Name: יצירת פרופיל pH לומינלי באורגנואידים תלת מימדיים במערכת העיכול באמצעות מיקרואלקטרודות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-05T14:25:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: למדו מדידת pH תוך לומינלי באורגנואידים גסטריים אנושיים תלת מימדיים באמצעות מיקרואלקטרודות. שיטה זו מאפשרת למחקרים לחקור תגובות אפיתליות להדבקה ב-Helicobacter pylori ולפתח טיפולים ציטופרוטקטיביים חדשים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות לד"ר אלן לאושנור, ד"ר פיל סטיוארט ובנגיסו קיליק על עבודתם הקודמת ועל עזרתם במיקרו-חיישנים O2 ; אנדי סברל להכשרה בתרבית אורגנואידים ומיקרומניפולציה; לקסי בורצ'אם לסיוע בתרבות אורגנואידים, הכנת מדיה, רישום נתונים וארגון; וד"ר סוזי קוהוט לייעוץ כללי באלקטרופיזיולוגיה. ברצוננו להודות לד"ר היידי סמית על עזרתה בדימות ולהודות למרכז להנדסת ביופילם מתקן הדמיה ביולוגית באוניברסיטת מונטנה, הנתמך על ידי מימון מתוכנית MRI של הקרן הלאומית למדע (2018562), קרן הצדקה M.J. Murdock (202016116), משרד ההגנה האמריקאי (77369LSRIP &W911NF1910288), ומתקן הננוטכנולוגיה במונטנה (חבר NNCI הנתמך על ידי NSF Grant ECCS-2025391).
תודה מיוחדת לכל צוות יוניסנס שאיפשר עבודה זו, במיוחד לד"ר אנדרו קרסקוס, ד"ר לורה וודס, ד"ר לארס לארסן, ד"ר טייג' דלסגארד, ד"ר ליין דאוגארד, ד"ר קארן מגארד ומטה גמלגארד. המימון למחקר שלנו ניתן על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות R01 GM13140801 (D.B., R.B.) ו- UL1 TR002319 (K.N.L), ופרס הרחבת מחקר מהמשרד למחקר ופיתוח כלכלי באוניברסיטת מונטנה (D.B). איור 1A נוצר באמצעות BioRender.

