Name: זילוח כבד חולדה ובידוד הפטוציטים ראשוני: הליך ישן חיוני לתרבית אורגנואידים תלת-ממדית חדשנית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-22T13:20:00.000+00:00
Duration: 13 min 9 s
Description: למד שיטת זילוח כבד בקולגנזה לבידוד הפטוציטים ראשוניים בעכברוש. הפרוטוקול מאפשר תרבית ארוכת טווח של אורגנואידים תלת-ממדיים תפקודיים למחקר כבדי מתקדם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Heslop, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+evaluation+of+primary+human+hepatocyte+culture+using+global+proteomic+analysis+reveals+a+selective+dedifferentiation+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Mechanistic evaluation of primary human hepatocyte culture using global proteomic analysis reveals a selective dedifferentiation profile.</a> Arch Toxicol. 91 (1), 439-452 (2017).</li>
<li>Ietto, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+liver+organoids%3A+Generation+and+importance+of+diverse+specialized+cellular+components%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Multicellular liver organoids: Generation and importance of diverse specialized cellular components.</a> Cells. 12 (10), 1429(2023).</li>
<li>Dunn, J. C., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocytes+in+collagen+sandwich%3A+evidence+for+transcriptional+and+translational+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Hepatocytes in collagen sandwich: evidence for transcriptional and translational regulation.</a> J Cell Biol. 116 (4), 1043-1053 (1992).</li>
<li>Keemink, J., Oorts, M., Annaert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Hepatocytes+in+sandwich+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Mol+Biol+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Primary Hepatocytes in sandwich culture.</a> Methods in Mol Biol (Clifton, N.J). 1250, 175-188 (2015).</li>
<li>Kaur, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+hepatocyte+isolation+and+cultures%3A+Technical+aspects%2C+challenges+and+advancements%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering+%28Basel%2C+Switzerland%29%22%5BJournal%5D)">Primary hepatocyte isolation and cultures: Technical aspects, challenges and advancements.</a> Bioengineering (Basel, Switzerland). 10 (2), 131(2023).</li>
<li>Thompson, W. L., Takebe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+liver+model+systems+in+a+dish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Human liver model systems in a dish.</a> Dev Growth Differ. 63 (1), 47-58 (2021).</li>
<li>Takebe, T., Wells, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+by+design%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Organoids by design.</a> Science (New York, N.Y.). 364 (6444), 956-959 (2019).</li>
<li>Nantasanti, S., de Bruin, A., Rothuizen, J., Penning, L. C., Schotanus, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+organoids+are+a+powerful+tool+for+the+study+of+liver+disease+and+personalized+treatment+design+in+humans+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Concise review: organoids are a powerful tool for the study of liver disease and personalized treatment design in humans and animals.</a> Stem Cells Transl Med. 5 (3), 325-330 (2016).</li>
<li>Raju, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+pluripotent+stem+cell+differentiation+to+hepatocyte+ceases+further+maturation+at+an+equivalent+stage+of+e15+in+mouse+embryonic+liver+development%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">In vitro pluripotent stem cell differentiation to hepatocyte ceases further maturation at an equivalent stage of e15 in mouse embryonic liver development.</a> Stem Cells Dev. 27 (13), 910-921 (2018).</li>
<li>Peng, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+cytokine+TNFalpha+promotes+the+long-term+expansion+of+primary+hepatocytes+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Inflammatory cytokine TNFalpha promotes the long-term expansion of primary hepatocytes in 3D culture.</a> Cell. 175 (6), 1607-1619.e15 (2018).</li>
<li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+functional+mouse+and+human+hepatocytes+as+3d+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3d organoids.</a> Cell. 175 (6), 1591-1606.e19 (2018).</li>
<li>Michalopoulos, G. K., Bowen, W. C., Mulè, K., Lopez-Talavera, J. C., Mars, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocytes+undergo+phenotypic+transformation+to+biliary+epithelium+in+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology+%28Baltimore%2C+Md%29%22%5BJournal%5D)">Hepatocytes undergo phenotypic transformation to biliary epithelium in organoid cultures.</a> Hepatology (Baltimore, Md). 36 (2), 278-283 (2002).</li>
<li>Schaub, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+formation+of+the+biliary+system+by+TGF%CE%B2-mediated+hepatocyte+transdifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">De novo formation of the biliary system by TGFβ-mediated hepatocyte transdifferentiation.</a> Nature. 557 (7704), 247-251 (2018).</li>
<li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLancaster%2C+MA+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22">Science (New York, N.Y.)</a>. 345 (6194), 1247125(2014).</li>
<li>Huch, M., Koo, B. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+mouse+and+human+development+using+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Modeling mouse and human development using organoid cultures.</a> Development (Cambridge, England). 142 (18), 3113-3125 (2015).</li>
<li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+isolated+rat+liver+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods in Cell Biol. 13, 29-83 (1976).</li>
