Name: בדיקת פירופטוזיס על ידי ציטומטריית זרימה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-31T14:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 14 s
Description: למדו לזהות פירופטוזיס בתאים אביאניים באמצעות ציטומטריית זרימה וצביעה כפולה עם נוגדנים ל-chGSDME-NT ויודיד פרופידיום. שיטה זו מאפשרת זיהוי מדויק של תאים פירופטוטיים במחקר ביולוגי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לד"ר ג'ו ליו על עזרתו האדיבה. מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהתוכנית הלאומית למחקר ופיתוח מפתח של סין (מס '2022YFD1800300), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס '32130105), והקרן המיועדת למערכת מחקר טכנולוגית מודרנית של אגרו-תעשייה (מס '. CARS-40), סין.

פרטי הריאגנטים והציוד ששימש במחקר מפורטים בטבלת החומרים.
1. הכנת תאי מדגם
<ol><li>תרבית DF-1 (פיברובלסטים של עוברי תרנגולות בני אלמוות) בצלחות של שש בארות (5 x 10,5 תאים לכל באר) עם מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) באינקובטור 5% CO2 ב 38 ° C.</li>
	<li>כאשר התאים מגיעים למפגש של 80%, השליכו את מדיום תרבית התאים המכיל את הסרום, שטפו את התאים שלוש פעמים עם מלח חוצץ פוספט (PBS), ולאחר מכן הוסיפו 2 מ"ל של מדיום תרבית תאים ללא סרום לכל באר.</li>
	<li>הוסף את פתרון וירוס IBDV (המכיל MOI מחושב) לכל באר, והגדר פקד נגוע דמה על ידי הוספת נפח DMEM שווה לזה של תמיסת הווירוס.</li>
	<li>לאחר שעה אחת של ספיחת וירוסים, להשליך את מדיום התרבית, לשטוף את התאים עם PBS שלוש פעמים, להוסיף 2 מ"ל של DMEM בתוספת 2% FBS לכל באר, ולהמשיך תרביות תאים במשך 24 שעות.</li>
	<li>24 שעות לאחר זיהום IBDV, לבצע טיפול טריפסין (500 μL לכל באר) במשך 1 דקות ולאחר מכן לנטרל על ידי DMEM בתוספת 10% FBS (2 מ"ל לכל באר). לאחר מכן, יש לקצור את התאים כדי להכין תרחיפים חד-תאיים עבור ציטומטריית זרימה.</li>
	<li>צנטריפוגה את התאים ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 2-8 ° C. השליכו את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה.</li>
	<li>השהה מחדש את גלולת התא ב- PBS וסובב בעדינות את הצינורות במשך 3 שניות.</li>
	<li>צנטריפוגה את התאים כמתואר בשלב 1.6 (400 x גרם במשך 5 דקות ב 2-8 ° C).</li>
	<li>חזור על שטיפת התאים כמתואר בשלב 1.7 ושלב 1.8.</li>
	<li>בצע ספירת תאים באמצעות המוציטומטר תחת מיקרוסקופ. לאחר מכן, השהה מחדש את התאים בנפח מתאים של מאגר צביעת ציטומטריה זרימה (כך שריכוז התא הסופי הוא 1 x 107 תאים / מ"ל). מערבלים בעדינות את המתלים.</li>
