוח תמונות מבוסס בינה מלאכותית

בזאת הוא תיאר את ההליך מיושם קבוצת מבניים ותפקודיים ביולוגיה קאפרי ממברנה להגדיר באופן ידני ניסויים התגבשות של חלבונים בממברנה ב mesophases lipidic.

גיבוש חלבונים בממברנה עבור קביעת מבנה באמצעות Mesophases Lipidic

חקור את ההבדלים האנטומיים בין צמחי C3 ו-C4 באמצעות חתכים חופשיים ודקים למחצה ב-Triticum aestivum ו-Zea mays. השיטה מסייעת לחוקרים להבין את יעילות הפוטוסינתזה ולשפר את חוסן הגידולים לשינויי האקלים.

הערכת תכונות מבניות ב- Triticum aestivum ו - Zea mays עבור התמיינות פוטוסינתטית C₃ ו- C₄ באמצעות חתכים חופשיים ודקים למחצה

גלה סרטונים נוספים