Name: מיצוי משופר של DNA במשקל מולקולרי נמוך משפכים להערכה מקיפה של עמידות מיקרוביאלית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T14:35:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: למד שיטת מיצוי DNA במשקל מולקולרי נמוך משפכים להערכת עמידות מיקרוביאלית סביבתית. הפרוטוקול משתמש בפוליאתילן גליקול ונתרן כלורי ללכידת גנים של עמידות לאנטיביוטיקה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מכירים בתמיכת מימון מקרן רוקפלר (מענק קרן רוקפלר מספר 2021 HTH 018) כחלק מצוות APSI הודו (Alliance for Pathogen Surveillance Innovations https://data.ccmb.res.in/apsi/team/). אנו מכירים גם בסיוע הכספי שניתן על ידי בנק Axis לתמיכה במחקר זה ובית הספר Trivedi למדעים ביולוגיים באוניברסיטת אשוקה עבור ציוד ותמיכה אחרת.

1. דיגום שפכים
<ol><li>טבלו פוליפרופילן בנפח 500 מ"ל במאגר הניקוז הפתוח או במתקן טיהור השפכים (STP) ואספו ~300 מ"ל של דגימת שפכים.</li>
	<li>העבר ~ 250 מ"ל של הדגימה לבקבוק פוליפרופילן אוטוקלאבד 250 מ"ל.</li>
	<li>הבריגו את פקק הבקבוק ואטמו אותו בסרט פלסטיק. שמרו את הבקבוק זקוף בשקית סגורה.</li>
	<li>העבירו את הדגימה זקופה במיכל סגור בטמפרטורת הסביבה.</li>
	<li>השבת בחום את הדגימה בטמפרטורה של 70°C בתנור אוויר חם למשך 4 שעות לפני עיבודה למיצוי DNA.</li>
</ol>2. הפקת DNA מדגימות שפכים
<ol><li>לאחר קירור דגימת השפכים, מערבלים את הדגימות במהירות מרבית ומניחים לפסולת/בוצה לשקוע.</li>
	<li>דקנט 27.5 מ"ל של השפכים בצינורות צנטריפוגות 50 מ"ל ולהוסיף 13.5 גרם של PEG-8000 (ריכוז סופי 30%) ו 3 גרם של NaCl (ריכוז סופי 1.2 M) אליו ולערבב היטב עד מומס לחלוטין.</li>
	<li>לדגור את הדגימה לילה (~ 16-18 שעות) ב 4 ° C.</li>
	<li>צנטריפוגה הדגימה ב 15,500 x גרם ב 4 ° C במשך 30 דקות.</li>
	<li>השליכו את הסופרנטנט. הערה: PEG-8000 ב-30% הוא צמיג מאוד, והגלולה יכולה להיזרק בזמן השלכת הסופרנטנט. יש לנטרל את הסופרנאטנט לאט ובזהירות כדי להבטיח שהגלולה לא תאבד. שלבים 2.6 עד 2.23 מבוצעים באמצעות ערכת מיצוי DNA קרקע בהתאם להוראות הערכה עם מספר שינויים.</li>
	<li>ממיסים את הגלולה ב 800 μL של תמיסת הליזיס של הערכה ומוסיפים את התמיסה לצינור חרוזי הזירקוניום המעורב. הערה: אם אתה מעבד נפחים גדולים יותר, אחסן את הכדוריות ממספר הצינורות הרצוי. לדוגמה, אם עיבוד 160 מ"ל של דגימה; יהיו ארבעה צינורות 50 מ"ל המכילים שפכים עם PEG ו- NaCl. לאחר צנטריפוגה של כל ארבעת הצינורות ב 15,500 x גרם ב 4 ° C במשך 30 דקות, להשליך supernatant מכל ארבעת הצינורות. הוסף 200 μL של תמיסת CD1 לכל אחד, להשהות מחדש את הכדוריות, ולאגד אותם יחד בצינור חרוז אחד.</li>
	<li>הדקו את צינור החרוז בצורה אופקית על מערבולת. מערבלים את הצינור במהירות מרבית למשך 20-30 דקות. הערה: מערבולות ממושכות מבטיחות ליזה מלאה והומוגניזציה של הדגימות, מה שמשפר את תפוקת ה- DNA.</li>
	<li>סובבו את הצינורות במהירות של 8,000 x גרם במשך 15 שניות כדי למקם את החרוזים בתחתית, הסירו קצף, והעבירו את הסופרנאטנט לחלוטין מהצינור לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל. חלק מהחרוזים עשויים גם להיות מועברים במהלך שלב זה.</li>