</ol>2. צביעת תאים לציטומטריית זרימה
<ol><li>הוסף 100 μL של מתלים חד-תאיים משלב 1.10 לתוך 5 מ"ל צינורות פוליסטירן עגולים למטה (12 מ"מ × 75 מ"מ). הכן תאים נגועים ב- IBDV ו- IBDV לצביעת נוגדנים נגד chGSDME-NT/CT , והשתמש ב- IgG רגיל של עכבר כבקרת איזוטיפ. בינתיים, הכינו בקרה ריקה וצינוריות מוכתמות בודדות עם תאים נגועים ב- IBDV.</li>
	<li>הוסף 1 מיקרוגרם של Alexa Fluor 647-labeled anti-chGSDME-NT McAb, anti-chGSDME-CT McAb או עכבר רגיל IgG (כבקרת איזוטיפ) לצינורות IBDV-נגועים ובקרת דמה, בהתאמה. לאחר מכן, מערבלים בעדינות את הצינורות במשך 3 שניות.</li>
	<li>לדגור על התאים המוכתמים ב 2-8 ° C או על קרח במשך 30 דקות בחושך. מערבולות עדינות כל 10 דקות.</li>
	<li>לשטוף את התאים עם 1 מ"ל של חיץ צביעת ציטומטריה זרימה על ידי צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 2-8 ° C. השליכו את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה.</li>
	<li>חזור על שטיפת התאים כמתואר בשלב 2.4.</li>
	<li>להשהות מחדש את הגלולה ב 100 μL של חיץ צביעת ציטומטריה זרימה.</li>
	<li>הכתימו את התאים של הקבוצה הנגועה ב- IBDV והקבוצה הנגועה בדמה, כמו גם את הצינורות המוכתמים הבודדים של PI, עם 10 מיקרוגרם / מ"ל של PI למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן הוסיפו 400 מיקרוליטר של חיץ צביעת ציטומטריית זרימה עבור בדיקת ציטומטריית זרימה.</li>
</ol>3. ביצוע בדיקת ציטומטריית זרימה
<ol><li>הפעל את ציטומטר הזרימה כדי לאתחל את המכשיר ולהפעיל את התוכנה.</li>
	<li>התחל בהפעלת צינור הבקרה הריק ואחריו הצינורות המוכתמים הבודדים כדי להתאים את פרמטרי המתח והפיצוי של ציטומטר הזרימה. השתמש בתעלות פלואורסצנטיות FL3 ו-FL4, הפולטות ב-635 ננומטר, לזיהוי פלואורופורים PI ו-Alexa Fluor 647, בהתאמה.</li>
	<li>לאחר הגדרת כל הפרמטרים, הפעל את כל הדגימות ברצף.</li>
</ol>4. ניתוח נתוני ציטומטריית זרימה
<ol><li>נתח את הצביעה של Alexa Fluor 647 של כל דגימה בהיסטוגרמה של ערוץ FL4.</li>
	<li>כדי להעריך את חלקם של תאים חיוביים כפולים בכל דגימה, השתמש בתרשים הנקודות בן ארבעת הרבעים של FL3/FL4.</li>
	<li>קבעו ערכי סף חיוביים בהתבסס על בקרת איזוטיפ של דגימות מוכתמות כפולות מסוג IgG/PI, וודאו ששיעור התאים החיוביים הכפולים יישאר מתחת ל-1%. גישה זו מאפשרת למדוד את חלקם של תאים חיוביים כפולים בכל הדגימות.</li>
</ol>