מדידת pH לומינלית מדויקת באורגנואידים תלת-ממדיים של קיבה עם מיקרואלקטרודות

<ol><li>Zhang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+spatial+omics+dissects+organoid+biomimicry%5BTitle%5D)+AND+%22GEN+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Tissue spatial omics dissects organoid biomimicry.</a> GEN Biotechnology. 2 (5), 372-383 (2023).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li>
<li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+modeling+in+stem+cell-derived+3d+organoid+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Disease modeling in stem cell-derived 3d organoid systems.</a> Trends Mol Med. 23 (5), 393-410 (2017).</li>
<li>Achberger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merging+organoid+and+organ-on-a-chip+technology+to+generate+complex+multi-layer+tissue+models+in+a+human+retina-on-a-chip+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Merging organoid and organ-on-a-chip technology to generate complex multi-layer tissue models in a human retina-on-a-chip platform.</a> Elife. 8, e46188(2019).</li>
<li>Bartfeld, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+human+gastric+epithelial+stem+cells+and+their+responses+to+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection.</a> Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).</li>
<li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nat Cell Biol. 18 (3), 246-254 (2016).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Davies, J. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDavies%2C+JA+%22Organoids+and+Mini-organs%22">Organoids and Mini-organs</a>. Davies, J. A., Lawrence, M. L. , Academic Press. Ch. 1-2 3-40 (2018).</li>
<li>Ambrosini, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulation+of+the+accessible+interface+of+biopsy-derived+canine+intestinal+organoids+to+study+epithelial-luminal+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Recapitulation of the accessible interface of biopsy-derived canine intestinal organoids to study epithelial-luminal interactions.</a> PLoS One. 15 (4), e0231423(2020).</li>
<li>Williams, S. E., Turnberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+a+pH+gradient+across+mucus+adherent+to+rabbit+gastric+mucosa%3A+Evidence+for+a+%27mucus-bicarbonate%27+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Demonstration of a pH gradient across mucus adherent to rabbit gastric mucosa: Evidence for a 'mucus-bicarbonate' barrier.</a> Gut. 22 (2), 94-96 (1981).</li>
<li>Schubert, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastric+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Gastric secretion.</a> Curr Opin Gastroenterol. 20 (6), 519-525 (2004).</li>
<li>Celli, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheology+of+gastric+mucin+exhibits+a+pH-dependent+sol%E2%88%92gel+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Rheology of gastric mucin exhibits a pH-dependent sol−gel transition.</a> Biomacromolecules. 8 (5), 1580-1586 (2007).</li>
<li>Takeshita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+pH-dependent+errors+in+spectrophotometric+pH+measurements+of+seawater%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Assessment of pH-dependent errors in spectrophotometric pH measurements of seawater.</a> Marine Chemistry. 223, 103801(2020).</li>
<li>Mccracken, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2F%CE%B2-catenin+promotes+gastric+fundus+specification+in+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wnt/β-catenin promotes gastric fundus specification in mice and humans.</a> Nature. 541 (7636), 182-187 (2017).</li>
<li>Larsen, M., Borisov, S. M., Grunwald, B., Klimant, I., Glud, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+inexpensive+high+resolution+color+ratiometric+planar+optode+imaging+approach%3A+Application+to+oxygen+and+ph+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+and+Oceanography%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple and inexpensive high resolution color ratiometric planar optode imaging approach: Application to oxygen and ph sensing.</a> Limnology and Oceanography: Methods. 9 (9), 348-360 (2011).</li>
<li>Jewell, M. P., Galyean, A. A., Kirk Harris, J., Zemanick, E. T., Cash, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminescent+nanosensors+for+ratiometric+monitoring+of+three-dimensional+oxygen+gradients+in+laboratory+and+clinical+pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Luminescent nanosensors for ratiometric monitoring of three-dimensional oxygen gradients in laboratory and clinical pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Appl Environ Microbiol. 85 (20), e01116-e01119 (2019).</li>
<li>Brooks, E. L., Hussain, K. K., Kotecha, K., Abdalla, A., Patel, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional-printed+electrochemical+multiwell+plates+for+monitoring+food+intolerance+from+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Sens%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional-printed electrochemical multiwell plates for monitoring food intolerance from intestinal organoids.</a> ACS Sens. 8 (2), 712-720 (2023).</li>
<li>pH and reference electrode manual. Unisense. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://unisense.com/wp-content/uploads/2023/05/2023.05-pH-and-ref-sensor-manual.pdf">https://unisense.com/wp-content/uploads/2023/05/2023.05-pH-and-ref-sensor-manual.pdf</a> (2023).</li>
<li>Villahermosa, D., Corzo, A., Garcia-Robledo, E., Gonzalez, J. M., Papaspyrou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+indigenous+nitrate+reducing+sulfide+oxidizing+activity+in+microaerophilic+wastewater+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Kinetics of indigenous nitrate reducing sulfide oxidizing activity in microaerophilic wastewater biofilms.</a> PLoS One. 11 (2), 0149096(2016).</li>
<li>Pabst, B., Pitts, B., Lauchnor, E., Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel-entrapped+staphylococcus+aureus+bacteria+as+models+of+biofilm+infection+exhibit+growth+in+dense+aggregates%2C+oxygen+limitation%2C+antibiotic+tolerance%2C+and+heterogeneous+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Gel-entrapped staphylococcus aureus bacteria as models of biofilm infection exhibit growth in dense aggregates, oxygen limitation, antibiotic tolerance, and heterogeneous gene expression.</a> Antimicrob Agents Chemother. 60 (10), 6294-6301 (2016).</li>
<li>Ploug, H., Stolte, W., Epping, E. H. G., Jørgensen, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusive+boundary+layers%2C+photosynthesis%2C+and+respiration+of+the+colony-forming+plankton+algae%2C+phaeocystis+sp%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+and+Oceanography%22%5BJournal%5D)">Diffusive boundary layers, photosynthesis, and respiration of the colony-forming plankton algae, phaeocystis sp.</a> Limnology and Oceanography. 44 (8), 1949-1958 (1999).</li>
<li>Kolpen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrous+oxide+production+in+sputum+from+cystic+fibrosis+patients+with+chronic+pseudomonas+aeruginosa+lung+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Nitrous oxide production in sputum from cystic fibrosis patients with chronic pseudomonas aeruginosa lung infection.</a> PLoS One. 9 (1), 84353(2014).</li>
<li>Murphy, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+oxygen+tension+within+mesenchymal+stem+cell+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22J+R+Soc+Interface%22%5BJournal%5D)">Measurement of oxygen tension within mesenchymal stem cell spheroids.</a> J R Soc Interface. 14 (127), 20160851(2017).</li>
<li>Sebrell, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+gastric+spheroid+co-culture+model+reveals+chemokine-dependent+recruitment+of+human+dendritic+cells+to+the+gastric+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">A novel gastric spheroid co-culture model reveals chemokine-dependent recruitment of human dendritic cells to the gastric epithelium.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 8 (1), e153 157-171 (2019).</li>
<li>Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+and+genetic+modification+of+gastrointestinal+stem+cells+in+spheroid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture.</a> Nat Protoc. 8 (12), 2471-2482 (2013).</li>
<li>Takase, Y., Fujishima, K., Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+3d+culturing+of+organoids+from+murine+intestinal+crypts+and+a+single+stem+cell+for+organoid+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The 3d culturing of organoids from murine intestinal crypts and a single stem cell for organoid research.</a> J Vis Exp. (194), e65219(2023).</li>
<li>Cherne, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+hydrogel%2C+vitrogel%28%28r%29%29+organoid-3%2C+improves+immune+cell-epithelial+interactions+in+a+tissue+chip+co-culture+model+of+human+gastric+organoids+and+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">A synthetic hydrogel, vitrogel((r)) organoid-3, improves immune cell-epithelial interactions in a tissue chip co-culture model of human gastric organoids and dendritic cells.</a> Front Pharmacol. 12, 707891(2021).</li>
<li>Sebrell, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+analysis+of+human+gastric+epithelial+spheroids+reveals+spontaneous+rupture%2C+rotation+and+fusion+events%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Live imaging analysis of human gastric epithelial spheroids reveals spontaneous rupture, rotation and fusion events.</a> Cell Tissue Res. 371 (2), 293-307 (2018).</li>
<li>Sensortrace suite user manual. 3.3. Unisense. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://unisense.com/wp-content/uploads/2021/10/SensorTrace-Suite-Manual.pdf">https://unisense.com/wp-content/uploads/2021/10/SensorTrace-Suite-Manual.pdf</a> (2023).</li>
<li>Microprofiling system user manual. Unisense. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://unisense.com/wp-content/uploads/2021/09/2023.11-MicroProfiling-System-2.pdf">https://unisense.com/wp-content/uploads/2021/09/2023.11-MicroProfiling-System-2.pdf</a> (2023).</li>
<li>Wolffling, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Egf+and+bmps+govern+differentiation+and+patterning+in+human+gastric+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Egf and bmps govern differentiation and patterning in human gastric glands.</a> Gastroenterology. 161 (2), e616 623-636 (2021).</li>
<li>Boccellato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarised+epithelial+monolayers+of+the+gastric+mucosa+reveal+insights+into+mucosal+homeostasis+and+defence+against+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Polarised epithelial monolayers of the gastric mucosa reveal insights into mucosal homeostasis and defence against infection.</a> Gut. 68 (3), 400-413 (2019).</li>
<li>Mccracken, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+human+development+and+disease+in+pluripotent+stem-cell-derived+gastric+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Modelling human development and disease in pluripotent stem-cell-derived gastric organoids.</a> Nature. 516 (7531), 400-404 (2014).</li>
<li>Schumacher, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+murine-derived+fundic+organoids+in+studies+of+gastric+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The use of murine-derived fundic organoids in studies of gastric physiology.</a> J Physiol. 593 (8), 1809-1827 (2015).</li>
<li>Unisense. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://unisense.com/products/ph-microelectrode/">https://unisense.com/products/ph-microelectrode/</a> (2024).</li>
<li>Mccracken, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2Fbeta-catenin+promotes+gastric+fundus+specification+in+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wnt/beta-catenin promotes gastric fundus specification in mice and humans.</a> Nature. 541 (7636), 182-187 (2017).</li>
<li>Schreiber, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+measurement+of+ph+in+the+secreting+canaliculus+of+the+gastric+parietal+cell+and+adjacent+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">In situ measurement of ph in the secreting canaliculus of the gastric parietal cell and adjacent structures.</a> Cell Tissue Res. 329 (2), 313-320 (2007).</li>
<li>Xu, H., Li, J., Chen, H., Wang, C., Ghishan, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nhe8+plays+important+roles+in+gastric+mucosal+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Nhe8 plays important roles in gastric mucosal protection.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304 (3), G257-G261 (2013).</li>
<li>Gawenis, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+gastric+acid+secretion+in+mice+with+a+targeted+disruption+of+the+nhe4+na%2B%2Fh%2B+exchanger%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Impaired gastric acid secretion in mice with a targeted disruption of the nhe4 na+/h+ exchanger.</a> J Biol Chem. 280 (13), 12781-12789 (2005).</li>
<li>Lewis, O. L., Keener, J. P., Fogelson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+physics-based+model+for+maintenance+of+the+ph+gradient+in+the+gastric+mucus+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol-Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">A physics-based model for maintenance of the ph gradient in the gastric mucus layer.</a> Am J Physiol-Gastrointest Liver Physiol. 313 (6), G599-G612 (2017).</li>
<li>Okkelman, I. A., Neto, N., Papkovsky, D. B., Monaghan, M. G., Dmitriev, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+deeper+understanding+of+intestinal+organoid+metabolism+revealed+by+combining+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy+%28flim%29+and+extracellular+flux+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">A deeper understanding of intestinal organoid metabolism revealed by combining fluorescence lifetime imaging microscopy (flim) and extracellular flux analyses.</a> Redox Biol. 30, 101420(2020).</li>
<li>Pleguezuelos-Manzano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+culture+of+human+intestinal+organoids+derived+from+adult+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells.</a> Curr Protoc Immunol. 130 (1), e106(2020).</li>
<li>Guimera, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+minimally+invasive+microsensor+specially+designed+for+simultaneous+dissolved+oxygen+and+ph+biofilm+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">A minimally invasive microsensor specially designed for simultaneous dissolved oxygen and ph biofilm profiling.</a> Sensors (Basel). 19 (21), 4747(2019).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