	<li>צנטריפוגה את supernatant ב 15,000 x גרם במשך 1 דקה.</li>
	<li>מעבירים את הסופרנאטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי בנפח 2 מ"ל. הסופרנאטנט עדיין עשוי להכיל כמה חלקיקים מרחפים.</li>
	<li>הוסף 200 μL של תמיסה משקעת ומערבולת במהירות מקסימלית במשך 5 שניות. יש לדגור ב-4°C למשך 5 דקות. הערה: דגירה ב 4 ° C מגביר את היעילות של משקעים של חלבונים ופסולת התא בעוד DNA נשאר בתמיסה. ניתן להשהות את הפרוטוקול בשלב זה למשך עד שעתיים ללא ירידה משמעותית בתפוקה ובאיכות הדנ"א המופק.</li>
	<li>צנטריפוגה במהירות 15,000 x גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר (RT). הימנעו מהגלולה והעבירו את הסופרנאטנט השקוף לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי של 2 מ"ל.</li>
	<li>הוסף 600 μL של חיץ קשירה לכל 700 μL של supernatant ומערבולת במהירות מרבית למשך 5 שניות.</li>
	<li>יש להעמיס 700 μL של הליזט על עמוד ספין סיליקה, לדגור במשך 2 דקות, ולצנטריפוגה ב 15,000 x גרם במשך 1 דקה. הערה: דגירה של ליזט על עמודת סיליקה משפרת את קשירת הדנ"א לעמודה, וכתוצאה מכך תפוקת דנ"א טובה יותר.</li>
	<li>מחק את הזרימה וחזור על שלב 2.14 עד שכל הליזט יעבור דרך עמודת הסיבוב.</li>
	<li>מניחים בזהירות את עמוד הסחיטה לתוך צינור איסוף נקי של 2 מ"ל. ודא שלא ניתזה זרימה על עמוד הסיבוב.</li>
	<li>הוסף 500 μL של חיץ כביסה לעמוד הסחיטה וצנטריפוגה את עמוד הסחיטה ב- 15,000 x גרם למשך דקה אחת.</li>
	<li>מחק את הזרימה והחזיר את עמודת הספין לאותו צינור איסוף של 2 מ"ל.</li>
	<li>הוסף 500 μL של חיץ אתנול לשטיפת עמוד הסחיטה. צנטריפוגה במהירות 15,000 x גרם למשך דקה.</li>
	<li>השליכו את עמוד הזרימה והכניסו את עמוד הסחרור לצינור איסוף חדש של 2 מ"ל.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 16,000 x גרם במשך 2 דקות כדי להסיר אתנול שיורי. הכנס את עמוד הסחרור לצינור חדש בנפח 1.5 מ"ל.</li>
	<li>מוסיפים 100 μL של חיץ אלוציה (מחומם מראש ל-55°C) למרכז קרום הפילטר הלבן ודגרים במשך 5 דקות. הערה: חיץ אלוציה מחומם, יחד עם דגירה על הממברנה, מגביר את היעילות של שאיבת DNA, במיוחד DNA במשקל מולקולרי גבוה.</li>
	<li>צנטריפוגה במהירות 15,000 x גרם למשך דקה. מחק את עמודת הסיבוב.</li>
	<li>לדנ"א המדולל, יש להוסיף 10 μL של 3 M NaCl (1/10 נפח של DNA eluate) ו-250 μL של אתנול מוחלט מקורר (2.5 נפח של DNA eluate). הפוך כדי לערבב היטב ולסובב את התוכן ב 8,000 x גרם במשך 15 שניות.</li>
	<li>לדגור על תערובת DNA-אתנול ב -20 ° C במשך 1 שעה לפחות. הערה: ניתן להגדיל את הדגירה של תערובת DNA-אתנול ל -16 שעות ללא ירידה משמעותית בתשואה או באיכות של ה- DNA המופק.</li>
	<li>צנטריפוגה ב-19,000 x גרם ב-4°C למשך 30 דקות. השליכו את הסופרנאטנט על ידי הקנטה.</li>
	<li>מוסיפים 500 μL של אתנול 70% צונן לכדור.</li>
	<li>צנטריפוגה ב-19,000 x גרם ב-4°C למשך 15 דקות. השליכו את הסופרנאטנט על ידי הקנטה.</li>
	<li>הפוך והקש בעדינות על הצינור על נייר טישו כדי להסיר שאריות אתנול על ידי פעולה נימית.</li>