<li>Ng, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+primary+rat+hepatocytes+with+multiparameter+perfusion+control%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of primary rat hepatocytes with multiparameter perfusion control.</a> J Vis Exp. (170), e62289(2021).</li>
<li>Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q. -H., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+primary+culture+of+rat+hepatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and primary culture of rat hepatic cells.</a> J Vis Exp. (64), e3917(2012).</li>
<li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+hepatocytes+and+sinusoidal+endothelial+cells+from+mouse+liver+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion.</a> J Vis Exp. (132), e56993(2018).</li>
<li>Charni-Natan, M., Goldstein, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+primary+mouse+hepatocyte+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for primary mouse hepatocyte isolation.</a> STAR protoc. 1 (2), 100086(2020).</li>
<li>Smith, A. J., Clutton, R. E., Lilley, E., Hansen, K. E. A., Brattelid, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PREPARE%3A+Guidelines+for+planning+animal+research+and+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">PREPARE: Guidelines for planning animal research and testing.</a> Lab Anim. 52 (2), 135-141 (2018).</li>
<li>Kluiver, T. A., Kraaier, L. J., Peng, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+murine+primary+hepatocyte+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biol+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of murine primary hepatocyte organoids.</a> Methods in Molecular Biol (Clifton, N.J). 2544, 1-13 (2022).</li>
<li>Shulman, M., Nahmias, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+and+coculture+of+primary+rat+and+human+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biol+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Long-term culture and coculture of primary rat and human hepatocytes.</a> Methods in Molecular Biol (Clifton, N.J). 945, 287-302 (2013).</li>
<li>Knobeloch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hepatocytes%3A+isolation%2C+culture%2C+and+quality+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biol+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Human hepatocytes: isolation, culture, and quality procedures.</a> Methods in Molecular Biol (Clifton, N.J). 806, 99-120 (2012).</li>
<li>Queral, A. E., DeAngelo, A. B., Garrett, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+different+collagenases+on+the+isolation+of+viable+hepatocytes+from+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Effect of different collagenases on the isolation of viable hepatocytes from rat liver.</a> Anal Biochem. 138 (1), 235-237 (1984).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>A83-01- מעכב ALK5 IV</td><td>סליל תאומים</td><td>&nbsp; T3031</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>0080085SA</td><td></td></tr><tr><td>CFX Connect מערכת זיהוי PCR בזמן אמת&nbsp;</td><td>&nbsp; Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Twin Helix</td><td>T2310</td><td></td></tr><tr><td>Click EdU Alexa 488 ערכת הדמיה</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>C10499</td><td></td></tr><tr><td>קולגן, סוג I, תמיסה מזנב עכברוש</td><td>Merck</td><td>C3867-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethasone&nbsp;</td><td>Merck</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Merck</td><td>&nbsp; E9644</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Euroclone</td><td>ECS0180L</td><td></td></tr><tr><td>GELTREX LDEV FREE RGF BME</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A1413202</td><td></td></tr><tr><td>הפרין נתרן 25000 יחב"ל/5 מ"ל</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>B01AB01</td><td></td></tr><tr><td>HGF</td><td>Peprotech</td><td>&nbsp; 100-39H&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת אינסולין-טרנספרין-סלניום 100x&nbsp;</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>41400045</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת L-גלוטמין</td><td>Euroclone</td><td>ECB3000D</td><td></td></tr><tr><td>Liver Digest Medium&nbsp;</td><td>תרמופישר סיינטיפיק</td><td>&nbsp; 17703-034</td><td></td></tr><tr><td>Liver Perfusion Medium</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>17701038</td><td></td></tr><tr><td>תוסף N2</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylcysteine</td><td>Merck</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Merck</td><td>&nbsp; N-0636</td><td></td></tr><tr><td>חומצות אמינו לא חיוניות</td><td>Merck</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>Normocin</td><td>Aurogene</td><td>ant-nr-1</td><td></td></tr><tr><td>PBS buffer 1X</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A0964,9050</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין 100x</td><td>Euroclone</td><td>ECB3001D</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-296039A</td><td></td></tr><tr><td>משאבה פריסטלטית</td><td>איסמטק וסחר; &nbsp;</td><td>MS-4/12 משאבה דיגיטלית Reglo TNFa</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Peprotech</td><td>&nbsp; 300-01A</td><td></td></tr><tr><td>TRI ריאגנט</td><td>Merck</td><td>T9424</td><td></td></tr><tr><td>צינורות&nbsp;</td><td>איסמטק וסחר; &nbsp;</td><td>&nbsp; ID.2,79 מ"מ</td><td></td></tr><tr><td>וויליאמס E בינוני, ללא גלוטמין</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>31415029</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Twin Helix</td><td>T1725</td><td></td></tr></tbody></table>

