Name: בידוד נימי רשתית עכבר ומטריצת תת-אנדותל למדידת נוקשות באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: למד בידוד נימי רשתית עכבר ומטריצת תת-אנדותל למדידת נוקשות באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי. שיטה זו מאפשרת חקר תפקיד הנוקשות הווסקולרית בדלקת רשתית סוכרתית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי R01EY028242 המענקים של המכון הלאומי לעיניים / NIH (לק.ג.), מחקר למניעת עיוורון / פרס Catalyst של הקרן הבינלאומית לחקר הרשתית עבור גישות מחקר חדשניות עבור AMD (לק.ג.), יוזמת סטיבן ריאן למחקר מקולרי (RIMR) מענק מיוחד מקרן W.M. Keck (למכון העיניים דוהני), ומלגת אורסולה מנדל ומלגת גיוון של המועצה לתארים מתקדמים של UCLA (ל- I.S.T). עבודה זו נתמכה גם על ידי מענק בלתי מוגבל ממחקר למניעת עיוורון, Inc. למחלקה לרפואת עיניים באוניברסיטת UCLA. התוכן במאמר זה הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.

מדידת נוקשות בנימי הרשתית של העכבר ובמטריצה תת-אנדותל

<ol><li>Duh, E. J., Sun, J. K., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetic+retinopathy%3A+current+understanding%2C+mechanisms%2C+and+treatment+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Diabetic retinopathy: current understanding, mechanisms, and treatment strategies.</a> JCI Insight. 2 (14), e93751(2017).</li>
<li>Roy, S., Kern, T. S., Song, B., Stuebe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+insights+into+pathological+changes+in+the+diabetic+retina%3A+Implications+for+targeting+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Mechanistic insights into pathological changes in the diabetic retina: Implications for targeting diabetic retinopathy.</a> Am J Pathol. 187 (1), 9-19 (2017).</li>
<li>Antonetti, D. A., Silva, P. S., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+understanding+of+the+molecular+and+cellular+pathology+of+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Current understanding of the molecular and cellular pathology of diabetic retinopathy.</a> Nat Rev Endocrinol. 17 (4), 195-206 (2021).</li>
<li>Chandrakumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+regulation+of+retinal+vascular+inflammation+and+degeneration+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Mechanical regulation of retinal vascular inflammation and degeneration in diabetes.</a> Diabetes. 73 (2), 280-291 (2024).</li>
<li>Chandrakumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subendothelial+matrix+stiffening+by+lysyl+oxidase+enhances+RAGE-mediated+retinal+endothelial+activation+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Subendothelial matrix stiffening by lysyl oxidase enhances RAGE-mediated retinal endothelial activation in diabetes.</a> Diabetes. 72 (7), 973-985 (2023).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membrane+stiffening+promotes+retinal+endothelial+activation+associated+with+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Basement membrane stiffening promotes retinal endothelial activation associated with diabetes.</a> FASEB J. 30 (2), 601-611 (2016).</li>
<li>Wolfenson, H., Yang, B., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steps+in+Mechanotransduction+pathways+that+control+cell+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Steps in Mechanotransduction pathways that control cell morphology.</a> Annu Rev Physiol. 81, 585-605 (2019).</li>
<li>Pan, Z., Ghosh, K., Liu, Y., Clark, R. A., Rafailovich, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+stresses+and+translational+distortion+of+the+nucleus+during+fibroblast+migration+on+a+physiologically+relevant+ECM+mimic%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Traction stresses and translational distortion of the nucleus during fibroblast migration on a physiologically relevant ECM mimic.</a> Biophys J. 96 (10), 4286-4298 (2009).</li>
<li>Ghosh, K., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromechanical+control+of+cell+and+tissue+development%3A+implications+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Micromechanical control of cell and tissue development: implications for tissue engineering.</a> Adv Drug Deliv Rev. 59 (13), 1306-1318 (2007).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+cell+and+basement+membrane+architecture+contribute+to+sidestream+smoke-induced+choroidal+endothelial+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Aberrant cell and basement membrane architecture contribute to sidestream smoke-induced choroidal endothelial dysfunction.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (5), 3140-3147 (2014).</li>