	<li>יבש את כדורית ה- DNA לחלוטין על ידי שמירה על צינורות פתוחים על בלוק חימום במשך 5-10 דקות ב 37 ° C עד שכל אתנול התאדה.</li>
	<li>להשהות מחדש את גלולת הדנ"א ב 30-50 μL של מים מזוקקים כפול autoclaved (ddH2O). יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 5-10 דקות.</li>
	<li>סובבו את הדנ"א במהירות של 8,000 x גרם למשך 15 שניות.</li>
	<li>בחר ביישום dsDNA תחת ההגדרות חומצות גרעין בספקטרופוטומטר ננו-טיפה.<ol><li>נקו את הכן עם נייר טישו ללא סיבים ומים. השתמש ב- ddH2O כדי לרוקן את המכשיר ולאחר מכן טען 2 μL של דגימת ה- DNA על הדום.</li>
		<li>מדוד את יחסי הריכוז והספיגה (A260/280 ו- A260/230) כדי לקבוע את הטוהר.</li>
	</ol></li>
	<li>אחסן את דגימת ה- DNA ב -20 ° C.</li>
</ol>3. משקעים של תגובת שרשרת פולימראז (PCR) - DNA ליניארי מוגבר לבדיקת התאוששות DNA על פני מגוון משקלים מולקולריים
<ol><li>באמצעות DNA גנומי מ- E. coli MG155, להגביר מקטעי גנים על ידי PCR כדי ליצור מאגר של מקטעים ליניאריים מהגנים הבאים: fusA, lacZ, gapA, rpsD, 16S rRNA, marR (ראה טבלה 2 עבור רצפי פריימר ותנאי PCR).</li>
	<li>לטהר את מוצרי ה-PCR באמצעות ערכת טיהור ה-PCR ולאגד את מוצרי ה-PCR יחד.</li>
	<li>חלקו את האמפליקונים המאוחדים לצינורות מיקרוצנטריפוגות בנפח 1.5 מ"ל בעלי נפחים שווים - תייגו צינור אחד כ'דנ"א קלט'.</li>
	<li>הוסף PEG ו- NaCl בהתאם לתנאים הרצויים (9%, 20%, 30% PEG-8000; 0.3 M, 1.2 M NaCl) לכל אחד מהצינורות למעט זה שכותרתו 'קלט DNA' והשלם את הנפח הסופי ל- 1 מ"ל.</li>
	<li>לדגור את הצינורות לילה (~ 16-18 שעות) ב 4 ° C. הערה: בשאר השלבים עד 3.16, 'DNA קלט' נשמר ללא שינוי במקרר.</li>
	<li>סובבו את הצינורות במיקרו-צנטריפוגה שולחנית בהתאם למהירות הרצויה (15,000 x גרם או 20,000 x גרם) למשך שעה אחת ב-4°C.</li>
	<li>בזהירות להסיר 900 μL של supernatant מהצד מול הגלולה באמצעות micropipette.</li>
	<li>שטיפת אתנול ראשונה: הוסיפו 900 μL אתנול 70% צונן לגלולה וערבבו על ידי היפוך עדין של הצינורות.</li>
	<li>סובב את הצינורות באותה מהירות שבה נעשה שימוש בשלב 3.6 (15,000 x גרם או 20,000 x גרם) למשך 30 דקות ב- 4 ° C.</li>
	<li>הסר את supernatant על ידי decantation.</li>
	<li>שטיפת אתנול שנייה: הוסיפו לכדורית 500 מיקרוליטר אתנול 70% מקורר.</li>
	<li>סובב את הצינורות באותה מהירות שבה נעשה שימוש בשלב 3.6 (15,000 x גרם או 20,000 x גרם) למשך 30 דקות ב-4°C. השליכו את הסופרנאטנט על ידי הקנטה.</li>
	<li>הפוך והקש בעדינות על הצינור על נייר טישו כדי להסיר שאריות אתנול על ידי פעולה נימית.</li>
	<li>יבש את כדורית ה- DNA לחלוטין על ידי שמירה על צינורות פתוחים על בלוק חימום במשך 5-10 דקות ב 37 ° C עד שכל אתנול מתאדה.</li>
	<li>להשהות מחדש את הגלולה ב 20 μL של מים מזוקקים כפול autoclaved.</li>
	<li>למדוד את ריכוז הדנ"א המואץ על ידי התנאים השונים ואת 'דנ"א הקלט' באמצעות ספקטרופוטומטר ננו-טיפה או פלואורומטר.</li>
	<li>טען את ה- DNA המואץ על ג'ל אגרוז 1% להדמיית DNA.</li>
</ol>