זילוח כבד חולדה ובידוד הפטוציטים ראשוני: הליך ישן חיוני לתרבית אורגנואידים תלת-ממדית חדשנית

Rat Liver Perfusion and Primary Hepatocytes Isolation: An Old Procedure Crucial for Cutting-Edge 3D Organoids Culture

בסוף הליכי ההקמה (שלב 6.13), קיבלנו תפוקת תאים של עד 1 x 108 תאים לכל בידוד מהכבד של כ -300 גרם של חולדה. יכולת הקיום של תאים בין 78% ל-97% נקבעה על ידי ספירה כחולה של טריפאן.
כפי שכבר תואר במחקרים קודמים 1,18,19, הפטוציטים הראשוניים בתרבית מאבדים את המורפולוגיה שלהם, תפקודים ספציפיים לכבד, ומתים תוך מספר ימים.
ידוע בספרות23,24 כי הפטוציטים בוגרים ראשוניים מאבדים במהירות את המורפולוגיה הקובואידית-משושה, הופכים לצורה "דמוית פיברובלסט" תוך מספר ימים, ומתים. איור 1 מתאר את השלבים השונים: 4 שעות לאחר ציפוי על צלחת מצופה קולגן, הפטוציטים נצמדים לפני השטח ומתפשטים בשכבה אחת טיפוסית שמראה מורפולוגיה קובואידית, קצוות התאים מוגדרים, הצמתים בין התאים ליניאריים ופני השטח של התאים נראים חלקים (איור 1A). ביום 1, הפטוציטים הראשוניים מקבלים את צורתם המשושה הטיפוסית, וטיפות שומנים נעשות גלויות (איור 1B). בימים 2-3 טיפות השומנים גדלות (איור 1C-1D), ואילו בימים 4-5 התאים צוברים סיבי עקה של אקטין (איור 1E-F). הערכנו גם את אחוז התאים בני קיימא בתרבית דו-ממדית ראשונית מיום 1 עד יום 5 והשווינו אותו לכדאיות לפני הציפוי ביום 0 (איור 2). ניתן לראות ירידה דרסטית בכדאיות כבר בימים הראשונים של התרבות, ולהגיע ל-49.5% (SD 12.7) ביום הראשון, אשר יורד ל-45.2% (SD 18.2) ביום השני ול-33.5% (SD 0.77) ביום השלישי. אחוז התאים הקיימים ביום 4 הוא כבר 16.9% (SD 5.4), ואילו ביום 5 מגיע ל-9.1% (SD 0.38). לכן, ברור כי אובדן המורפולוגיה מלווה מוות תאי מתקדם מהיר של הפטוציטים בוגרים בתרבית דו-ממדית.
הפטוציטים מבודדים, לפני ציפוי (יום 0), הראו ביטוי mRNA גבוה של גנים של סמן כבד (ABCD3, ALB, KRT18, PCK1, SERPIN, TDO2) שהוערכו על-ידי RT-qPCR (איור 3). כל הגנים שנותחו מראים ירידה תלוית זמן בתרבית של ביטוי כבר ביום הראשון בתרבית. רמות ביטוי ה-mRNA מדגישות את אובדן התפקוד והכדאיות של הפטוציטים הראשוניים במהלך הזמן.
הפטוציטים המבודדים צופו בטיפות מטריצה תלת-ממדיות ומבני תאים אורגנואידים תלת-ממדיים עקבו אחריהם לאורך זמן. ביום הראשון של התרבית, הפטוציטים בודדים מרחפים בטיפות המטריקס (איור 4A). ריכוז התאים נשמר נמוך בכוונה כדי לספק hepatocytes עם מספיק מקום לגדול. כמו כן, זה מאפשר לנו לעקוב חזותית אחר הצמיחה אורגנואידים. הפטוציטים ראשוניים הראו חלוקה תאית בימים הראשונים של התרבית (איור 4C). יתר על כן, בעוד שביום 0, Hep-Orgs נמדדו 30 מיקרומטר, ביום 2 Hep-Orgs כמעט הכפילו את ממדיהם, מה שהדגיש את צמיחת הגודל שנשמרה עד יום 15 (33.08 מיקרומטר ביום 1; 64.86 מיקרומטר ביום 2; 45.06 מיקרומטר ביום 5; 55.19 מיקרומטר ביום 7; 51.93 מיקרומטר ביום 10; 62.90 מיקרומטר ביום פיי 15). לגבי צורת הפ-ארגונים, בעוד שביום הראשון הם היו עגולים, הם הגיעו ל"צורת חבורת ענבים" (אופיינית לאורגנואידים בכבד) בימים שלאחר מכן.