כימות פירופטוזיס בתאי DF-1 נגועים בנגיף של מחלת בורסל זיהומית

<ol><li>He, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gasdermin+D+is+an+executor+of+pyroptosis+and+is+required+for+interleukin-1%CE%B2+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Gasdermin D is an executor of pyroptosis and is required for interleukin-1β secretion.</a> Cell Res. 25 (12), 1285-1298 (2015).</li>
<li>Kayagaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-11+cleaves+Gasdermin+D+for+non-canonical+inflammasome+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Caspase-11 cleaves Gasdermin D for non-canonical inflammasome signalling.</a> Nature. 526 (7575), 666-671 (2015).</li>
<li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+GSDMD+by+inflammatory+caspases+determines+pyroptotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death.</a> Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).</li>
<li>Angosto-Bazarra, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+analyses+of+the+Dasdermin+family+suggest+conserved+roles+in+infection+response+despite+loss+of+pore-forming+functionality%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolutionary analyses of the Dasdermin family suggest conserved roles in infection response despite loss of pore-forming functionality.</a> BMC Biol. 20 (1), 9(2022).</li>
<li>De Schutter, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Punching+holes+in+cellular+membranes%3A+Biology+and+evolution+of+gasdermins%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Punching holes in cellular membranes: Biology and evolution of gasdermins.</a> Trends Cell Biol. 31 (6), 500-513 (2021).</li>
<li>Kovacs, S. B., Miao, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gasdermins%3A+Effectors+of+pyroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Gasdermins: Effectors of pyroptosis.</a> Trends Cell Biol. 27 (9), 673-684 (2017).</li>
<li>Jiang, S., Gu, H., Zhao, Y., Sun, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teleost+gasdermin+E+is+cleaved+by+caspase+1%2C+3%2C+and+7+and+induces+pyroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Teleost gasdermin E is cleaved by caspase 1, 3, and 7 and induces pyroptosis.</a> J Immunol. 203 (5), 1369-1382 (2019).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duck+gasdermin+E+is+a+substrate+of+caspase-3%2F-7+and+an+executioner+of+pyroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Duck gasdermin E is a substrate of caspase-3/-7 and an executioner of pyroptosis.</a> Front Immunol. 13, 1078526(2022).</li>
<li>Müller, H., Islam, M. R., Raue, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+on+infectious+bursal+disease-the+past%2C+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Research on infectious bursal disease-the past, the present and the future.</a> Vet Microbiol. 97 (1), 153-165 (2003).</li>
<li>Müller, H., Scholtissek, C., Becht, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+infectious+bursal+disease+virus+consists+of+two+segments+of+double-stranded+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The genome of infectious bursal disease virus consists of two segments of double-stranded RNA.</a> J Virol. 31 (3), 584-589 (1979).</li>
<li>Cubas-Gaona, L. L., Diaz-Beneitez, E., Ciscar, M., Rodríguez, J. F., Rodríguez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exacerbated+apoptosis+of+cells+infected+with+infectious+bursal+disease+virus+upon+exposure+to+interferon+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Exacerbated apoptosis of cells infected with infectious bursal disease virus upon exposure to interferon alpha.</a> J Virol. 92 (11), (2018).</li>
<li>Duan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+upregulation+of+chicken+microRNA-16-5p+expression+in+DF-1+cells+following+infection+with+infectious+bursal+disease+virus+%28IBDV%29+enhances+IBDV-induced+apoptosis+and+viral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Epigenetic upregulation of chicken microRNA-16-5p expression in DF-1 cells following infection with infectious bursal disease virus (IBDV) enhances IBDV-induced apoptosis and viral replication.</a> J Virol. 94 (2), e01724(2020).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+for+voltage-dependent+anion+channel+2+in+infectious+bursal+disease+virus-induced+apoptosis+in+host+cells+via+interaction+with+VP5%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Critical role for voltage-dependent anion channel 2 in infectious bursal disease virus-induced apoptosis in host cells via interaction with VP5.</a> J Virol. 86 (3), 1328-1338 (2012).</li>
<li>Rodríguez-Lecompte, J. C., Niño-Fong, R., Lopez, A., Frederick Markham, R. J., Kibenge, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+bursal+disease+virus+%28IBDV%29+induces+apoptosis+in+chicken+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Immunol+Microbiol+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Infectious bursal disease virus (IBDV) induces apoptosis in chicken B cells.</a> Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 28 (4), 321-337 (2005).</li>
<li>Wang, S., Liu, Y., Zhang, L., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+monitoring+cancer+cell+pyroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Methods for monitoring cancer cell pyroptosis.</a> Cancer Biol Med. 19 (4), 398-414 (2021).</li>
<li>Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+changes+during+programmed+cell+deaths%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane changes during programmed cell deaths.</a> Cell Research. 28 (1), 9-21 (2018).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyroptosis+is+driven+by+non-selective+gasdermin-d+pore+and+its+morphology+is+different+from+mlkl+channel-mediated+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Pyroptosis is driven by non-selective gasdermin-d pore and its morphology is different from mlkl channel-mediated necroptosis.</a> Cell Research. 26 (9), 1007-1020 (2016).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