טכניקה יעילה להערכת AMR סביבתי על ידי העשרת DNA בהספק MW נמוך

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

AMR הוא אחד מעשרת האיומים הבריאותיים המובילים כיום, כפי שצוין על ידי ארגון הבריאות העולמי, ומעקב סביבתי אחר AMR מוכר ככלי חשוב ברחבי העולם. כפי שהוזכר במבוא, תיעוד מקיף של AMR סביבתי כולל דנ"א בעל משקל מולקולרי נמוך, מקוטע וחוץ-תאי. פרוטוקול העיבוד המקדים שדווח כאן באמצעות ריכוז גבוה של PEG בשילוב עם מלח (30% PEG ו-1.2 M NaCl) משיג תוצאה זו על ידי העשרת שיעור הדנ"א בעל משקל מולקולרי נמוך מבלי להשפיע על מיצוי שברים בעלי משקל מולקולרי גבוה יותר (בעיקר דנ"א גנומי ופלסמיד). זאת בניגוד לשיטות ריכוז קודמות המשתמשות בפרוטוקולי PEG נמוכים יותר וקיט ישיר (ללא עיבוד מקדים) המסורבלים בשל הצורך בעיבוד נפחים גדולים. עיבוד מקדים עם ריכוזי PEG נמוכים יותר לא היה יעיל בשחזור דנ"א במשקל מולקולרי נמוך ("נמוך" מתייחס כאן לפסי דנ"א מתחת ל-600 bp). כאשר לא נעשה שימוש ב-PEG במהלך עיבוד מקדים, מיצוי הדנ"א גרוע, וכתוצאה מכך רק 10% מהדנ"א הקלט משוחזר, לעומת 70% כאשר משתמשים ב-PEG וב-NaCl (איור 8). בנוסף לתוספת של PEG ו- NaCl, צעד חשוב נוסף הוא הסרת שאריות אתנול לאחר מיצוי DNA מהערכה כדי לקבל DNA טהור לעיבוד במורד הזרם. חשוב לקבוע את נפח המים הראשוני הדרוש כדי לקבל כמות כוללת של לפחות ~ 300 ng עד 5 מ"ג DNA בנפח של 30-50 מ"ל עם ההדבקה. בניגוד ל-1 ליטר או יותר של מים המעובדים בדרך כלל להפקת דנ"א משפכים27,41, נמצא כי בשלב העיבוד המקדים המוצע כאן, די ב-27.5-40 מ"ל בלבד כדי לקבל דנ"א איכותי לעיבוד במורד הזרם. שפכים מכילים גם חלקיקים וחומר אורגני, אשר יכולים להכיל תאי חיידקים נספגים ו- DNA חוץ-תאי. לפיכך, ספיחת תאים ודנ"א המלווה בליזה של התא היא צעד חשוב להגדלת תפוקת ה- DNA. ריכוזי PEG גבוהים הופכים את הדגימה לצמיגה ויכולים לעכב את שלבי הליזה והספיחה למיצוי DNA, כאמור. כדי להימנע מכך, הוצעה שיטה מדורגת למיצוי דנ"א, כפי שמתואר בתרשים הזרימה (איור 9). שיטה זו תסייע בחילוץ דנ"א תוך-תאי בעל משקל מולקולרי גבוה (איור 7), ודנ"א חוץ-תאי בעל משקל מולקולרי נמוך מקוטע ומעגלי.
אחת המגבלות הנוכחיות של פרוטוקול זה במונחים של הוצאות היא המשך עיבוד של DNA מועשר במשקל מולקולרי נמוך באמצעות ערכה לשיפור האיכות. מגבלה זו ניתנת לעקיפה באמצעות שיטות אחרות של ניקוי DNA, כמו מיצוי פנול-כלורופורם. מגבלה מעשית נוספת היא טיפול בריכוזי PEG גבוהים מכיוון שהגלולה עלולה ללכת לאיבוד בשל צמיגות גבוהה של התמיסה. נכון לעכשיו, עיבוד מקדים באמצעות PEG ו- NaCl מתבצע, ואחריו גרסה שונה של פרוטוקול ערכה קיים, כלומר, הערכה עדיין משמשת לטיהור DNA סופי. טיהור ללא ערכה של DNA, אשר נותן תפוקת DNA גבוהה אך של טוהר נמוך (לא דווח כאן), הוא אופטימיזציה כדי לשפר את איכות ה- DNA שחולץ. בשל האופי הצמיגי של תמיסות PEG, יש לכוון לריכוז PEG אופטימלי שיכול להניב מגוון רחב של גדלי DNA ועם זאת להיות מטופל בנוחות. הורדת הריכוז ל-20% (איור 6B) השיגה תוצאה המתווכת ליעילות מיצוי של PEG נמוך (9%) וגבוה (30%); זה עשוי להיות שווה מעקב בעבודה בעתיד.
PEG משמש באופן שגרתי במהלך שלבים שונים של מיצוי DNA מדגימות סביבתיות. עם זאת, השימוש ב-PEG לא עבר סטנדרטיזציה למיצוי DNA בהקשר של מעקב AMR. מעקב אחר שפכים כרוך באיתור עמידות מיקרוביאלית בנישות רבות ושונות, כולל STPs (שפכים וקולחים) וניקוז פתוח וסגור 8,27. בעוד שהמידע על AMR בשפכים מספק מידע חיוני על העמידות המסתובבת בקהילה, נוכחותם של גנים של AMR בשפכים חשובה באותה מידה כדי למדוד ולחזות את הופעתן של התפרצויות עמידות. דגימות קולחים בדרך כלל יש עומס מיקרוביאלי נמוך מאז רוב התאים נהרגים במהלך תהליך הטיפול, וכתוצאה מכך תפוקת DNA התא נמוכה מאוד. עם זאת, הקולחים מכילים דנ"א צף חופשי חוץ-תאי הכולל הן דנ"א גנומי בעל משקל מולקולרי גבוה והן פלסמיד בעל משקל מולקולרי נמוך, פאגמידים ודנ"א מקוטע. גנים AMR הנמצאים בדנ"א במשקל מולקולרי נמוך (הן מקוטעים והן פלסמיד/פאגמידים) יכולים לעבור לתאים החיים הנותרים בקולחים, מה שמוביל להפצת עמידות 30,41,45. לכן, חשוב לזהות DNA חוץ-תאי בעל משקל מולקולרי נמוך בשפכים. שיטות אחרות המשמשות להפקת DNA משפכים בעת הערכת AMR בדרך כלל אינן מבטיחות העשרה ראשונית של DNA במשקל מולקולרי נמוך. גישה זו של מיצוי DNA משפכים יכולה לשמש כדי לספק מידע על התנגדות מקיפה של הסביבה.