הפטוציטים המצופים במטריצה תלת-ממדית נשארים בחיים בתרבית במשך שבועות, ומראים כדאיות של 23% ±10% לאחר 15 יום באמצעות בדיקת Trypan blue (איור 4B, שורה ראשונה). כדי לאמת את ההתפשטות של Hep-Orgs של חולדות, בוצעה בדיקת EdU ביום ה-15 (איור 4D). אף על פי כן, צביעת Hoechst הראתה מספר גבוה של תאים בודדים ולא Hep-Orgs, פעילות שגשוג של הפטוציטים (תאים ירוקים) הייתה נוכחת, גם אם שילוב EdU היה נמוך (9% ± 7%) (איור 4B, שורה שנייה).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66857/66857fig01.jpg"> איור 1: תרבית דו-ממדית של הפטוציטים ראשוניים על לוחות מצופים קולגן לאורך זמן. התמונות צולמו בהגדלה של פי 20 עם (A) מיקרוסקופ ניגודיות פאזה ב-4 שעות לאחר הציפוי, (B) יום 1, (C) יום 2, (D) יום 3, (E) יום 4, (F) יום 5. בכל תמונה מדווח סרגל קשקשים המתאים ל-50 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66857/66857fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66857/66857fig02.jpg"> איור 2: תאים ראשוניים בני קיימא בתרבית דו-ממדית על לוחות מצופים קולגן. הגרף מציג את אחוז התאים בני הקיימא מיום 1 עד יום 5, בהשוואה לתאים בני קיימא המצופים ביום 0, הנחשבים ל-100%. התוצאות מדווחות כמשכפלים בודדים, ממוצע ו-SD של 3 ניסויים שונים (* ערך p ≤ 0.05; ** ערך p ≤ 0.005). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66857/66857fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66857/66857fig03.jpg"> איור 3: ביטוי mRNA של סמני כבד שנמדד על-ידי RT-qPCR בהפטוציטים ראשוניים. התוצאות נורמלו על β-Actin ו / או GAPDH (גנים משק בית) והן מבוטאות ביחס להפטוציטים ראשוניים שנאספו לפני ציפוי ביום 0, נחשב 1. התוצאות מדווחות כממוצע ± SD של, לפחות, 3 ניסויים שונים (**+ ערך p ≤ 0.001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66857/66857fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66857/66857fig04.jpg"> איור 4: תרבית הפטוציטים תלת-ממדית בטיפות מטריצה לאורך זמן. (A) הפטוציטים מבודדים המצופים בטיפות מטריצה עבור Hep-Orgs ארוכי טווח: בתמונה, טיפות המטריצה נראות על פני השטח של הבאר (עיגול אדום = טיפה אחת). (B) אחוז התאים בני קיימא על ידי Trypan blue ותאים מתרבים על ידי EdU ביום 15 לפני המעבר. כימות תאים חיוביים EdU בוצע על ידי תוכנת ImageJ2. התוצאות מדווחות באחוזים כ±SD ממוצע של, לפחות, 3 ניסויים שונים. (C) תמונות ניגודיות פאזה של תרבית תלת-ממדית של חולדות Hep-Orgs בימים שונים של צמיחה בתרבות תלת-ממדית: יום 1, 2, 5, 7, 10, 15. הגדלת תמונה פי 20. בכל תמונה מדווח סרגל קשקשים המתאים ל-50 מיקרומטר. (D) בדיקת התאגדות EdU של חולדות Hep-Orgs ביום ה-15. הגדלת תמונה פי 20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66857/66857fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
טבלה 1: מאגרים והרכב מדיה. הטבלה מדווחת על השם והרכיבים (עם הריכוז הסופי שלהם) של כל המאגרים והמדיה התאית המשמשת בפרוטוקול. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66857/2024.05.08_Table%201.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
טבלה 2: רשימת פריימרים לחולדות. הטבלה מדווחת על רשימת הפריימרים המשמשים לניסויי RT-qPCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66857/2024.05.08%20Table%202.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>

