אלקטרו-פנטרוגרפיה AC-DC לחקר התנהגויות בדיקה ובליעה של יתושי Culex tarsalis על ידי אדם
29 בנובמבר 2024
מתוארים נהלים לחקר התנהגויות החיטוט והבליעה של יתושי Culex tarsalis על ידי אדם באמצעות אלקטרו-חדירה AC-DC.
הקבוצה שלנו משתמשת ב-EPG כדי לחקור כיצד ארבו-וירוסים וגורמים אחרים משפיעים על התנהגויות בדיקה ובליעה המתרחשות במהלך הזנת הדם, מכיוון שפתוגנים רבים מתמרנים את התנהגות הווקטור כדי לשפר את ההעברה. בעיקרון, אנו חוקרים מה קורה במהלך עקיצת יתוש וכיצד התנהגויות אלה משפיעות על העברת פתוגנים ופתולוגיה של מחלות. מבחינה היסטורית, EPG שימש בעיקר לחקר חרקים הניזונים מצמחים.
ההתפתחות האחרונה של נהלי AC-DC EPG לפרוקי רגליים הניזונים מדם מאפשרת לנו לחקור את התנהגויות החיטוט והבליעה המתרחשות במהלך הזנת דם בפירוט חסר תקדים ללא צורך בהליכים פולשניים, מה שעשוי לאפשר פיתוח אסטרטגיות ניהול חדשות. האתגר הגדול ביותר בשימוש ב-EPG על פרוקי רגליים הניזונים מדם הוא מתאם צורות הגל עם פעילויות ביולוגיות כמו רוק והעברת פתוגנים. יש לנו השערות חזקות המבוססות על המקורות החשמליים של צורות הגל והספרות, אך אנו עדיין זקוקים לראיות אמפיריות.
כדי להתחיל, העבירו את קצה פיפטת המרעה מזכוכית דרך להבה, וסובבו מעט את הפיפטה. בדוק את הקוטר וחזור על התהליך כדי להביא את הפיפטה לגודל הרצוי. כדי להכין שואב חרקים, יש לכסות את הקצה הגדול של פיפטת המרעה שהשתנתה בכילה נגד יתושים ולהכניסו לצינור הסיליקון המחובר לשואב מעבדה המאבטח את הצומת בעזרת סרט חשמלי.
לאלקטרודות ההקלטה עוטפות גוש קצף בניילון טרי להחזקת דודי החרקים המוכנים והיתושים החוטיים. מגרדים את הסנטימטר העליון של חוט הנחושת בעזרת סכין גילוח עד שהוא מבריק מכל הצדדים. לאחר מכן חותכים חוט זהב בקוטר 0.025 מילימטר לחתיכות באורך של ארבעה עד חמישה סנטימטרים.
החזק את החוט במלקחיים עם סגירה עצמית מוסווים בסרט כדי למנוע פגיעה בחוט, עטפו בעדינות את חוט הזהב שלוש פעמים סביב חוט הנחושת של בדל החרקים החל לאורך הקצה הנקי של חוט הנחושת. השתמש בבדיקת דיסקציה כדי למרוח דבק כסף כדי להחזיק את חוט הזהב במקומו. לאחר שווידאתם שאין קצה רופף, הניחו את בדל החרקים בקצף עד שהדבק מתייבש.
לאחר מכן לטפו בעדינות את חוט הזהב המחובר לבדל החרקים כדי לעצב אותו לקשת ארוכה ועדינה, וחתכו את החוט לאורך של כ-2.5 עד 3 סנטימטרים. עבודה תחת מיקרוסקופ דיסקציה, החזק את בדל החרק במסמר הפליז ביד הלא דומיננטית בזמן שחוט הזהב נוגע בשלב מיקרוסקופ הדיסקציה ותפס את קצה חוט הזהב עם מלקחיים עדינים באמצעות היד הדומיננטית, השתמש במלקחיים הנקודתיים כדי לחצות את קצה חוט הזהב מעל חוט הנחושת של בדל החרק ליד האזור המודבק. לאחר מכן משוך בעדינות את בדל החרקים עד שחוט הזהב יוצר לולאת זהב קטנה סביב המלקחיים העדינים .
שחרר את חוט הזהב והסר בזהירות את המלקחיים. תוך כדי החזקת בדל החרק ביד הלא דומיננטית, אחוז בלולאת הזהב בעזרת מלקחיים דקים. משוך את בדל החרקים תוך סיבוב קל של המלקחיים הרחק מהבדל עד שהלולאה מתכופפת בזווית של 90 מעלות לצוואר החוט.
ודא שלולאת הזהב סגורה לחלוטין לפני החזרת בדל החרקים לגוש הקצף. כדי להתחיל, הכינו את שואב החרקים ואת אלקטרודות ההקלטה לחיווט יתושים. מקם את היתושים המורדמים על גבם על כרית ההרדמה כשהבטן פונה לחוקר.