SARS-CoV-2 ותוצאותיו הדגישו את חשיבות המעקב הסביבתי בניטור וחיזוי התפרצויות מחלות זיהומיות 1,2. בעוד שמגפות ויראליות ניכרות, עליית העמידות האנטי-מיקרוביאלית (AMR) מתוארת לעתים קרובות כמגיפה חתרנית וכזו המהווה דאגה מובילה לבריאות הציבור ברחבי העולם 3,4. כתוצאה מכך, יש צורך דחוף באסטרטגיות מתואמות כדי להבין את האבולוציה וההתפשטות של AMR. גופי מים, כמו גם שפכים, יכולים לשמש כמאגרים הן לפתוגנים והן ל- AMR 5,6,7,8. מקורות מים משותפים הם, אם כן, מקור רב עוצמה להעברת מחלות בקרב בני אדם, במיוחד במדינות בעלות הכנסה נמוכה ובינונית (LMIC) שבהן היגיינה ירודה והתפוצצות אוכלוסין הולכות יד ביד 9,10,11. בדיקות של מקורות מים כבר זמן רב משמש כדי להעריך את בריאות הקהילה 12,13,14. לאחרונה, שפכים ממתקני טיהור שפכים עירוניים הוכיחו את עצמם כאינדיקטור מתקדם טוב למקרי COVID במרפאה 1,2,15,16,17,18.
בהשוואה לניטור מחלות ספציפיות, איתור ומעקב אחר AMR בסביבה מהווה בעיה מורכבת יותר. המספר הגדול של אנטיביוטיקה בשימוש, גנים מגוונים של עמידות, לחצי ברירה מקומיים שונים והעברת גנים אופקית בין חיידקים מקשים על הערכת נטל AMR אמיתי, ולאחר ההערכה, לקשר אותו עם תצפיות קליניות 19,20,21,22. כתוצאה מכך, בעוד מעקב מרוכז אחר AMR קליני מתבצע על ידי מספר ארגונים ברחבי העולם 3,23,24, ניטור AMR סביבתי עדיין בחיתוליו, נסקר ב 19,25,26.
בשנים האחרונות דווח על שיטות שונות למעקב אחר AMR סביבתי 5,27, שנבדקוב-28,29. נקודת המוצא של רוב אלה היא הפקת DNA באיכות טובה מדגימות סביבתיות הטרוגניות, אתגר בפני עצמו. בנוסף, דנ"א סביבתי הוא בדרך כלל מקוטע בגלל חשיפה לסביבה עוינת. דנ"א חוץ-תאי מקוטע מוכר זה מכבר כמאגר חשוב של גני AMR (נסקר ב-30,31,32), עם פוטנציאל נוסף להיכנס ולצאת מחיידקים באמצעות העברת גנים אופקית. לכן, חשוב שכל פרוטוקול שמטרתו למדוד את עומס AMR בסביבה ידגום DNA ליניארי ובעל משקל מולקולרי נמוך בצורה הטובה ביותר האפשרית. באופן מפתיע, התמקד מעט בפיתוח שיטות ספציפיות למיצוי בעל תפוקה גבוהה של דנ"א ליניארי ובעל משקל מולקולרי נמוך: עבודה זו מתמקדת בטיפול בפער.
שיטה נפוצה ופשוטה לזירוז דנ"א היא שילוב פוליאתילן גליקול (PEG) ומלחים כגון נתרן כלורי (NaCl)33. PEG הוא חומר צפיפות מקרומולקולרי המשמש להשגת משקעים ספציפיים לגודל של מקטעי DNA34,35. ככל שריכוז ה-PEG נמוך יותר, כך המשקל המולקולרי של הדנ"א שניתן לזרז ביעילות גבוה יותר. מחקרים רבים השתמשו ב-PEG במהלך מיצוי סביבתי של דנ"א ורנ"א 1,2 (מסוכם בטבלה 1 17,33,36,37,38,39) בשלב הסופי 33,36,37 או כדי לרכז דגימות מים גדולות להפקת חלקיקים נגיפיים כמו ב-SARS-CoV-2 15,40. בעבודה הנוכחית נמצא כי ריכוזי ה-PEG ששימשו בעבר למיצוי דנ"א סביבתי (שנקבעו במידה רבה על ידי פרוטוקולי מעקב נגיפיים) אינם לוכדים דנ"א ליניארי בעל משקל מולקולרי נמוך. לכן, הם מפסידים דגימה של מקטעי דנ"א קצרים ואינם מתאימים להערכת תוכן AMR במדויק. מחקר זה ניצל את התכונות של פוליאתילן גליקול ונתרן כלורי כדי לזרז ביעילות מקטעי DNA ליניאריים בעלי משקל מולקולרי נמוך בתפוקה גבוהה שיכולה, בעתיד, להוביל לשיטת מיצוי DNA חסכונית. שיטה זו יכולה לשמש להעשרת היחס של DNA מקוטע ומשקל מולקולרי נמוך מדגימות טבעיות מורכבות, ובכך ללכוד תמונה מדויקת יותר של AMR סביבתי. עם קצת יותר חידוד, הטכניקה משאילה את עצמה ליישום קל ובעלות נמוכה על ידי תאגידים עירוניים מקומיים וגופים ממשלתיים אחרים לשימוש ככלי מעקב עם הכשרה טכנית מינימלית.