Primary hepatocytes are a commonly used tool for in vitro liver-related studies. However, the maintenance of these cells has always been a challenge due ...

rat-liver-perfusion-primary-hepatocytes-isolation-an-old-procedure

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שיטה חדשנית להשיג מקרופאגים מתרבות העיקרי של תאים בכבד חולדה מתואר. שיטה זו מנצלת את ריבוי של מקרופאגים בתרבות, ואחריו רעד של צלוחיות תרבות וטיהור על ידי התקשרות סלקטיבית מנות פלסטיק. טכניקה זו יעילה מספק מקרופאגים הכבד ללא ציוד מיומנויות מורכבות.

שיטה פשוטה ויעילה על מנת לבודד המקרופאגים מתרבויות ראשי מעורבות של תאים בכבד למבוגרים

המחקר בתאי הכבד סינוסי אנדותל (שניות) חייב להתבצע עם תאים ראשוניים שהתקבלו החיה לא כמו שורות תאים קיימות. שיטה זו מסתמכת על מערכת העיכול הכבד צנטריפוגה ההפרש לטיהור SEC עבור culturing ניסויים עתידיים.

ב אנדוציטוזה כבד vivo ואחריו טיהור בתאי הכבד על ידי זלוף כבד

Hepatocytes ראשיים מספקים כלי רב ערך כדי להעריך ביוכימיים, פונקציות מולקולרית, ואת חילוף החומרים במערכת ניסיונית רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. אנו מתארים פרוטוקול אמין עכברוש זלוף הכבד באתרו, אשר באופן עקבי יוצר hepatocytes קיימא עד to1.0 ×...

בידוד תרבות ראשונית של תאים בכבד עכברוש

הליך זלוף collagenase שני שלבים שונה לבידוד של hepatocytes אדם מתואר. שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם לכבדים של יונקים אחרים. Hepatocytes מבודד זמינים בתשואה גבוהה וכדאיות, מה שהופך אותם המודל מתאים למחקר מדעי בתחומים כגון התחדשות כבד, פרמקוקינטיקה וטוקסיקולוגיה.