גישה מוגבלת למרחב הלומינלי של אורגנואידים הגבילה מאוד את הבנתנו את הדינמיקה הפיזיולוגית של מיקרו-סביבה זו. כלי אמין לניתוחים פונקציונליים של פיזיולוגיה לומינלית ירחיב את יכולתנו למנף אורגנואידים כמודלים חוץ גופיים לפיזיולוגיה, פרמקולוגיה וחקר מחלות. אורגנואידים הם מודלים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית עם פוטנציאל נוסף לשכפל שונות גנטית בתוך האוכלוסייה האנושית. שיטות קיימות למדידת pH בתוך לומן אורגנואיד השתמשו בצבעים רגישים ל- pH או ננו-חלקיקים, שיטות שלעתים קרובות חייבות להיות משולבות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי או ספקטרוסקופיה 16,17,37. שיטת הפרופיל מבוססת המיקרו-חיישנים המתוארת מספקת מסלול חדש למדידת ה- pH התוך-לומינלי של אורגנואידים במערכת העיכול בדיוק מרחבי חדש. השיטה שלנו מדגימה מדידה עקבית ואמינה של pH לומינלי אורגנואיד במערכת העיכול, כמו גם עדות לשיפוע pH. בניסויים שלא פורסמו, אישרנו את הביטוי של גנים ממשפחת SLC SLC4A2 ו-26A7, אשר ידועים כאחראים להפרשת ביקרבונט, כמו גם SLC9A3, 9A4 ו-9A8 האחראים לחילופי פרוטונים (איור משלים S1)38,39,40,41. המחקרים שלנו מצביעים על דומיננטיות של הפרשת ביקרבונט ומחסור בתאים קודקודיים באורגנואידים שלנו, מה שעשוי להסביר את הבסיסיות.
חשוב לוודא כי המיקרואלקטרודות המשמשות מתאימות היטב עבור microprofiling אורגנואיד - זה כולל בחירת קוטר קצה הנכון. ניסינו גם קצוות של 25 מיקרומטר וגם של 50 מיקרומטר וקיבלנו תוצאות דומות (איור 2A), אבל החלטנו להתקדם עם גודל הקצה הקטן יותר לפי עצת היצרן, מאחר שהוא צפוי להיות פחות פולשני ולספק רזולוציה מרחבית גבוהה יותר, מאחר שהמדידות ממוצעות על פני אזור החוד המשופע. עם זאת, כחיסרון, טיפים קטנים יותר הם שבירים יותר. יש לקחת בחשבון את גודל האורגנואיד בקביעת הרזולוציה המרחבית הרצויה.
צעד קריטי בפרוטוקול היה הבטחת היכולת להבחין בין ה-pH התוך-לומינלי האורגנואידי לבין ה-pH ב-ECM, ולאחר מכן, בתווך התרבית הסובב אותו. ניתן היה לצפות לכמות סבירה של שטף מטבוליטים לתוך ומחוץ לאורגנואידים42. אנו מצפים שה-pH של אורגנואיד יושפע מסביבתו, ומצאנו שהאורגנואידים היו באופן עקבי פחות בסיסיים מסביבתם בשישה ניסויים עצמאיים (איור 2D). בנוסף, יציבות חשובה ביצירת פרופילים לא פחות מאשר במהלך כיול חיישנים.
אורגנואידים שמקורם ברקמה צפויים להציג מידה מסוימת של שונות בין תורם לתורם, ולכן חיוני ליצור פרופיל של כל קו אורגנואידים בנקודת ההתחלה לפני יישום התערבויות ניסיוניות כלשהן כגון טיפול תרופתי43. אנו משערים כי תנודות ב- pH בכל תרבית אורגנואיד אחת עשויות לנבוע משיפועי יונים מקומיים בסקלת המיקרו והפיזור ההטרוגני של ריר לומינלי כפי שנקבע על ידי אימונופלואורסנציה וצביעה אימונוהיסטוכימית (נתונים שלא פורסמו). השינויים הנצפים ב- pH בין קווי אורגנואידים בודדים ומעברים עשויים לנבוע מהבדלים אינדיבידואליים בהרכב התא ובפעילות ההפרשה של האורגנואידים. מצאנו גם שקווי אורגנואידים מסוימים היו מטבעם קשים יותר לחדירה מאחרים. באופן דומה, חלקם עלולים לאבד את שלמותם המבנית ולקרוס עם כניסת האלקטרודות (איור משלים S2 ווידאו משלים S1). זה לא נראה קשור למעבר אורגנואידים אך נצפה לרוב באורגנואידים מעל ~ 1.5 מ"מ קוטר. במחקר קודם הראינו כי הריר בתוך האורגנואידים התפזר בצורה הטרוגנית29. בגלל הטרוגניות זו, קשה לקבוע אם (או באיזו מידה) התפלגות הריר השפיעה על מדידה.
מיקרו-חיישנים הם כלים זעיר פולשניים שיכולים ליצור פרופיל פיזיולוגיה תוך-לומינלית אורגנואידית במהירות גבוהה וברזולוציה מרחבית גבוהה. חיישנים כאלה גם אינם מפריעים לשיפועים כימיים והם רגישים באופן מינימלי למערבולות במיקרו-סביבה המעניינת. העיצוב הקטן מתאפשר על ידי הפרדת אלקטרודת החיישן מאלקטרודת הייחוס הסטנדרטית בדיקות pH מעבדה משלבות את שתי האלקטרודות הללו, מה שמוביל לגודל גדול יותר. ננו-חיישני pH אופטיים ו-O2 למדידות תוך-תאיות פותחו על ידי קבוצת קאש בבית הספר למכרות של קולורדו והצליחו למדוד מטבוליטים הן במודלים של עכברים והן במודלים של ביופילם. עם זאת, בגלל ההטרוגניות בלומן האורגנואידי, חיישנים כאלה עלולים להוביל לתוצאות בלתי ניתנות לפירוש17. McCracken et al. ניתחו pH לומינלי באורגנואידים קיבה שמקורם בתאי גזע עובריים על ידי הזרקת SNARF-5F והדמיית הצבע הרגיש ל- pH במיקרוסקופ קונפוקליבזמן אמת 37. יש לציין כי המדידות שדווחו על-ידי McCracken היו דומות מאוד לערכי ה-pH שהתקבלו במחקר הנוכחי שלנו (איור 2B,C). הטכניקה שלנו יכולה אולי להיות מיושמת בארכיטקטורה חד-שכבתית, עם מערך אנכי יותר כמו בפרופיל ביופילם, אם כי זה עלול להוות סיכון לפגיעה באלקטרודות44. מחקרים עתידיים יכולים לכלול גם מדידות רציפות של pH במשך מספר ימים כדי להעריך שינויים הקשורים להתפתחות התא. מכיוון שאורגנואידים בגודל בינוני בדרך כלל מתאוששים ומחלימים לאחר חיטוט, אורגנואיד אחד יכול באופן תיאורטי להיחקר מספר פעמים כל עוד ניתן לשמור על סטריליות התרביות. ככל שאנו מחדדים את הבנתנו את דינמיקת החומציות במודלים אורגנואידים, הרזולוציה המרחבית חייבת להיות בראש סדר העדיפויות למיפוי מדויק של המיקרו-סביבה התלת-ממדית המורכבת והבלתי נגישה מבחינה היסטורית בתוכה.
לסיכום, פרוטוקול זה מספק שיטה מפורטת למדידות מדויקות של pH ברזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה באמצעות מיקרואלקטרודות pH המותקנות על מיקרומניפולטור וסטריאומיקרוסקופ. שיטה זו אומתה עם אורגנואידים שמקורם בתאי גזע בוגרים אנושיים והיא מתאימה לאורגנואידים אפיתליאליים בקוטר של לפחות 200 מיקרומטר בעלי לומן מובהק. אנו צופים כי על ידי בחירת מיקרואלקטרודות חלופיות, שיטה זו יכולה להיות מותאמת בקלות לסוגים אחרים של אורגנואידים ומדידה של תרכובות חלופיות, כגון NO אוO 2.