מאמר זה מתאר שיטה יעילה לבדיקת פירופטוזיס באמצעות ציטומטריית זרימה, המושגת באמצעות צביעה כפולה של תאים נגועים עם Alexa Fluor 647-labeled anti-chGSDME-NT McAb ו-PI. גישה זו יכולה להיות מיושמת גם על סוגי תאים שונים כדי להבדיל פירופטוזיס מסוגים אחרים של מוות תאי, כגון אפופטוזיס ונמק.
פירופטוזיס, סוג דלקתי של מוות תאי מתוכנת המסתמך בעיקר על היווצרות נקבוביות קרום פלזמה המושרה על ידי Gasdermin (GSDM) D ביונקים 1,2,3, הוערך באופן מסורתי באמצעות שיטות כמו שחרור LDH 6,15, תכונות מורפולוגיות16, וזיהוי של מקטעי GSDM-NT/GSDM-CT באמצעות מבחני Western Blot או IFA17. עם זאת, אף אחת מהשיטות הללו אינה מכמתת במדויק את אחוז התאים הפירופטוטיים. מחקר זה ממנף את נקבוביות קרום הפלזמה האופייניות בתאים פירופטוטיים שנוצרו על ידי מקטעי GSDM-NT כדי לפתח אסטרטגיה מבוססת ציטומטריית זרימה לקביעתם.
כאשר התאים הוכתמו פעמיים עם chGSDME-NT-Alexa Fluor 647 ו-PI ולאחר מכן נותחו באמצעות ציטומטריית זרימה בתעלות הפלואורסצנטיות FL3 ו-FL4, ניתן היה להבחין בפירופטוזיס באמצעות שני פרמטרים במקביל: צביעת chGSDME-NT-Alexa Fluor 647 המציינת היווצרות נקבוביות בקרום הפלזמה על ידי מקטע N-terminal של chGSDME שסוע, וצביעת PI המעידה על קרע בקרום הפלזמה. הנתונים מראים כי שיעור התאים החיוביים הכפולים chGSDME-NT/PI בתאים נגועים ב- IBDV (כ- 33%) היה גבוה משמעותית מאשר בקבוצת ביקורת נגועה ב- Mock (P < 0.001).
שיטת הניסוי דורשת מספר שיקולים כדי להבטיח דיוק ואמינות. ראשית, כל צינור דגימה המשמש לניתוח זרימה צריך להכיל לא פחות מ 1 x 106 תאים כדי לשמור על הדיוק של ניתוח זרימה. בהתחשב בשלבי השטיפה המרובים בפרוטוקול, מומלץ להגדיל את מספר התאים הראשוני בכל צינור בשלב 2.1 בהתאם, למשל, ל 2 x 106 תאים. חיוני לטפל בשטיפת תאים ובהעברתם בזהירות רבה כדי למנוע הפרעה לא מכוונת בשלמות התא. בנוסף, יש לזכור כי צפיפות התא, ריכוז הנוגדנים ומשך הפעולה יכולים כולם להשפיע על הגדרות הפרמטרים האופטימליות. לכן, יש צורך להתאים את הפרמטרים וההגדרות של ציטומטר הזרימה בהתבסס על תנאי הניסוי הספציפיים. במחקר זה, הפרמטרים ששימשו היו כדלקמן: FSC AmpGain נקבע ל -1.40, ומתח SSC נקבע ל -490 V. השער בחלקת FSC/SSC נקבע לכסות את כל אוכלוסיות התאים לצורך ניתוח FL3/4 ערוצים עוקבים. מתחי הפלואורסצנטיות הוגדרו ל-600 וולט עבור ערוץ FL3 (PI) ו-600 וולט עבור ערוץ FL4 (אלקסה פלואור 647). הפיצוי נקבע ל-38.0% בין ערוצי FL4 ו-FL3. קצב הזרימה נקבע ל-200 אירועים לשנייה, כאשר סף האירועים נקבע על 10,000.
בסיוע הגישה החדשנית, הבנה זו של תפקיד הפירופטוזיס בתיווך GSDME בתגובת המאכסן לזיהומים פתוגניים בתרנגולות ובמנגנונים הבסיסיים התקדמה באופן משמעותי. באמצעות שימוש בנוגדנים ספציפיים, הצלחנו לבחון chGSDME-NT יוצרי נקבוביות באמצעות ציטומטריית זרימה, להבחין בין תאים פירופטוטיים מאחרים ולהקל על קביעת שיעור התאים שעברו פירופטוזיס. כתוצאה מכך, שיטה זו מציעה יתרון מובהק על פני בדיקות Western Blot או IFA באיתור תאים פירופטוטיים.
עם זאת, המגבלה של פרוטוקול זה טמונה בשימוש במקטע N-terminal של GSDME עוף בתאים נגועים ב- IBDV כמודל ניסיוני לחקר פירופטוזיס. עם זאת, מחקר זה מסמן את השימוש המוצלח הראשון של ציטומטריית זרימה לקביעת פירופטוזיס.
לסיכום, שיטת ציטומטריית הזרימה המתוארת כאן לבחינת פירופטוזיס טומנת בחובה פוטנציאל רב לקידום הבנתנו את המנגנונים העומדים מאחורי פירופטוזיס הן ביונקים והן בעופות. שיטה זו מהווה כלי יעיל התורם למחקר על מוות תאי במדעי החיים.