<table><tbody><tr><td>מיקרוצנטריפוגה 24 מושבים</td><td>צנטריפוגה אפנדורף 5425 R</td><td>EP5406000046</td><td></td></tr><tr><td>אתנול אבסולוטי (Emsure ACS, ISO, Reag. Ph Eur אתנול מוחלט לניתוח)</td><td>Supelco</td><td>100983-0511</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>ספסל צנטריפוגה מקוררת עליונה</td><td>צנטריפוגה אפנדורף 5920 R</td><td>EP5948000131</td><td></td></tr><tr><td>מערכת הדמיה ChemiDoc</td><td>BioRad</td><td>12003153</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy PowerSoil Pro Kit</td><td>Qiagen</td><td>47014</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy PowerWater Pro Kit</td><td>Qiagen</td><td>14900-100-NF</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs (dNTP Mix 10mM כל אחד, 0.2 מ"ל, R0191)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>R0191</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq DNA Polymerase, 5 U/&micro; L + 10x DreamTaq Buffer *</td> <td>Thermofscientific</td><td>EP0702</td><td></td></tr><tr><td>E-Gel 1 Kb Plus Express DNA Ladder</td><td>Invitrogen</td><td>10488091</td><td></td></tr><tr><td>Maxiamp PCR צינורות 0.2 מ"ל</td><td>Tarsons</td><td>510051</td><td></td></tr><tr><td>ביולוגיה מולקולרית כיתה מים עבור PCR</td><td>HiMedia</td><td>ML065-1.5ML</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop OneC מיקרונפח UV-Vis ספקטרופוטומטר</td><td>תרמו מדעי</td><td>13400519</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>S37440</td><td></td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>SRL</td><td>54866</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR & ערכת ניקוי ג'ל</td><td>Qiagen</td><td>28506</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 4 פלואורומטר (עם WiFi)</td> <td>Thermofisher</td><td>Q33238</td><td></td></tr><tr><td>צינורות בדיקת קיוביט</td><td>Thermofisher</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>ערכת ריאגנטים של Qubitt עבור ds DNA, מגוון רחב</td><td>Thermo Scientific</td><td>Q32853 (500 בדיקות)</td><td></td></tr> <tr><td>נתרן כלורי</td><td>HiMedia</td><td>TC046M-500G</td><td></td></tr><tr><td>SYBR כתם ג'ל DNA בטוח</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>T100 Thermal Cycler</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Cycler (ProFlex 3 x 32-well PCR System)</td> אשף <td>ביו-4484073</td><td></td> <td>מערכות יישומי</td></tr><tr><td>ערכת טיהור DNA גנומי</td><td>Promega</td><td>A1125</td><td></td></tr></tbody></table>