אורגנואידים – מבנים רב-תאיים זעירים שמקורם בתאי גזע – חוללו מהפכה ביכולתנו לחקור את הפיזיולוגיה האנושית ומתחילים להחליף מודלים של בעלי חיים, אפילו במסגרות רגולטוריות1. מאז התיאור הראשוני של אורגנואידים במעיים על ידי Sato et al. בשנת 2009, טכנולוגיית אורגנואידים הפכה פופולרית מאוד2. מספר רב של מחקרים אפיינו את ההרכב והתפקוד התאי של מודלים אורגנואידים בפירוט רב 3,4,5,6. עם זאת, המרחב המואר של מבנים רב-תאיים תלת-ממדיים אלה נותר במידה רבה בלתי מוגדר 7,8. לומן הוא החלל המרכזי של אורגנואידים שמקורם ברקמות ריריות המוקף בחלקים אפיים של תאי אפיתל מקוטבים. מכיוון שהפרשת התאים והבליעה מתרחשות בעיקר על פני השטח של האפיתל האפיקאלי, המיקרו-סביבה הלומינלית של אורגנואידים נשלטת על ידי תהליכים פיזיולוגיים חשובים אלה. מודלים אורגנואידים הנמצאים בשימוש כיום מדגימים שינויים בדפוסי איתות תאים, גבעול כללי, שיפועי ריכוז מטבוליטים ותנאי סביבה9. הבנת הפיזיולוגיה הלומינלית של אורגנואיד נחוצה אפוא למידול מדויק של תפקוד איברים ופתולוגיה. למרבה הצער, חוסר הנגישות היחסי של לומן מעכב באופן משמעותי ניתוחים פונקציונליים של פיזיולוגיה לומינלית באורגנואידים תלת ממדיים10.
היכולת לבחון פרופילי pH חשובה במיוחד בקיבה, הידועה לשמצה בכך שיש לה את שיפוע הפרוטונים התלול ביותר בגוף, הנע בין בערך 1-3 בלומן, לכמעט נייטרלי באפיתל 11,12,13. עדיין קיים פער משמעותי בהבנתנו את התחזוקה המיקרוסקולית של שיפוע ה-pH בקיבה, ואת הרלוונטיות של מודלים אורגנואידים בשחזור הסביבה הדינמית הזו על פני שכבת ריר הקיבה. גישות מסורתיות לניתוח pH אורגנואידי כללו שימוש בצבעים רגישים ל- pH, שיכולים להיות אינדיקטורים פלואורסצנטיים או קולורימטריים. McCracken et al. השתמשו בהזרקה לומינלית של SNARF-5F-a ratiometric pH אינדיקטור לתוך אורגנואידים כדי לנתח ירידה ב- pH לומינלי בתגובה לטיפול בהיסטמין. צבעים כאלה יכולים להיות משולבים במדיה התרבותית, מה שמאפשר ניטור בזמן אמת ולא פולשני של pH. לא רק שצבעים רגישים ל-pH דורשים שלבי כיול מורכבים התורמים לאמינות ודיוק ירודים במדידות, אלא שצבעים כאלה גם נוטים לפעול בתוך טווחי זיהוי ספציפיים שעשויים שלא לייצג את טווח החומציות המלא בתוך המיקרו-סביבה המעניינת14,15. זה יכול להיחשב סביר, עם זאת, להשתמש בצבעי אינדיקטור עבור ניסויים מאששים. פותחו גם ננו-חיישנים אופטיים המשתמשים בגישות פלואורסצנטיות מבוססות אופטודה וחישת pH; עם זאת, טכניקות חישה כאלה דורשות הדמיה מיקרוסקופית והן רגישות גם לפוטו-הלבנה, פוטוטוקסיות, כמו גם הטיית הדמיה16,17. בנוסף, לברוקס ועמיתיו יש לוחות רב-באר מודפסים בתלת-ממד המכילים מיקרואלקטרודות שעליהן ניתן לצפות אורגנואידים18. גישה זו, עם זאת, אינה מאפשרת מדידות ישירות בתוך לומן אורגנואידים.
מדידות pH מבוססות אלקטרודות יכולות להשיג דיוק משופר בהשוואה לשיטות אחרות, כמו גם לספק ניטור pH בזמן אמת. בנוסף, אלקטרודות pH המותקנות על מיקרומניפולטורים מאפשרות רזולוציה מרחבית מעולה של מדידות pH מכיוון שניתן לשלוט היטב במיקום המדויק של קצה האלקטרודה. זה מאפשר את הגמישות הגבוהה ביותר האפשרית ויכולת שחזור בניתוחים של מודלים אורגנואידים. האלקטרודות המשמשות כאן הן מיקרואלקטרודות pH ממוזערות הפועלות על בסיס דיפוזיה של פרוטונים דרך זכוכית pH סלקטיבית המקיפה חוט פלטינה דק. המיקרואלקטרודה מחוברת לאלקטרודת ייחוס חיצונית Ag-AgCl ולאחר מכן מחוברת למטר מיליוולט בעל עכבה גבוהה. הפוטנציאל החשמלי בין שני קצות האלקטרודות כאשר הם שקועים באותה תמיסה ישקף את רמת החומציות של התמיסה19. מערכות מיקרופרופילינג כאלה שימשו בניתוח מטבולי של ביופילמים 20,21, אצות פלנקטוניות22, דגימות כיח אנושי23, ואפילו בספרואידים של תאי גזע מזנכימליים24. הן המעבדה שלנו והן מרפי ועמיתיו השתמשו בעבר במיקרואלקטרודות O2 מבוקרות מיקרומניפולטור כדי להעריך את ריכוזי החמצן בחללים הלומינליים של אורגנואידים. מרפי ועמיתיו שילבו שיטה זו עם מודלים מתמטיים כדי לחשוף שיפוע חמצן בתוך הספרואידים שלהם. הקבוצה שלנו הצליחה למצוא רמות חמצן לומינליות מופחתות באורגנואידים בקיבה שמקורם ברקמות, בהשוואה למטריצה החוץ-תאית25 שמסביב.
כאן, אנו מספקים שיטה מפורטת לפרופיל מיקרואלקטרודות ידני של ה- pH הלומינלי באורגנואידים כדוריים במערכת העיכול שתאפשר הבנה פיזיולוגית משופרת של המיקרו-סביבה הלומינלית המורכבת שלהם. אנו צופים כי טכניקה זו תוסיף ממד חדש לחקר הפיזיולוגיה של אורגנואידים באמצעות מדידות בזמן אמת ברזולוציה גבוהה של רמות pH בקנה מידה מיקרו. יתר על כן, ניתן להתאים בקלות את הפרוטוקול הבא לניתוח של O2, N2O, H2, NO, H2S, חמצון-חיזור וטמפרטורה בסוגים שונים של מודלים אורגנואידים. פרופיל פיזיולוגי משמש ככלי רב ערך לאופטימיזציה של תנאי תרבית אורגנואידים כדי לחקות טוב יותר בסביבות in vivo , ובכך לשפר את הרלוונטיות והתועלת של מודלים אורגנואידים במחקר ביו-רפואי.