<li>Cabrera, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence+increases+choroidal+endothelial+stiffness+and+susceptibility+to+complement+injury%3A+Implications+for+choriocapillaris+loss+in+AMD%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Senescence increases choroidal endothelial stiffness and susceptibility to complement injury: Implications for choriocapillaris loss in AMD.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (14), 5910-5918 (2016).</li>
<li>Cabrera, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+cell+stiffness+contributes+to+complement-mediated+injury+of+choroidal+endothelial+cells+in+a+monkey+model+of+early+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Increased cell stiffness contributes to complement-mediated injury of choroidal endothelial cells in a monkey model of early age-related macular degeneration.</a> J Pathol. 257 (3), 314-326 (2022).</li>
<li>Krieg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy-based+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Phys%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy-based mechanobiology.</a> Nat Rev Phys. 1, 41-57 (2019).</li>
<li>Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin+digest+protocol+to+analyze+the+retinal+vasculature+of+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model.</a> J Vis Exp. (76), e50489(2013).</li>
<li>Beacham, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+extracellular+matrices+produced+by+cultured+and+primary+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of extracellular matrices produced by cultured and primary fibroblasts.</a> Current protocols in cell biology. , vol. Chapter 10 (2007): Unit 10.9 (2007).</li>
<li>Bae, Y. H., Liu, S. L., Byfield, F. J., Janmey, P. A., Assoian, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+stiffness+of+ex+vivo+mouse+aortas+using+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Measuring the stiffness of ex vivo mouse aortas using atomic force microscopy.</a> J Vis Exp. (116), e54630(2016).</li>
<li>Huynh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+intimal+stiffening+enhances+endothelial+permeability+and+leukocyte+transmigration%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Age-related intimal stiffening enhances endothelial permeability and leukocyte transmigration.</a> Sci Transl Med. 3 (112), 112(2011).</li>
<li>Sharma, A., Gupta, D. K., Bisen, S., Singh, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+trypsin+and+elastase+digestion+techniques+for+isolation+of+murine+retinal+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of trypsin and elastase digestion techniques for isolation of murine retinal vasculature.</a> Microvasc Res. 154, 104682(2024).</li>
<li>Chaqour, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy-based+measurements+of+retinal+microvessel+stiffness+in+mice+with+endothelial-specific+deletion+of+CCN1%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy-based measurements of retinal microvessel stiffness in mice with endothelial-specific deletion of CCN1.</a> Methods Mol Biol. 2582, 323-334 (2023).</li>
<li>Ashraf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+density+of+deep%2C+intermediate+and+superficial+vascular+plexuses+are+differentially+affected+by+diabetic+retinopathy+severity%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Vascular density of deep, intermediate and superficial vascular plexuses are differentially affected by diabetic retinopathy severity.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 61 (10), 53(2020).</li>
<li>Monickaraj, F., McGuire, P. G., Nitta, C. F., Ghosh, K., Das, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cathepsin+D%3A+an+Macrophage-derived+factor+mediating+increased+endothelial+cell+permeability+with+implications+for+alteration+of+the+blood-retinal+barrier+in+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Cathepsin D: an Macrophage-derived factor mediating increased endothelial cell permeability with implications for alteration of the blood-retinal barrier in diabetic retinopathy.</a> FASEB J. 30 (4), 1670-1682 (2016).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

AFM נמצא בשימוש נרחב כדי למדוד שינויים הקשורים למחלות בנוקשות של כלי דם גדולים יותר, כגון אבי העורקים ועורקים16. ממצאים אלה סייעו לבסס את תפקידה של מכנוביולוגיה אנדותל בסיבוכים קרדיווסקולריים כגון טרשת עורקים17. בהתבסס על ממצאים אלה, התחלנו לחקור את התפקיד שלא היה מוכר בעבר של מכנוביולוגיה אנדותל בהתפתחות נגעים מיקרו-וסקולריים ברשתית בתחילת DR. הצלחה במרדף זה, עם זאת, מסתמכת על מדידה מדויקת של שינויים הנגרמים על ידי סוכרת בנוקשות נימי הרשתית. מחקרים אחרונים גילו כי בדומה לכלי דם גדולים, קשיחות של נימי רשתית ומטריצת תת-אנדותל המופרשת EC ברשתית ניתנת גם למדידה ישירה, מדויקת ואמינה באמצעות AFM 4,5,6.