פירופטוזיס הוא סוג דלקתי של מוות תאי מתוכנת התלוי בעיקר בהיווצרות נקבוביות קרום הפלזמה על ידי Gasdermin (GSDM) D ביונקים 1,2,3. בשל מחסור גנטי של GSDMD בתרנגולות 4,5, מנגנון הפירופטוזיס בתרנגולות נותר חמקמק. משפחת Gasdermin כוללת חלבונים משומרים, כולל GSDMA, GSDMB, GSDMC, GSDMD, GSDME ו-DFNB59 3,6. מחקרים דיווחו כי GSDME מדגי טלאוסט וברווזים נבקע על ידי קספאז-1/3/7 או קספאז-3/7 כדי לגרום למוות של תאים פירופטוטיים 7,8. עם זאת, התפקיד של פירופטוזיס בתיווך GSDME בתגובת המארח לזיהומים פתוגניים בתרנגולות עדיין לא ברור.
מחלת בורסל זיהומית (IBD) היא מחלת עופות חריפה, מדבקת מאוד ומדכאת חיסון הנגרמת על ידי IBDV9. IBDV, נגיף RNA דו-גדילי דו-סגמנטי (ds) שאינו עטוף, שייך לסוג Avibirnavirus במשפחת Birnaviridae10. מחקרים קודמים שנערכו על ידי אחרים והמעבדה שלנו הראו כי זיהום IBDV גורם למוות תאי בתאים מארחים דרך מסלולים שונים 11,12,13,14. ממצאים קודמים הראו כי זיהום IBDV מעורר שחרור של לקטט דהידרוגנאז (LDH), אינדיקטור למוות של תאים ליטיים 6,15, דבר המצביע על כך שזיהום IBDV גורם למוות של תאים ליטיים בתאים מארחים. יתר על כן, הנתונים מראים כי תאים נגועים ב- IBDV מפגינים מאפיינים מורפולוגיים של מוות תאי פירופטוטי, כולל נפיחות תאים עם בועות גדולות הנושבות מממברנת הפלזמה ופרופידיום יודיד (PI) - מכתים חיובי, דבר המצביע על כך שזיהום IBDV גורם לפירופטוזיס בתאים.
בהתחשב בכך שהיווצרות נקבוביות הממברנה בתאים פירופטוטיים על ידי מקטע N-terminal של GSDM שסוע (GSDM-NT) היא סימן היכר של פירופטוזיס, תיאורטית, תאים פירופטוטיים יכולים להיות מזוהים על ידי ציטומטריית זרימה על ידי בחינת GSDM-NT על קרום התא באמצעות נוגדנים ספציפיים. בתאים פירופטוטיים של עופות, המקטע N-terminal של עוף Gasdermin E (chGSDME-NT) יוצר נקבוביות ממברנה, ומאפשר לפרופידיום יודיד (PI) לעבור דרך DNA ולקשור אותו. לפיכך, ניתן לזהות את חלקם של תאים פירופטוטיים באמצעות ציטומטריית זרימה, ובכך להבדיל פירופטוזיס מצורות אחרות של מוות תאי, כגון אפופטוזיס ונמק. עם זאת, השיטה לבדיקת תאים פירופטוטיים על ידי ציטומטריית זרימה לא דווחה. במחקר זה, תאי DF-1 היו נגועים ב- IBDV, וציטומטריית זרימה נערכה כדי לבחון תאים פירופטוטיים באמצעות נוגדנים חד שבטיים (McAb) כנגד מקטע chGSDME-NT (קשור לקרום) וצביעת PI. באופן מפתיע, תאים פירופטוטיים זוהו ביעילות על ידי ציטומטריית זרימה. יתר על כן, ניתן לכמת את חלקם של תאים פירופטוטיים. ממצאים אלה מספקים אמצעי רב עוצמה ויעיל לקביעת פירופטוזיס.
מאמר זה מתאר שיטה לבדיקת פירופטוזיס בתאים נגועים ב- IBDV על ידי ציטומטריית זרימה באמצעות צביעת אנטי-chGSDME-NT, McAb ו- PI. שיטה זו יכולה להיות מורחבת גם לתאים נגועים אחרים בפתוגן וליישם כדי לבחון סוגי תאים שונים עם פירופטוזיס, להבדיל אותם מצורות אחרות של מוות תאי.

<table><tbody><tr><td>צינור פוליסטירן תחתון עגול 5 מ"ל (12 ופעמים; 75 מ"מ)</td> <td>קורנינג פלקון</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>6 באר צלחת תרבית תאים</td><td>קורנינג</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>ערכות תיוג נוגדנים Alexa Fluor 647 Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A20186</td><td></td></tr><tr><td>Anti-chGSDME-CT MCAB</td><td>SAE Biomedical Tech Company (ז'ונגשאן, סין)</td><td>EU0228</td><td></td></tr><tr><td>Anti-chGSDME-NT MCAB</td><td>SAE Biomedical Tech Company (ז'ונגשאן, סין)</td><td>EU0227</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת CellQuest</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 חממה</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3100</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגת הקפאה קריוגנית</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>מדיום הנשר השונה של Dulbecco (DMEM)&nbsp;</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>C11995500BT</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0193-500ML</td><td></td></tr><tr><td>ציטומטר זרימה</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSמאגר</td> צביעת ציטומטריה זרימה של קליבור <td></td></tr><tr><td></td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>00-4222-26</td><td></td></tr><tr><td>המוציטומטר</td><td>Qiu-jing מגיב ביוכימי & חברת מכשירים (שנגחאי, סין)</td><td>YX-JSB52</td><td></td></tr><tr><td>IBDV Lx זן</td><td></td><td></td><td>IBDV Lx סופק באדיבות על ידי ד"ר ג'ו ליו, האקדמיה לחקלאות ויערנות בבייג'ינג, בייג'ינג, סין</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך</td><td>צ'ונגצ'ינג חברת מכשירים פוטואלקטריים</td><td>XDS-1B</td><td></td></tr><tr><td>עכבר רגיל IgG</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>sc-2025</td><td></td></tr><tr><td>מאגר פוספט מלח (PBS)</td><td>M&; C&nbsp; Gene Technology</td><td>CC017</td><td></td></tr><tr><td>Propidium Iodide (PI)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA, 0.25%</td> <td>M& C&nbsp; Gene Technology</td><td>CC008</td><td></td></tr><tr><td>מתנד מערבולת</td><td>MIULAB</td><td>MIX-28+</td><td></td></tr></tbody></table>

