מיצוי משופר של DNA במשקל מולקולרי נמוך משפכים להערכה מקיפה של עמידות מיקרוביאלית
19 ביולי 2024
כאן, אנו מציגים טכניקה פשוטה להערכת עמידות אנטי-מיקרוביאלית סביבתית (AMR) על-ידי שיפור שיעור הדנ"א החוץ תאי בעל משקל מולקולרי נמוך. טיפול קודם עם 20%-30% PEG ו-1.2 M NaCl מאפשר זיהוי של גנים AMR גנומיים ואופקיים. הפרוטוקול משאיל את עצמו לתהליך ללא ערכה עם אופטימיזציה נוספת.
אנו מתעניינים באבולוציה, בהעברה ובמנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס עמידות לאנטיביוטיקה. באופן ספציפי, העבודה שמזינה את המאמר הזה נובעת מהעניין שלנו בהתנגדות סביבתית. כיום, אנו מנסים לבנות מסד נתונים מקומי כדי לעקוב אחר השונות המרחבית בזמן בעמידות מיקרוביאלית באמצעות נתונים של שנה.
שילוב של טכניקות מבוססות תרבית וגנומיקה משמש לזיהוי וניטור עמידות מיקרוביאלית. דנ"א מדגימות עובר ריצוף PCR או רובה ציד כדי ליצור פרופיל של מגוון מיקרוביאלי ולזהות גנים עמידים. בנוסף, מטא-ברקוד ולוחות AMR מבוססי גנים משמשים לזיהוי AMR מתקדם.
דנ"א מקוטע במשקל מולקולרי נמוך ידוע כמאגר של גנים AMR, אך לא התמקד בפיתוח שיטות ספציפיות למיצוי בעל תפוקה גבוהה של DNA ליניארי ובעל משקל מולקולרי נמוך. עבודתנו מתמקדת בטיפול בפער זה. הפרוטוקול שלנו מציג שלב פשוט של עיבוד מקדים כדי להעשיר את החלק היחסי של DNA במשקל מולקולרי נמוך המופק משפכים.
כתוצאה מכך, זה לוכד AMR סביבתי בשלמותו מבלי להוציא שברי DNA חופשיים. פרוטוקול זה יכול להיות מפותח לשיטה ללא ערכה עם קצת יותר עבודה. בתורו, זה סולל את הדרך לפיתוח טכניקות חסכוניות ללכידת AMR סביבתי.
אנו רוצים ללכת מעבר לעמידות למוטציות ולחקור את תרומתם של מנגנונים לא גנטיים לעמידות לאנטיביוטיקה. אנו מעוניינים במיוחד להשוות את התרומות היחסיות של העברת גנים אופקית ומוטציות גנומיות להסתגלות לאנטיביוטיקה בסביבות שונות.
סקירה כללית
מחקר זה מפתח טכניקה חדשנית להערכת עמידות אנטימיקרוביאלית (AMR) סביבתית על ידי העשרה של DNA חוץ-תאי בעל משקל מולקולרי נמוך מדגימות של מי שפכים. הפרוטוקול מאפשר זיהוי של גנים של AMR גנומיים ואלו שעברו העברה אופקית, ובכך מציע שיטה חסכונית שאינה דורשת ערכות מוכנות למעקב אחר AMR בסביבה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מחקר
- עמידות לאנטיביוטיקה (AMR)
- מיקרוביולוגיה סביבתית
- גנטיקה מולקולרית
רקע
- האבולוציה וההעברה של עמידות לאנטיביוטיקה בסביבות סביבתיות
- ליקויים נוכחיים בטכניקות מיצוי בעלות תפוקה גבוהה של DNA בעל משקל מולקולרי נמוך
- חשיבות המעקב אחר AMR עבור בריאות הציבור
שיטות שנעשה בהן שימוש
- PCR וריצוף shotgun לאפיון שפע מיקרוביאלי
- שימוש ב-polyethylene glycol ובסודיום כלוריד להפקת DNA
- זיהוי מתקדם של AMR באמצעות metabarcoding ופנלים מבוססי גנים
תוצאות עיקריות
- מיצוי משופר של DNA ליניארי ובעל משקל מולקולרי נמוך
- לכידה מוצלחת של פракציות DNA גנומי וחופשי הקשורות ל-AMR
- עבודת יסוד לפיתוחים עתידיים בטכניקות לגילוי AMR בסביבה
מסקנות
- המחקר מספק שיטה יעילה להערכת AMR סביבתית
- מעודד מחקר נוסף הן של גורמים גנטיים והן של גורמים לא גנטיים התורמים לעמידות לאנטיביוטיקה
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
גילוי מקיף של עמידות לאנטיביוטיקה (AMR) בדגימות סביבתיות הוא קריטי להערכת סיכונים מוקדמת ולניטור בריאות הציבור. מיצוי משופר של DNA בעל משקל מולקולרי נמוך ממי שפכים מאפשר פרופיל מלא יותר של מאגרי גני AMR, כולל אלו המופצים באמצעות העברה אופקית של גנים. יכולת זו מחזקת את הביטחון החזוי בניטור AMR סביבתי ומספקת בסיס לקבלת החלטות לגבי תיקי הניטור ואסטרטגיות הפחתת הסיכונים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה של מאגרי גנים של AMR בסביבה, מעבר ל-DNA תוך-תאי.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של ניידות גני AMR ונתיבי העברה.