<table><tbody><tr><td>3 M KCl</td><td>Unisense</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל פיפט מתנדנד לא סרולוגי, עטוף בנפרד, נייר/פלסטיק, שקית,</td><td>CellTreat</td> סטרילי <td>229091B</td><td></td></tr><tr><td>10 מ"ל פיפט מתנדנד לא סרולוגי, עטוף בנפרד, נייר/פלסטיק, שקית,</td><td>CellTreat</td> סטרילי <td>229092B</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל צינור צנטריפוגה - מתלה קצף,</td><td>CellTreat</td> סטרילי <td>229412</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית רקמות 24 באר,</td><td>CellTreat</td> סטרילי <td>229124</td><td></td></tr><tr><td>25 מ"ל פיפט מתנדנד לא סרולוגי, עטוף בנפרד, נייר/פלסטיק, שקית,</td><td>CellTreat</td> סטרילי <td>229093B</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 35 מ"מ | מס' 1.5 כיסוי | קוטר זכוכית 20 מ"מ | </td> צינור צנטריפוגה לא מצופה <td>MatTek</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל - מתלה קצף,</td><td>CellTreat</td> סטרילי <td>229422</td><td></td></tr><tr><td>70% אתנול</td><td>BP82031GAL</td><td>BP82031GAL</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m מסננת תאים, עטופה בנפרד, CellTreat סטרילי</td><td></td><td>229483&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1,000 ומיקרו; L אורך מורחב קצות פיפטה עם שמירה נמוכה, מתלה,</td><td>CellTreat</td><td>סטרילי 229037</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת אמפוטריצין B (Fungizone)</td><td>HyClone Laboratories, Inc</td><td>SV30078.01</td><td></td></tr><tr><td>ארון בטיחות ביולוגית</td><td>Nuaire&nbsp;</td><td>NU-425-600</td><td>Class II סוג A/B3</td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>פישר ביוריאגנטים</td><td>BP1605-100</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת התאוששות תאים</td><td>קורנינג</td><td>354253</td><td>תמיסת דיסוציאציה של תאים</td></tr><tr><td>DMEM/F-12 (DMEM מתקדם)</td><td>Gibco</td><td>12-491-015</td><td></td></tr><tr><td>השינוי של דולבקו של מדיום הנשרים (DMEM)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>15017CV</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>HyClone Laboratories, Inc</td><td>SH30088</td><td></td></tr><tr><td>G418 סולפט</td><td>קורנינג</td><td>30-234-CR</td><td></td></tr><tr><td>ג'נטמיצין סולפט</td><td>IBI Scientific</td><td>IB02030</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, חומצה חופשית</td><td>Cytiva</td><td>SH30237.01</td><td></td></tr><tr><td>HP Pavillion 2 ב-1 14 אינץ' מחשב נייד Intel Core i3</td><td>HP</td><td>M03840-001</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית</td><td>פישר מדעי</td><td>A144C-212</td><td></td></tr><tr><td>חממה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>11676604</td><td></td></tr><tr><td>אייפון 12 מצלמה</td><td>אפל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>Cytiva</td><td>SH3003401</td><td></td></tr><tr><td>גדול קימברלי-קלארק מקצועי Kimtech Science Kimwipes מגבים עדינים למשימה, 1 רובד</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>34133</td><td></td></tr><tr><td>M 205 FA סטריאומיקרוסקופ</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מטריצת ממברנה Matrigel 354234</td><td>קורנינג</td><td>CB-40234</td><td></td></tr><tr><td>MC-1 בקר UniMotor</td><td>Unisense</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מתיל אדום</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MM33 מיקרומניפולטור</td><td>Marzhauser Wetzlar</td><td>61-42-113-0000</td><td>ימני</td></tr><tr><td>MS-15 שלב ממונע</td><td>Unisense</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanoject-II</td><td>Drummond</td><td>3-000-204</td><td>מזרק אוטומטי ננוליטר</td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15-140-148</td><td></td></tr><tr><td>pH מיקרואלקטרודות</td><td>Unisense</td><td>50-109158, 25-203452, 25-205272, 25-111626, 25-109160</td><td>תוכנת SensorTrace אינה תואמת למחשבי אפל</td></tr><tr><td>אלקטרודה ייחוס</td><td>Unisense</td><td>REF-RM-001652</td><td>תוכנת SensorTrace אינה תואמת ל מחשבי אפל</td></tr><tr><td>SB 431542</td><td>Tocris Bioscience</td><td>16-141-0</td><td></td></tr><tr><td>מתאם מצלמת סמארטפון</td><td>Gosky</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מפרט מעמד מעבדה LS</td><td>Unisense</td><td>LS-009238</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0.025%, פנול אדום</td><td>Gibco</td><td>25-200-056</td><td></td></tr><tr><td>UniAmp</td><td>Unisense</td><td>11632</td><td></td></tr><tr><td>United Biosystems Inc&nbsp; מגרדי תאים מיני 200/PK</td><td>פישר</td><td>MCS-200</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 דיהידרוכלוריד</td><td>Tocris Bioscience</td><td>12-541-0&MICRO</td><td></td></tr><tr><td>; ערכת כיול חיישנים</td><td>Unisense/ Mettler Toledo</td><td>51-305-070, 51-302-069</td><td>pH 4.01 ו-9.21, מנות 20 מ"ל</td></tr></tbody></table>