בדיקת פירופטוזיס על ידי ציטומטריית זרימה

Examination of Pyroptosis by Flow Cytometry

פירופטוזיס הוא סוג דלקתי של מוות תאי מתוכנת המונע בעיקר על ידי היווצרות נקבוביות קרום הפלזמה על ידי N-terminus שנוצר מחלבונים ממשפחת Gasdermin (GSDM). בדיקת GSDM-NT המחוברת לקרום על ידי Western Blot היא השיטה הנפוצה ביותר להערכת פירופטוזיס. עם זאת, קשה להבדיל תאים עם פירופטוזיס מצורות אחרות של מוות תאי באמצעות שיטה זו. במחקר זה, תאי DF-1 נגועים בנגיף מחלת בורסל זיהומית (IBDV) שימשו כמודל לכימות שיעור התאים שעברו פירופטוזיס על ידי ציטומטריית זרימה, תוך שימוש בנוגדנים ספציפיים כנגד מקטע N-terminal של GSDME עוף (chGSDME-NT) וצביעת פרופידיום יודיד (PI). התאים החיוביים chGSDME-NT היו ניתנים לזיהוי בקלות על ידי ציטומטריית זרימה באמצעות נוגדנים אנטי-chGSDME-NT של Alexa Fluor 647. יתר על כן, חלקם של תאים חיוביים כפולים chGSDME-NT/PI בתאים נגועים ב- IBDV (כ -33%) היה גדול משמעותית מאשר בביקורת נגועה מדומה (P < 0.001). ממצאים אלה מצביעים על כך שבחינה של chGSDME-NT הקשור לקרום על ידי ציטומטריית זרימה היא גישה יעילה לקביעת תאים פירופטוטיים בקרב תאים העוברים מוות תאי.