מיצוי משופר של dna במשקל מולקולרי נמוך משפכים להערכה מקיפה של עמידות מיקרוביאלית 

Enhanced Extraction of Low-Molecular Weight DNA from Wastewater for Comprehensive Assessment of Antimicrobial Resistance

מעקב סביבתי מוכר ככלי חשוב להערכת בריאות הציבור בעידן שלאחר המגפה. מים, במיוחד שפכים, התגלו כמקור הבחירה לדגום עומסים פתוגניים בסביבה. שפכים מנקז פתוח וממתקני טיהור מים קהילתיים הם מאגר של פתוגנים וגנים של עמידות מיקרוביאלית (AMR), ולעתים קרובות באים במגע עם בני אדם. בעוד שישנן שיטות רבות למעקב אחר AMR ממים, בידוד DNA באיכות טובה בתפוקות גבוהות מדגימות הטרוגניות נותר אתגר. כדי לפצות, נפחי הדגימה צריכים לעתים קרובות להיות גבוהים, מה שיוצר אילוצים מעשיים. בנוסף, דנ"א סביבתי הוא לעתים קרובות מקוטע, והמקורות של AMR (פלסמידים, פאגים, דנ"א ליניארי) מורכבים מדנ"א במשקל מולקולרי נמוך. עם זאת, תהליכי מיצוי מעטים התמקדו בשיטות למיצוי בתפוקה גבוהה של DNA ליניארי ובעל משקל מולקולרי נמוך. כאן, שיטה פשוטה למיצוי DNA ליניארי בעל תפוקה גבוהה מכמויות קטנות של שפכים באמצעות תכונות המשקעים של פוליאתילן גליקול (PEG) מדווחת. מחקר זה מציג טיעון להגדלת תפוקת הדנ"א הכוללת מדגימות מים שנאספו לצורך ניתוח מטאגנומי על ידי העשרת שיעור הדנ"א הלינארי. בנוסף, שיפור DNA במשקל מולקולרי נמוך מתגבר על הבעיה הנוכחית של תת-דגימה של AMR סביבתי עקב התמקדות בדנ"א בעל משקל מולקולרי גבוה ותוך תאי. שיטה זו צפויה להיות שימושית במיוחד כאשר קיים דנ"א חוץ-תאי אך בריכוזים נמוכים, כגון עם קולחים ממתקני טיהור. זה אמור גם לשפר את הדגימה הסביבתית של מקטעי גנים AMR המתפשטים באמצעות העברת גנים אופקית.

כאן, אנו מציגים טכניקה פשוטה להערכת עמידות אנטי-מיקרוביאלית סביבתית (AMR) על-ידי שיפור שיעור הדנ"א החוץ תאי בעל משקל מולקולרי נמוך. טיפול קודם עם 20%-30% PEG ו-1.2 M NaCl מאפשר זיהוי של גנים AMR גנומיים ואופקיים. הפרוטוקול משאיל את עצמו לתהליך ללא ערכה עם אופטימיזציה נוספת.

מיצוי משופר של DNA במשקל מולקולרי נמוך משפכים להערכה מקיפה של עמידות מיקרוביאלית 

Environmental surveillance is recognized as an important tool for assessing public health in the post-pandemic era. Water, in particular wastewater, has ...

enhanced-extraction-low-molecular-weight-dna-from-wastewater-for

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מתודולוגיה לבודד משקל מולקולרי גבוה גבוה DNA הגנומי איכות מהקהילה חיידקים בקרקע מתואר.

הפקת DNA גבוהה מולקולרית משקל הגנום מקרקעות ו משקעים

אנו מספקים פרוטוקול משופר לחילוץ משקל מולקולרי גבוה DNA של חיידקים מחצלות hypersaline. תאים מיקרוביאלית מופרדים המטריצה ​​מחצלת לפני מיצוי DNA וטיהור. זה משפר את הריכוז, איכות, גודל של ה-DNA. הפרוטוקול ניתן להשתמש בדגימות עקשן אחרים.