- משפר את מידת הביטחון החזיונית במודלים של סיכונים סביבתיים להופעת AMR.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מסייע בהכנת דגימות DNA המתאימות לפאנלים של AMR המבוססים על PCR ומטגנומיקה.
- משפר את השחזוריות של הבדיקה על ידי סטנדרטיזציה של מיצוי DNA מחוץ לתא ו-DNA מפורק.
- מאפשר זיהוי מהימן של מקטעי גנים של AMR בריכוז נמוך לצורך ניתוחים המשכיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאם בין ניטור AMR סביבתי לבין גילוי ביומרקרים תרגומיים עבור בריאות הציבור.
- תומך ברצף מהזיהוי הסביבתי ועד להערכת סיכונים פרה-קלינית של התפשטות AMR.
- מספק הפחתת סיכונים מכניסטית על ידי לכידה של אלמנטים של עמידות גנטית ואלו המועברים באופן אופקי.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
שיטה זו להפקה משתלבת בשרשרת הניטור הסביבתי, החל מאיסוף הדגימות ועד לניתוח מטאגנומי ואפיון של גני AMR.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת היפותזות לגבי השכיחות והניידות של גנים העומדים לעמידות לאנטיביוטיקה (AMR) בסביבות של מי שפכים.
- סריקה: מבקירה את תהליך מיצוי ה-DNA לצורך זיהוי כמותי וניתן לשחזור של גני AMR.
- אנליטיקה: מספקת DNA בעל משקל מולקולרי נמוך ובניב גבוה עבור ניתוחים השוואתיים חסונים בין דגימות ונקודות זמן.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין זיהוי AMR סביבתי לבין אסטרטגיות של סמנים ביולוגיים לבריאות הציבור.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פרוטוקול שניתן להרחבה שאינו תלוי בערכה ספציפית, והניתן להתאמה למטריצות סביבתיות מגוונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי במעקב אחר AMR על ידי לכידה של DNA מקוטע וחוץ-תאי.
- ערך תפעולי: מספק פרוטוקול מיצוי סטנדרטי בעל תפוקה גבוהה המתאים לניטור שגרתי.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת לגבי המשך או הפסקת פעילות (go/no-go) עבור השקעות בניטור ובצמצום AMR.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעודוף מותאם סיכונים של תוכניות ניטור AMR סביבתיות.
שיקולי יישום
- נדרש מומחיות במיצוי DNA סביבתי ובניתוח מולקולרי המשכי.
- נדרשת גישה לצנטריפוגה, לספקטרופוטומטריה ולתשתית סטנדרטית של ביולוגיה מולקולרית.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין-צוותית לצורך עיבוד דגימות הדיר וניתנות להשוואה של הנתונים.
- ניתן להתאמה לסוגים שונים של מי שפכים ודגימות סביבתיות באמצעות אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- מוגבל בשל הצורך בטיפול זהיר ב-DNA מפוצג כדי למנוע אובדן במהלך העיבוד.