לאחר הנחת סרט מעבדה, מרחו טיפה של 0.5 סנטימטר של דבק כסף מעורבב טרי על הקלטת. לאחר מכן שאפו את הבטן של יתוש מורדם לתוך השואב. שימוש ביניקה רק מספיק זמן כדי להושיב את הבטן במקומה ולהחזיק את היתוש מתחת לטווח החיתוך מעל הדבק הכסוף באמצעות השואב.
לאחר טבילת סיכת מינוצ'ין בדבק הכסף, יש למרוח שכבה דקה על הפרונטום של היתוש. טבלו במהירות את לולאת הזהב בקצה אלקטרודת ההקלטה בדבק הכסף. הניחו אותו על נקודת הדבק הכסופה על הפרונוטום של היתוש ונדנדו את הלולאה קדימה ואחורה כדי להבטיח שהיא יושבת שטוחה.
לאחר מכן, החלף את בדל החרקים בקצף בזווית המאפשרת ליתוש החוטי לעמוד בנוחות כשהוא מתעורר. לאחר שמספר היתושים הרצוי מחווט, הניחו את גוש הקצף בקופסת אחסון ושמרו עליו. כדי להתחיל, חבר את אלקטרודות ההקלטה ליתושים ביום הניסוי האלקטרופנטוגרפי או ה-EPG.
לאחר שהמארח נמצא במקומו, סובב את מגבר הראש הצידה. לאחר הסרת יתוש קווי, הכנס את סיכת הפליז של בדל החרקים ליציאה בראש ampחיים יותר. התחל את ההקלטה באמצעות תוכנת ניהול החומרה.
מקם את מגבר הראש מעל היד כך שהיתוש יוכל לעמוד ולחקור בנוחות. הפעל את הראש ampחיים יותר כשהוא מקורקע. התאם את מיקום היד המארחת לפי הצורך כדי לסייע בבדיקת ההצלחה.
השתמש בתוכנת ניהול החומרה כדי לבצע תצפיות עם חותמת זמן לגבי תגובות המארח, התנהגויות יתושים, שינויי רווח ואירועים רלוונטיים אחרים במהלך ההקלטה. התאם את מיקום האותות על המסך ואת רווח התוכנה באמצעות תוכנת ניהול החומרה כדי לשמור על שני האותות גלויים בבירור. כדי להתאים את רווח החומרה, הפוך את הערוץ טווח אחד ומתגי מכפיל.
אם התאמה זו אינה מספיקה, סובב את חוגת הרווח של ערוץ 1 ימינה או שמאלה כדי להעלות או להוריד את הרווח בהתאמה כדי למנוע שיא או פסגות לא ברורות. לכוונון הקיזוז, הפוך את מתג ההיסט של הערוץ אחד בתיבת הבקרה למצב שלילי. לאחר מכן סובב את הערוץ חוגת היסט אחת עד שהפסגות באותות הקדם והפוסט מתרחשות באותו כיוון על מסך המחשב.
אם היתוש נמצא באמצע בדיקה, אפשר לו לסיים. אם הוא לא בודק תוך 10 דקות, כבה את הראש ampחיים יותר. בקש מהמארח להסיר בזהירות את ידו, ולאחר מכן הסר את היתוש עם בדל החרקים המצורף.
לבסוף, החלף את היתוש בקופסת האחסון. הקלטות AC-DC EPG של יתושי Culex tarsalis הניזונים מידיים אנושיות יצרו צורות גל הניתנות לפירוש המתאימות לסיווג למשפחות, סוגים ותתי סוגים.
סקירה כללית
מחקר זה בוחן את התנהגויות הגשש והבליעה של יתוש ה-Culex tarsalis במהלך הזנת דם מידיים של בני אדם. באמצעות שימוש באלקטרופנטגרפיה (EPG) מסוג AC-DC, החוקרים שואפים להבהיר כיצד התנהגויות אלו משפיעות על העברת פתוגנים ועל הפתולוגיה של המחלה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מחקר
- התנהגות וקטורים והעברת פתוגנים.
- אינטראקציות בין ארבו-וירוסים לדפוסי הזנת דם.
- פרוקי רגליים ניזוני דם ופתולוגיה של מחלות.
רקע
- באופן מסורתי, שיטת EPG שימשה לחקר חרקים הניזונים מצמחים.
- שיטות חדשות מאפשרות מחקרים לא פולשניים של התנהגויות האכילה של יתושים.
- האתגר נותר במציאת מתאם בין צורות הגל של ה-EPG לבין פעילויות ביולוגיות ספציפיות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מערכת AC-DC EPG להקלטת התנהגויות הזנה.