יצירת פרופיל ph לומינלי באורגנואידים תלת מימדיים במערכת העיכול באמצעות מיקרואלקטרודות

Profiling Luminal pH in Three-Dimensional Gastrointestinal Organoids Using Microelectrodes

אופטימיזציה ואפיון מפורט של מודלים אורגנואידים במערכת העיכול דורשים שיטות מתקדמות לניתוח הסביבה הלומינלית שלהם. מאמר זה מציג שיטה בעלת יכולת שחזור גבוהה למדידה מדויקת של pH בתוך הלומינה של אורגנואידי קיבה אנושיים תלת-ממדיים באמצעות מיקרואלקטרודות מבוקרות מיקרומניפולטור. מיקרואלקטרודות ה- pH זמינות באופן מסחרי ומורכבות מקצות זכוכית משופעים בקוטר 25 מיקרומטר. לצורך מדידות, מיקרואלקטרודת ה- pH מתקדמת ללומן של אורגנואיד (>200 מיקרומטר) התלוי במטריג'ל, בעוד אלקטרודת ייחוס מונחת שקועה בתווך שמסביב בלוח התרבית. 
באמצעות מיקרואלקטרודות כאלה לפרופיל אורגנואידים שמקורם בגוף הקיבה האנושי, אנו מראים כי pH לומינלי עקבי יחסית בכל תרבית היטב ב~7.7 ± 0.037 וכי ניתן להשיג מדידות רציפות במשך מינימום של 15 דקות. בכמה אורגנואידים גדולים יותר, המדידות חשפו שיפוע pH בין משטח האפיתל לבין הלומן, מה שמרמז על כך שניתן להשיג מדידות pH באורגנואידים ברזולוציה מרחבית גבוהה. במחקר קודם, מיקרואלקטרודות שימשו בהצלחה למדידת ריכוזי חמצן לומינלי באורגנואידים, והדגימו את הרבגוניות של שיטה זו לניתוח אורגנואידים. לסיכום, פרוטוקול זה מתאר כלי חשוב לאפיון פונקציונלי של המרחב הלומינלי המורכב בתוך אורגנואידים תלת-ממדיים.