chGSDME-NT על הממברנה של תאי DF-1 עם זיהום IBDV יכול להיות מזוהה בקלות על ידי ציטומטריית זרימה אחד המאפיינים החשובים ביותר של תאים פירופטוטיים הוא היווצרות נקבוביות הממברנה על ידי שברי GSDM-NT שנוצרו ממחשוף גסדרמין. לכן, תאים פירופטוטיים יכולים באופן תיאורטי להיות מזוהים על ידי ציטומטריית זרימה באמצעות בחינת GSDM-NT על קרום התא באמצעות נוגדנים ספציפיים. לפיכך, תאי DF-1 היו נגועים ב- IBDV, והתאים הפירופטוטיים נבדקו על ידי ציטומטריית זרימה באמצעות Alexa Fluor 647-labeled anti-chGSDME-NT McAb וצביעת PI. מספר ניכר של תאים חיוביים ל-chGSDME-NT זוהו על-ידי ציטומטריית זרימה לאחר זיהום IBDV (איור 1). לעומת זאת, בקרות נגועות בדמה או תאים מוכתמים בבקרת איזוטיפ IgG הראו תאים חיוביים מינימליים של Alexa Fluor 647. ממצאים אלה מדגימים את הזיהוי היעיל והספציפי של chGSDME-NT הקשור לקרום על ידי ציטומטריית זרימה. יש לציין כי מכיוון שקטעי מסוף C של chGSDME שסוע (chGSDME-CT) נשמרו בתוך הציטופלסמה ולא הועברו לקרום הפלזמה כמו chGSDME-NT, מקטעי chGSDME-CT בקושי היו ניתנים לזיהוי על ידי ציטומטריית זרימה באמצעות צביעת אנטיגן פני השטח של הממברנה, מה שתואם את העובדה שפירופטוזיס היה קשור לשברי chGSDME-NT הקשורים לקרום.
פירופטוזיס בתאי DF-1 יכול להיקבע על ידי ציטומטריית זרימה באמצעות צביעה כפולה של תאים עם תווית פלואורסצאין anti-chGSDME-NT, McAb ו- PI כאשר התאים הוכתמו פעמיים עם Alexa Fluor 647-labeled anti-chGSDME-NT McAb ו-PI, ולאחר מכן ניתוח ציטומטריית זרימה בתעלות הפלואורסצנטיות FL3 ו-FL4, תאים פירופטוטיים יכלו להיקבע על ידי צביעת chGSDME-NT ו-PI כחיוביים. כפי שניתן לראות באיור 2A,B, מספר ניכר של תאים חיוביים chGSDME-NT עם זיהום IBDV זוהו על ידי בדיקות ציטומטריית זרימה, וחלקם של תאים חיוביים כפולים chGSDME-NT/PI בתאים נגועים ב- IBDV (כ- 33%) היה גדול משמעותית מזה של קבוצת ביקורת נגועה ב- Mock (P &lt; 0.001), דבר המצביע על כך שהיווצרות נקבוביות הממברנה על-ידי chGSDME-NT היה מסונכרן עם השיבוש של קרום התא, ובכך גרם לתאים נגועים אלה IBDV לעבור מוות תאים פירופטוטי. נתונים אלה מראים בבירור כי זיהום IBDV גורם לפירופטוזיס בתיווך chGSDME בתאים מארחים. בעוד שתאי PI חיוביים בודדים עשויים לייצג צורות אחרות של מוות תאי המושרה על ידי זיהום IBDV. לכן, בחינה של chGSDME-NT יוצרי נקבוביות על ידי ציטומטריית זרימה מספקת שיטה רבת ערך להבחנה בין תאים פירופטוטיים לבין אלה שעוברים צורות אחרות של מוות תאי.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66912/66912fig01.jpg"> איור 1: בחינה של תאים הקשורים ל-chGSDME-NT על-ידי ציטומטריית זרימה. תאי DF-1 היו נגועים או נגועים ב- IBDV ב- MOI של 1. 24 שעות לאחר ההדבקה, התאים נקצרו ונצבעו באמצעות Alexa Fluor 647-labeled anti-chGSDME-NT /anti-chGSDME-CT McAb או איזוטיפ בקרת IgG, ונותחו באמצעות ציטומטריית זרימה. chGSDME-NT-צביעה חיובית בבדיקת ציטומטריית זרימה הדגימה את תאי chGSDME-NT הקשורים לקרום עם פירופטוזיס המושרה על ידי IBDV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66912/66912fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66912/66912fig02.jpg"> איור 2: בדיקת פירופטוזיס על-ידי ציטומטריית זרימה באמצעות צביעה כפולה עם chGSDME-NT ו-PI. (A) ניתוח תרשים נקודה של תאים פירופטוטיים על ידי ציטומטריית זרימה. תאי DF-1 היו נגועים ב- IBDV ב- MOI של 1. 24 שעות לאחר ההדבקה, התאים נקצרו, הוכתמו עם Alexa Fluor 647-labeled anti-chGSDME-NT /anti-chGSDME-CT McAb ו-PI, ונותחו באמצעות ציטומטריית זרימה. (B) אחוז התאים הפירופטוטיים בכל קבוצה ב-(A) שורטט ונותח סטטיסטית. ANOVA דו-כיווני שימש לניתוח מובהקות סטטיסטית. הנתונים ייצגו שלושה ניסויים עצמאיים והוצגו כאמצעים ± SD. ***P &lt; 0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66912/66912fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

מאמר זה מתאר זיהוי של תאים פירופטוטיים באמצעות ציטומטריית זרימה לאחר צביעה כפולה עם נוגדנים כנגד שבר N-terminal של עוף GSDME (chGSDME-NT) ופרופידיום יודיד (PI).

Pyroptosis is an inflammatory type of programmed cell death predominantly driven by the formation of plasma membrane pores by the N-terminus generated ...

examination-of-pyroptosis-by-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

אנו מציגים שיטת זרימת cytometry מבוסס לבחון התפתחות תא...

בחינה של בחירה חיובית ושלילית הרתי ידי זרימת cytometry

סרטון זה מדגים ציטומטריית זרימה למדידת ספיגת מיקרוגליה של חלקיקים פלואורסצנטיים לאחר מסירה תוך ויטריאלית בעין עכבר. ציטומטריית זרימה מזהה תאים חיים המבטאים CD11b ומבדילה תאי מיקרוגליה פגוציטיים המציגים פלואורסצנטיות ירוקה מתאים מיאלואידים אחרים, כולל מונוציטים המבטאים Ly6C ונויטרופילים המבטאים Ly6G.