הפקת DNA גבוהה מולקולרית משקל של מאטס מיקרוביאלית

פרוטוקול זה מתאר את השימוש זרימת משיק חלול סיבים מערכת ultrafiltration מדגם ריכוז דיסוציאציה חום כמו צעדים חלופיים עבור זיהוי של...

שינוי שיטת EPA 1623 שמשתמש תזרים משיק הולו סיבים Ultrafiltration ומחממים צעדים ניתוק לזהות waterborne<em&gt; Cryptosporidium</em&gt; ו<em&gt; Giardia spp.</em

מקור: Ghadigaonkar, D. and Rath, A. בידוד וזיהוי של חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה הנישאים במים ואפיון מולקולרי של הגנים העמידים לאנטיביוטיקה שלהם. J. Vis. Exp. (2023)סרטון זה מדגים את הבידוד וההכנה של חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה מדגימת מים באמצעות מדיה סלקטיבית. ה-DNA מופק מחיידקים עמידים לאנטיביוטיקה ומוגבר כדי לזהות את הגנים העמידים לאנטיביוטיקה של החיידקים.

בידוד חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה מדגימת מים לאנליזה מולקולרית

הבידוד של מיקרובים עמידים למתכות כבדות ממעיינות גיאותרמיים הוא נושא חם לפיתוח מערכות ביולוגיות וניטור סביבתי. מחקר זה מספק גישה מתודולוגית לבידוד וזיהוי של חיידקים עמידים למתכות כבדות ממעיינות חמים.

ביו-פרוספקציה של מיקרואורגניזמים אקסטרמופיליים לטיפול בזיהום סביבתי

במאמר זה אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבידוד וזיהוי של חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה ממים ולאפיון המולקולרי של גני העמידות לאנטיביוטיקה שלהם (ARGs). השימוש בטכניקות מבוססות תרבית ולא מבוססות תרבית (ניתוח מטגנומי) מספק מידע מלא על מגוון החיידקים הכולל ועל המאגר הכולל של ARGs שונים הנמצאים במים מתוקים ממומבאי, הודו.

בידוד וזיהוי חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה במים ואפיון מולקולרי של גני העמידות לאנטיביוטיקה שלהם

הפרוטוקול מזהה גנים מרכזיים של מחזור מתאן בביצות החוף של דרום טקסס ומדמיין את התפוצה המרחבית שלהם כדי לשפר את ההבנה של ויסות המתאן והשפעותיו הסביבתיות במערכות אקולוגיות דינמיות אלה.

הדמיה של דינמיקה מיקרוביאלית של מחזור מתאן בביצות חוף

צורות אמינות ומדויקות של ניתוח DNA שניתן לפרוס בשטח הן קריטיות לתעשיות רבות. מאמר זה מציע שתי שיטות לניתוח מיקרוביאלי סביבתי בשטח: 1) בידוד DNA מיקרוביאלי מדגימות סביבתיות באמצעות ערכת שדה חילוץ ביולוגית, ו-2) ניתוח DNA באמצעות יחידת qPCR בשטח.

ניתוח DNA מיקרוביאלי בשטח באמצעות ערכת שדה חילוץ ביולוגית ויחידת qPCR שדה

אנו מתארים שיטה להפקת גבוה הדנ"א הגנומי משקל מולקולרי מביומסה planktonic התרכז 0.22 מסננים מיקרומטר Sterivex, ואחריו צפיפות צזיום כלוריד צנטריפוגה שיפוע לטיהור.

הפקת DNA של 0.22 מיקרומטר מסננים Sterivex ו כלוריד צסיום צפיפות צנטריפוגה Gradient

וידאו זה מדגים את פרוטוקול להפקת דנ"א החומר פורמלין קבוע, פרפין, מוטבע. זהו הליך רב היום שבו חלקים רקמה deparaffinized עם קסילן, rehydrated עם אתנול שטופלו proteinase K לטהר לבודד DNA לצורך ניתוח גנטי ספציפי או הגנום כולו שלאחר מכן.

הפקת DNA מחומר פרפין Embedded עבור ניתוח גנטי epigenetic

למד שיטת מיצוי DNA במשקל מולקולרי נמוך משפכים להערכת עמידות מיקרוביאלית סביבתית. הפרוטוקול משתמש בפוליאתילן גליקול ונתרן כלורי ללכידת גנים של עמידות לאנטיביוטיקה.

מיצוי משופר של DNA במשקל מולקולרי נמוך משפכים להערכה מקיפה של עמידות מיקרוביאלית

גלה סרטונים נוספים