הפרשת חומצה היא פונקציה מכרעת של הקיבה האנושית. עם זאת, עד כמה ניתן למדל הפרשת חומצה באורגנואידים היא עדיין נושא לוויכוח 6,32,33,34. לכן פיתחנו את הפרוטוקול המפורט לעיל כדי למדוד במדויק את ייצור החומצה באורגנואידים בקיבה. יש לציין כי השתמשנו באורגנואידים שמקורם בתאי גזע בוגרים ללא גירוי שגודלו בתרבית בתנאי התפשטות סטנדרטיים שעברו מספר פעמים, מה שהוביל לאובדן תאים קודקודיים35. לכן, נוכחות של תאים קודקודיים מפרישי חומצה ושחרור חומצה פעילה לא הייתה צפויה במערכת המודל שלנו.
לצורך הניסויים שלנו השתמשנו באורגנואידים בקטרים שבין 200 מיקרומטר ל-1,000 מיקרומטר שנזרעו על כלים עם תחתית זכוכית. ראשית, בדקנו שני גדלי קצה שונים עבור מיקרואלקטרודות – pH-25 עם קוטר קצה של 25 מיקרומטר ו-pH-50 עם קוטר קצה של 50 מיקרומטר. כפי שניתן לראות באיור 2A, לא היה הבדל משמעותי בין המדידות שהתקבלו עם הקצוות הקטנים בהשוואה לקצוות הגדולים יותר. באופן מעניין, ה- pH הבסיסי באורגנואידים נטה להיות מעט בסיסי ב~pH 8. באמצעות קצה pH-25 של 25 מיקרומטר, הערכנו בשלב הבא את השונות ב-pH הלומינלי בתוך עשרה אורגנואידים שונים שנשמרו על אותה לוחית תרבית, עם שלוש מדידות שהתקבלו מכל אורגנואיד (איור 2B). בתוך לוח אחד, ה-pH הלומינלי של אורגנואידים בודדים הראה רק שינויים קלים ולא משמעותיים (8.16 ±-0.12; p ≥0.0445-0.99) (איור 2B). השווינו גם מדידות pH תוך-לומינליות בתוך חמישה קווי אורגנואידים שונים עם מעברים שנעו בין 3 ל-16 (איור 2C). שוב, מצאנו מדידות pH עקביות בתוך כל תרבית, אך שונות משמעותית בין קווי אורגנואידים. עם זאת, pH לומינלי נשאר בדרך כלל בין pH 7.3 ל-pH 8.2, בסדר גודל אחד, ולא הייתה מגמה נראית לעין עבור pH ממוצע כאשר השוו מספרי מעבר מוקדם ומאוחר (איור 2C). לאחר מכן שאלנו אם ה- pH של לומן האורגנואיד קשור ישירות ל- pH של מדיית הרחבת האורגנואידים והמטריצה החוץ תאית (ECM). השוואה בין המדיה, ה-ECM המקיף את האורגנואידים, ולומן האורגנואידים חשפה הבדלים משמעותיים ב-pH, כאשר ה-pH הלומינלי של האורגנואידים נמוך מזה של ה-ECM, וה-ECM pH נמוך מזה של מצע ההתפשטות של האורגנואידים שמסביב (איור 2D), מה שמרמז על כך שה-pH הלומינלי של האורגנואידים היה רלוונטי מבחינה פיזיולוגית ולא נקבע ישירות על-ידי סביבת התרבית. במהלך שישה ניסויים בלתי תלויים, מדדנו pH לומינלי ממוצע שהיה כמעט נייטרלי ועמד על 7.13 ±-0.09.
מיקרומניפולטור ממונע שימש להשגת מדידות pH של לומן אורגנואיד ברזולוציה מרחבית גדולה יותר. גישה זו רלוונטית אם יש צורך לרשום pH או שיפועים אחרים בתוך לומן אורגנואיד מלא ריר29 . איור 2E מראה שתי סדרות מייצגות של מדידות pH באורגנואידים גדולים (&gt;1,000 מיקרומטר), המדגימות את נקודת הכניסה לכל אורגנואיד ומסתיימות בעומק של ~800 מיקרומטר. מכיוון שלשני האורגנואידים שצוינו לא היה אותו קוטר, המדידות אינן ניתנות להשוואה מיידית. בכל מקרה, אנו מראים עדות לשיפוע pH קל של Δ0.6 בין משטח האפיתל לבין לומן האורגנואיד העמוק יותר (איור 2E). כדי לקבוע את ההיתכנות של ביצוע מדידות pH באורגנואידים לאורך זמן, אשר יאפשרו מדידות של תגובות הטיפול בזמן אמת, רשמנו את ה- pH התוך-לומינלי בתוך אורגנואיד מייצג במשך כ-20 דקות, ומצאנו שהקריאה נשארה עקבית מאוד לאחר תקופת הסתגלות ראשונית (איור 2F). כדי לאמת את מדידות ה-pH הלומינלי בשיטה עצמאית, השתמשנו בצבע קולורימטרי רגיש ל-pH (אדום מתיל) שהזרקנו לתוך לומן האורגנואיד באמצעות מזרק אוטומטי ננו-ליטר המותקן על מיקרומניפולטור (איור 2G). הצבע הצהוב של הצבע אישר כי לומן האורגנואיד היה בעל pH &gt;6.2, התואם את מדידות המיקרואלקטרודות שהראו pH כמעט נייטרלי. בסך הכל, תוצאות מייצגות אלה ממחישות את ההיתכנות והשכפול של מדידות pH מבוססות מיקרואלקטרודות בתרביות אורגנואידים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66900/66900fig01.jpg"> איור 1: סקירה כללית של השיטה. (A) תרשים סכמטי של הגדרת פרופילים. המיקרואלקטרודה באיור 1A נלקחה מאתר יוניסנס. 36 (B) תמונה מייצגת של תרבית אורגנואידים מוכנה ליצירת פרופילים, סביב ECM והמדיה שמסביב (סרגל קנה מידה = 5 מ"מ). (C) דוגמה למיקום נכון של מיקרואלקטרודות כהכנה לחיטוט אורגנואידים (סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר). קיצור: ECM = מטריצה חוץ-תאית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66900/66900fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66900/66900fig02.jpg"> איור 2: אימות של פרופיל מיקרו-חיישנים באורגנואידים של קיבה אנושית. (A) השוואה בין מדידות pH של לומן בינוני באמצעות קצות מיקרואלקטרודות של 25 מיקרומטר (pH-25) ו-50 מיקרומטר (pH-50). נתונים מ-10 אורגנואידים בודדים, כל אחד מניסוי מייצג אחד. (B) התקבלו שלוש מדידות pH משוכפלות עבור 10 אורגנואידים בודדים. ANOVA חד-כיווני עם השוואות מרובות (p = 0.1229). (C) מדידות pH המתקבלות באמצעות אלקטרודת pH-25 עקביות בתוך כל אחד מחמישה קווי אורגנואידים שנותחו במספרי מעבר שונים; 4-10 אורגנואידים נמדדו בכל שורה על בסיס גודל וזמינות. ANOVA חד-כיווני עם השוואות מרובות (p &lt; 0.0001). (D) מדידות pH בתוך אורגנואידים בקיבה והמטריג'ל והמדיה שמסביב (n = 6 ניסויים עצמאיים). מדידות המתקבלות על ידי חדירה אורגנואידים אפיתל קיבה עם pH-25. כל נקודת נתונים היא הממוצע של 10 מדידות pH בודדות בתוך אורגנואיד יחיד. ANOVA חד-כיווני (עמ' &lt; 0.0001). (E) פרופילי pH אפיתל ללומן של שני אורגנואידים מייצגים באמצעות מיקרומניפולטור ממונע. (F) יציבות של pH לאורך זמן (~19.8 דקות) באורגנואיד מייצג אחד. (G) מיקרו-הזרקה של צבע אינדיקטור pH אדום מתיל ו-HCl לתוך לומן אורגנואיד קיבה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66900/66900fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="3">תורם</td>
		</tr><tr><td>איור</td>
			<td>קו</td>
			<td>מעבר</td>
			<td>מין</td>
			<td>גיל</td>
			<td>מוצא אתני</td>
		</tr><tr><td>2א</td>
			<td>35</td>
			<td>6</td>
			<td>F</td>
			<td>40</td>
			<td>B</td>
		</tr><tr><td>2ב</td>
			<td>7</td>
			<td>15</td>
			<td>F</td>
			<td>26</td>
			<td>B</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>7</td>
			<td>4</td>
			<td>F</td>
			<td>26</td>
			<td>B</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>1</td>
			<td>16</td>
			<td>F</td>
			<td>45</td>
			<td>C</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>34</td>
			<td>3</td>
			<td>F</td>
			<td>44</td>
			<td>ידוע</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>35</td>
			<td>6</td>
			<td>F</td>
			<td>40</td>
			<td>B</td>
		</tr><tr><td>2ג</td>
			<td>7</td>
			<td>15</td>
			<td>F</td>
			<td>26</td>
			<td>B</td>
		</tr><tr><td>דו-ממד</td>
			<td>36</td>
			<td>1</td>
			<td colspan="3">ידוע</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>7</td>
			<td>5</td>
			<td>F</td>
			<td>26</td>
			<td>B</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>37</td>
			<td>1</td>
			<td colspan="3">ידוע</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>31</td>
			<td>3</td>
			<td>F</td>
			<td>45</td>
			<td>H</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>7</td>
			<td>9</td>
			<td>F</td>
			<td>26</td>
			<td>B</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>7</td>
			<td>4</td>
			<td>F</td>
			<td>26</td>
			<td>B</td>
		</tr><tr><td>2ה</td>
			<td>10</td>
			<td>15</td>
			<td>F</td>
			<td>43</td>
			<td>ידוע</td>
		</tr><tr><td>2ו</td>
			<td>34</td>
			<td>3</td>
			<td>F</td>
			<td>33</td>
			<td>C</td>
		</tr><tr><td>דור 2</td>
			<td>7</td>
			<td>5</td>
			<td>F</td>
			<td>26</td>
			<td>B</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">בינוני הרחבת אורגנואיד קיבה אנושי (L-WRN)</td>
		</tr><tr><td>L-WRN מותנה בינוני</td>
			<td>50%</td>
		</tr><tr><td>DMEM/F12 מתקדם</td>
			<td>37%</td>
		</tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td>
			<td>10%</td>
		</tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td>
			<td>1%</td>
		</tr><tr><td>ל-גלוטמין</td>
			<td>1%</td>
		</tr><tr><td>ג'נטמיצין</td>
			<td>0.10%</td>
		</tr><tr><td>אמפוטריצין ב</td>
			<td>0.10%</td>
		</tr><tr><td>חיץ HEPES</td>
			<td>0.40%</td>
		</tr><tr><td>Y-27632</td>
			<td>0.10%</td>
		</tr><tr><td>SB-431542</td>
			<td>0.10%</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 2.
איור משלים S1: ביטוי טרנספורטר יונים באורגנואידים של קיבה אנושית. מספרי העתקה יחסיים מנורמלים ל-18S rRNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66900/240425%20Supplemental%20Figure%201%20Revised.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
איור משלים S2: אורגנואיד קיבה אנושי עם ארכיטקטורה מעוותת בעקבות ניקוב עם בדיקת מיקרו-חיישן pH. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66900/240229%20Supplemental%20Figure%202.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.</a>
וידאו משלים S1: ניסיון פרופיל לא מוצלח בתרבית אורגנואיד קיבה. מיקרואלקטרודת pH של 25 מיקרומטר מתקדמת ידנית לעבר האורגנואיד המעניין. לאחר ניסיון כושל עקב טעות בשיפוט הזווית, מנסים לבצע זווית אחרת ומתגלה כי האורגנואיד חסר את השלמות המבנית שיש לאפיין (המבנה הכדורי אינו יציב ומתעוות עם החדירה עם האלקטרודה). לאחר מכן המשתמש מנתב מחדש כדי לנסות אורגנואיד אחר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66900/240229%20Supplemental%20Video%201.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מדידות pH באורגנואידים בקיבה שמקורם ברקמה אנושית באמצעות מיקרואלקטרודות לאפיון מרחבי-זמני של פיזיולוגיה תוך-לומינלית.