מדידת ספיגה מיקרוגליאלית של חלקיקים פלואורסצנטיים המועברים תוך ויטראלית באמצעות ציטומטריית זרימה

הדור של מודל עכברים orthotopic של מזותליומה pleural הממארת על ידי השתלה של תאי II-45 מזותליומה לתוך חלל pleural של חולדות המוסמכות חיסוניים מוצג. שיטת cytometric זרימה לנתח שבע תת תא חיסון בבעלי החיים אלה מדגימת דם 25 μl גם מתוארת.

ניטור נייד Orthotopic השרשה והיקפי חיסון במודל השני-45 syngeneic עכברוש מזותליומה

מוצג כאן היא שיטה פשוטה לניתוח cytometric הבידוד וזרימה של תאי דם היקפי mononuclear הסתננות-גליומה שמניב נתונים כמותיים זמן תלוי במעמד המספר והפעלת תאים חיסוניים הנכנסים למייקרו-סביבת גידול במוח מוקדם.

בידוד וניתוח תזרים cytometric של תאי הדם ההיקפיים mononuclear הסתננות-Glioma

phagocytosis microglial הוא קריטי לשמירה על הומאוסטזיס רקמות ותפקוד לקוי phagocytic הייתה מעורב פתולוגיה. עם זאת, להערכת תפקוד microglia in vivo מבחינה טכנית מאתגרת. פתחנו טכניקה פשוטה אך חזקה לניטור בדיוק וכימות פוטנציאל phagocytic של microglia בסביבה פיזיולוגית.

להערכת תפקוד רשתית microglial Phagocytic<em&gt; In vivo</em&gt; שימוש cytometry זרימה מבוסס Assay

מצב בריאותי של הריאה משתקף על ידי סוג ומספר של תאים חיסוניים הנמצאים bronchioles של הריאה. אנו מתארים טכניקת שטיפה ברונכואלוואלית המאפשרת בידוד ומחקר של תאים לא דליקים וגורמים מסיסים ממערכת הנשימה התחתונה של עכברים.

ברונכאלווולאר של ריאות Murine כדי לנתח דלקת תאים דלקתית

אנו מתארים את הגילוי של הפעלת inflammasome NLRP3 על בסיס הסלולר באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות, צביעת עבור קספאז פעיל-1 ואת המתאם, עולה. Assay שחרורו לקטט דהידרוגנאז מוצג כדי לזהות פירוק pyroptotic על בסיס האוכלוסייה. טכניקות אלו ניתן להתאים ללמוד היבטים רבים של ביולוגיה inflammasome.

זיהוי של Inflammasome ההפעלה ומוות תא Pyroptotic של מקרופאגים הנגזרות מח עצם מאתר

אפופטוזיס יכול להיות מאופיין על ידי ניתוח ציטומטרי זרימה של סמנים ביולוגיים אפופטוטיים מוקדמים ומאוחרים. קו תאי סרטן צוואר הרחם, SiHa, נותח עבור סמנים ביולוגיים אפופטוזיס לאחר טיפול עם Actinomycin D באמצעות ציטומטר זרימה benchtop.

ניתוח ציטומטרי זרימה של סמנים ביולוגיים אפופטוטיים בתאי סרטן צוואר הרחם SiHa שטופלו ב- Actinomycin D

פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה לניתוק כיח למתלה תא בודד ואת האפיון הבא של תת-קבוצות סלולריות בפלטפורמות ציטומטריות סטנדרטיות של זרימה.

ניתוח כיח מבוקר איכות לפי ציטומטריית זרימה

תכולת הידרופרוקסיד שומנים מייצגת את האינדיקטור הנפוץ ביותר למוות של תאים פרופטוטיים. מאמר זה מדגים את ניתוח ציטומטריית הזרימה שלב אחר שלב של תכולת הידרופראוקסיד שומנים בתאים עם השראת פרופטוזיס.

חשיפת הפנוטיפ הפרופטוטי של מדולובלסטומה

למדו לזהות פירופטוזיס בתאים אביאניים באמצעות ציטומטריית זרימה וצביעה כפולה עם נוגדנים ל-chGSDME-NT ויודיד פרופידיום. שיטה זו מאפשרת זיהוי מדויק של תאים פירופטוטיים במחקר ביולוגי.

בדיקת פירופטוזיס על ידי ציטומטריית זרימה

גלה סרטונים נוספים