- יתושים מסוג Culex tarsalis כאורגניזם המודל.
- פיתוח פרוצדורלי מפורט עבור חיווט וניטור של יתושים.
תוצאות עיקריות
- התקבלו תובנות חדשות לגבי המכניקה של הזנת יתוש.
- צורות גל פרשניות נמצאו במתאם עם התנהגויות דקיקה.
- ראיות ניסיוניות תומכות בהשערות הקיימות בנוגע להזנת יתושים ואינטראקציות עם פתוגנים.
מסקנות
- המחקר מדגים את ההתנהגויות המורכבות של יתושים במהלך ההזנה ואת השפעותיהן על העברת פתוגנים.
- הממצאים רלוונטיים לפיתוח אסטרטגיות ניהול נגד מחלות המועברות על ידי וקטורים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
אלקטרופנטגרוגרפיה (EPG) מסוג AC-DC מאפשרת ניתוח כמותי ולא פולשני של התנהגויות הדקירה והבליעה של יתושים, ובכך מספקת תובנה מכניסטית לגבי אינטראקציות בין הווקטור, המארח והפתוגן. יכולת זו תומכת בתיקוף מטרות בשלבים מוקדמים עבור התערבויות שמטרתן לשבש את העברת המחלה. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי בזיהוי פנוטיפים התנהגותיים הרלוונטיים לתיקי vectort control.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של מנגנוני ההזנה של יתוש הקשורים להעברת נגפים.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי הבהרת נתיבים התנהגותיים הרגישים להתערבות.
- מסייע בתיקוף תפקודי של מטרות עבור אסטרטגיות לבקרת וקטורים.
- משפר את רמת הוודאות החזויה בבחירת נקודות קצה התנהגותיות למחקרים עתידיים.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מספק מערכת מותקפת למדידת התנהגויות האכלה של יתושים בתגובה לתרכובות מועמדות.
- מאפשר מדידה הדירה של גלי חשמל כתוצרי בדיקה כמותיים.
- תומך בסטנדרטיזציה של בדיקות התנהגותיות לצורך השוואה בין מחקרים.
- מכין פלטפורמה ניתנת להרחבה לסריקת התערבויות המשפיעות על התנהגות הווקטור.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאים פנוטיפים התנהגותיים עם נקודות סיום רלוונטיות למחלה עבור מחקרים תרגומיים.
- מאפשר רצף מגילוי מכניסטי ועד תיקוף פרה-קליני של התערבויות המכוונות לוקטור.
- תומך בקידום מועמדים מותאם-סיכון על בסיס נתוני יעילות התנהגותית.
- מספק הפחתת סיכונים מכניסטית לצורך קבלת החלטות לגבי פורטפוליו בתוכניות למחלות המועברות על ידי וקטורים.
שילוב צינור עיבוד וזרימת עבודה
AC-DC EPG משתלב ברצף שבין השלב הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי מתן אפשרות לניתוח מונחה-השערות של התנהגויות וקטורים והשפעתם של משתנים ניסויים על התנהגויות אלו.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות על השפעתם של פתוגנים, קוטרי חרקים או גורמים גנטיים על הזנת יתוש.
- סריקה: מספק פלטים כמותיים ושמימים של צורת גל להערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מספק נקודות קצה מדידות להשוואה סטטיסטית של תנאים התנהגותיים.
- מחקר תרגומי: מקשר נתונים התנהגותיים מכניסטיים לסיכון להעברת מחלות במודלים פרה-קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה לשימוש חוזר הניתנת להתאמה למספר מיני יתושים ולסוגי התערבות שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בביולוגיה של וקטורים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של בדיקות התנהגותיות לצורך הדירות ויכולת הרחבה בין מחקרים.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס לקבלת החלטות של go/no-go עבור התערבויות המכוונות לוקטורים, ובכך משפר את יעילות ההון.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מועמדים המותאם לסיכון, בהתבסס על נתונים התנהגותיים כמותיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול ביתושים ובמכשור EPG.
- דורש תשתית אנליטית ייעודית להקלטה ופירוש של צורות גל.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הבדיקה וניתוח הנתונים.
- ניתן להתאמה למיני יתושים שונים באמצעות שינויים פרוצדורליים.
- הקשר בין צורות גל חשמליות לפעילויות ביולוגיות ספציפיות נשאר אתגר אמפירי.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:11
Preparing the Insect Aspirator and Recording Electrodes for Monitoring Mosquito Feeding Using Electropenetrography
3:52
Attaching Recording Electrodes to Mosquitoes for Studying Probing and Ingestion Behaviors via Electrical Signal Recording
5:15
AC-DC Electropenetrography to Analyze Mosquito Probing and Feeding on Human Hosts
7:22
Representative Results