יצירת פרופיל pH לומינלי באורגנואידים תלת מימדיים במערכת העיכול באמצעות מיקרואלקטרודות

The optimization and detailed characterization of gastrointestinal organoid models require advanced methods for analyzing their luminal environments. This ...

profiling-luminal-ph-three-dimensional-gastrointestinal-organoids

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

תאים הגדלים בסביבה תלת-ממדי (3-D) מייצגים שיפור ניכר לעומת טיפוח התא בסביבות 2-D (למשל, צלוחיות או מנות). כאן אנו מתארים את הפיתוח של מודל organotypic 3-D רב-תאיים של רירית המעי אדם מתורבת במיקרוגרבטיציה הניתנים על ידי החלפה-קיר-כלי (RWV) bioreactors.

פיתוח תאיים תלת ממד Organotypic דגם של אדם המעיים הריריים Grown במיקרוגרבטיציה

פרוטוקול זה מתאר את המדידה של מחסום האפיתל חדירות בטיפול תרופתי בזמן אמת הבאים בהאדם organoids מעיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולחיות התא מיקרוסקופ.

בזמן אמת מדידה של מחסום האפיתל חדירות ב Organoids מעיים אנושיים

את כל המבנה תלת-ממדי ואת התוכן התאי של אורגנואידים, כמו גם את הדמיון הפנוטיפיק שלהם לרקמות המקוריות ניתן ללכד באמצעות פרוטוקול הדמיה תלת-ממדי ברזולוציה של תא יחיד המתואר כאן. פרוטוקול זה ניתן להחיל על מגוון רחב של אורגנואידים המשתנים במקור, גודל וצורה.

הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה חד-תאית של אורגנואידים שלמים

כאן אנו מציגים שני פרוטוקולים המאפשרים מידול של אינטראקציות ספציפיות למעיים. מונו-שכבתי מעיים שמקורם באורגנוידים ותרבויות ממשק נוזלי אוויר (ALI) מאפשרות ליצור אפיתליה מובחנת היטב הנגישה הן מצדי הזוהר והן מצד בזולטר, בעוד שאורגנואידים מעיים הפוכים בקוטביות חושפים את הצד האפי שלהם והם נוחים לתפוקה גבוהה.

שיטות תרבות לחקר אינטראקציות ספציפיות לאפיקליות באמצעות מודלים אורגנויד מעיים

כאן, אנו מתארים פרוטוקול לתרבית אורגנואידים תלת-ממדיים במעי חזיר מקריפטים אפיתליאליים שמורים בהקפאה. אנו מתארים גם שיטה להקמת חד-שכבות תאים הנגזרות מאורגנואידים תלת-ממדיים, המאפשרים גישה לצד האפי של תאי אפיתל.

תרבית אורגנואידים תלת-ממדיים במעי חזרזיר מקריפטים אפיתליאליים שמורים בהקפאה והקמת חד-שכבות תאים

אנו מתארים פרוטוקול לבידוד קריפטים של מעי דק מורין ואורגנואידים תלת-ממדיים של תרבית מעיים מהקריפטים. בנוסף, אנו מתארים שיטה ליצירת אורגנואידים מתא גזע יחיד במעי בהיעדר נישה תאית תת-אפיתלית.

תרבית תלת-ממדית של אורגנואידים מקריפטים של מעי מורין ותא גזע יחיד למחקר אורגנואידים

מקצבים צירקדיים, הקיימים ברוב האורגניזמים, מווסתים את הארגון הזמני של תהליכים ביולוגיים. אורגנואידים תלת-ממדיים התגלו לאחרונה כמודל רלוונטי מבחינה פיזיולוגית במבחנה . פרוטוקול זה מתאר את השימוש בכתבים ביולומינסנטיים כדי לצפות במקצבים צירקדיים באורגנואידים, ומאפשר חקירות חוץ גופיות של מקצבים צירקדיים במערכות רב-תאיות.

ניטור תנודות צירקדיות עם כתב ביולומינסנציה באורגנואידים

מחקר זה מתאר פרוטוקול ליצירת חד-שכבות דו-ממדיות של אורגנואידים חזיריים שמקורם במעי הדק והגס. הצמיחה של חד-שכבות אלו מסומנת על ידי הגדלת ערכי TEER, המעידים על שלמות אפיתל חזקה. בנוסף, חד-שכבות אלה מציגות תגובות הפרשה פיזיולוגיות בניסויי תא אוסינג לאחר יישום פורסקולין.

אורגנואידים דו-ממדיים במעי חזיר המשקפים את התכונות הפיזיולוגיות של המעיים הטבעיים

אנו מציגים פרוטוקול שלב אחר שלב להדמיה ברזולוציה גבוהה, ללא תוויות ותלת מימד של אורגנואידים באמצעות הולוטומוגרפיה קוהרנטית נמוכה. פרוטוקול זה מפרט הכנת תרבית אורגנואידים, רכישת הדמיה וניתוח תמונה חישובי, המאפשר הדמיה בזמן אמת של דינמיקה מבנית ותגובות תרופות באורגנואידים חיים.

הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה וניתוח למידת מכונה ללא תוויות של אורגנואידים במעי באמצעות הולוטומוגרפיה בקוהרנטיות נמוכה

על מנת ללמוד את השינויים של סיבי עצב intraepidermal nociceptive (IENFs) בneuropathies כואב (PN), פיתחנו פרוטוקולים שיכולים ישירות לבחון שינויים מורפולוגיים תלת ממדיים שנצפו בIENFs nociceptive. ניתוח תלת ממדי של IENFs יש את הפוטנציאל כדי להעריך את השינויים מורפולוגיים של IENF בPN.

הדמיה תלת ממדית של סיבי עצב Intraepidermal nociceptive בביופסיות עור אדם

למדו מדידת pH תוך לומינלי באורגנואידים גסטריים אנושיים תלת מימדיים באמצעות מיקרואלקטרודות. שיטה זו מאפשרת למחקרים לחקור תגובות אפיתליות להדבקה ב-Helicobacter pylori ולפתח טיפולים ציטופרוטקטיביים חדשים.

יצירת פרופיל pH לומינלי באורגנואידים תלת מימדיים במערכת העיכול באמצעות מיקרואלקטרודות

גלה סרטונים נוספים