בידוד של hepatocytes האנושי על ידי שני שלבים Collagenase זלוף נוהל

מתוארת טכניקה לבידוד הפטוציטים אנושיים ותאי כבד לא פרנכימליים מאותו תורם. סוגי תאי הכבד השונים בונים את הבסיס למודלים תפקודיים של כבד והנדסת רקמות. שיטה חדשה זו שואפת לבודד תאי כבד בתפוקה גבוהה ובכדאיות.

פרוטוקול הבידוד של hepatocytes האדם הראשי הקביל סרן אוכלוסיות של תאים בכבד ללא parenchymal

המטרה של פרוטוקול זה היא להשיג הכדאיות גבוהה, תשואה גבוהה של hepatocytes ותאי אנדותל sinusoidal של הכבד. זו מושגת על ידי פרפוזיה הכבד עם פתרון collagenase IV סוג דרך וריד שער הכבד, ואחריו דיפרנציאלית צנטריפוגה כדי להשיג hepatocytes ותאי אנדותל sinusoidal.

טיהור של Hepatocytes ותאי אנדותל Sinusoidal מן הכבד העכבר זלוף

מוצג כאן הוא פרוטוקול לבידוד של העכבר hepatocytes מתוך כבדי העכבר למבוגרים באמצעות שונה קולגן הטכניקה הפרו הפרזיה. גם תיאר הוא התרבות ארוכת טווח של hepatocytes בקביעת כריך קולגן תלת-ממד, כמו גם immunolabeling של מרכיבים ציטושלד לחקר היווצרות המרה והתגובה שלה לטיפול.

בידוד וכריך קולגן 3D תרבות של העכבר הראשי Hepatocytes כדי ללמוד את התפקיד של שלד ציטוזה היווצרות של המרה בתוך מחוץ לגופית

הפטוציטים ראשוניים הם כלי רב ערך לחקר תגובת הכבד ומטבוליזם במבחנה. תוך שימוש בריאגנטים הזמינים באופן מסחרי, פותח פרוטוקול משופר ויעיל בזמן ובעבודה לבידוד הפטוציטים ראשוני של עכברים.

פרוטוקול יעיל יותר בזמן ובעבודה לבידוד הפטוציטים ראשוני של עכברים

פרוטוקול זה מפרט את השימוש בצנתר תוך ורידי מיוחד, צינורות חד פעמיים סטריליים סטנדרטיים, בקרת טמפרטורה בתוספת ניטור בזמן אמת, ומערכת אזעקה להליך זלוף קולגןאז דו-שלבי כדי לשפר את העקביות בכדאיות, בתפוקה ובפונקציונליות של הפטוציטים של חולדה ראשונית מבודדת.

בידוד של הפטוציטים ראשוניים של חולדות עם בקרת זלוף רב-פרמטרית

מערכת תרבות אורגנויד חוץ גופית חוץ גופית ארוכת טווח הוקמה מהפטוציטים של עכברים. אורגנוידים אלה ניתן לעבור מניפולציה גנטית על ידי זיהום lentivirus של בנייה shRNA / חוץ רחמי, transfection siRNA והנדסת CRISPR-Cas9.

מניפולציה ממסדית וגנטית של אורגנוידים של מורין הפטוציט

כאן, אנו מציגים שיטה חזקה עבור זילוח באתרו של כבד העכבר כדי ללמוד את הרגולציה החריפה והישירה של חילוף החומרים בכבד מבלי להפריע לארכיטקטורה הכבדית אלא בהיעדר גורמים מחוץ לכבד.

ייצור גלוקוז בכבד, אורגנזה וליפוליזה מכומתים באמצעות מודל הכבד של עכבר מחורר

למד שיטת זילוח כבד בקולגנזה לבידוד הפטוציטים ראשוניים בעכברוש. הפרוטוקול מאפשר תרבית ארוכת טווח של אורגנואידים תלת-ממדיים תפקודיים למחקר כבדי מתקדם.

זילוח כבד חולדה ובידוד הפטוציטים ראשוני: הליך ישן חיוני לתרבית אורגנואידים תלת-ממדית חדשנית

גלה סרטונים נוספים