גישה זו כוללת בידוד של נימי רשתית עכבר מעיניים מקובעות קלות באמצעות עיכול טריפסין. בהתבסס על ניסיון, שלב קיבוע מתון זה הכרחי מכיוון שנימים שבודדו מעיניים לא מקובעות (בשיטה ההיפוטונית) הם שבירים והופכים מקוטעים, מה שהופך אותם ללא מתאימים למדידת קשיחות AFM4. לעומת זאת, קיבוע חזק יותר והצורך בעיכול טריפסין נרחב, שדווח בפרוטוקול עיכול טריפסין ברשתית18, עלולים גם הם לפגוע בשלמות המבנית של הנימים, כפי שנשפט על ידי הפרעה בצמתים הדוקים. לפיכך, הקיבוע הקל של הנימים ועיכול הטריפסין העדין המשמש כאן מסייעים להפחית את הנוקשות הנובעת מקרוסלינקינג המושרה על ידי פורמלין יתר ולהבטיח את השלמות המבנית של הנימים למדידת קשיחות AFM אמינה.
כגישה חלופית, מחקר שנערך לאחרונה דיווח על מדידת קשיחות AFM של נימי רשתית מתושבות שטוחות רשתית קבועות קלות19. על ידי ביצוע הזחות כוח AFM על נימי הרשתית בתוך הרשתית השלמה, גישה זו מאפשרת מדידת קשיחות באתר . עם זאת, מדידות קשיחות נימיות אלה כוללות ככל הנראה את הנוקשות של הממברנה המגבילה הפנימית. יתר על כן, גישה זו מוגבלת למדידה של נימים שטחיים בלבד הנגישים על תושבת שטוחה ברשתית תוך השמטת מקלעת הנימים העמוקה יותר שמושפעת במיוחד בתחילת DR20. ניתן לטפל בבעיות אלה באמצעות גישה זו, אשר מחלצת כלי דם בצורה נקייה (ללא רקמת רשתית שיורית) מכל שכבות הרשתית. אנו מבצעים כעת אופטימיזציה של פרוטוקול זה כדי לבודד כלי דם כורואידיים ממודלים של בעלי חיים של AMD מוקדם. עם זאת, אנו מבינים שקיבוע הפורמלין הקל המשמש בפרוטוקול עלול לגרום לקשיח הקשור לקרוסלינקינג במדידות AFM. לכן, יהיה זה נבון לפרש את ערכי נוקשות כלי הדם המתקבלים בגישה זו יותר במונחים של שינויים יחסיים בנוקשות (בין קבוצות ניסוי שונות) ולא נוקשות מוחלטת.
בניגוד לנימי רשתית הדורשים קיבוע קל, ניתן להעריך את המטריצה התת-אנדותלית המתקבלת מתרביות EC ברשתית ללא כל שינוי. זאת בעיקר בשל חוסנה של המטריצה השוקעת, הנובע משילוב של מספר גורמים, כולל תוספת של חומצה אסקורבית בתווך התרבית (המשפרת את סינתזת הקולגן15), שינוי כימי של כיסויי זכוכית המונע ניתוק מטריצה במהלך דה-צלולריזציה, ומשך תרבית ממושך (10-15 ימים). חשוב לציין, הראינו כי העלייה הנגרמת על ידי היפרגליקמיה בנוקשות מטריקס תת-אנדותל במבחנה עולה בקנה אחד עם העלייה הנגרמת על ידי סוכרת בנוקשות נימי הרשתית שנצפתה in vivo4. זה לא מפתיע מכיוון שעלייה בנוקשות המטריקס צפויה להגביר את הנוקשות של ECs רשתית (עקב הדדיות מכנית) אשר, יחד, מגבירים את קשיחות הנימים הכוללת. ואכן, לאחרונה הראינו כי ECs ברשתית נעשים נוקשים יותר כאשר הם גדלים בתנאי סוכרת4, ככל הנראה באמצעות עלייה במתח השלד של אקטין תלוי Rho/ROCK21. ממצאים אלה גם מרמזים כי התקשות EC כורואידי שנצפתה במודל קוף רזוס של AMD מוקדם משקפת את הנוקשות המוגברת של מטריצה תת-אנדותל כורואידי וכלי דם שלמים12, רעיון שנבחן במחקרים מתמשכים. בסך הכל, העובדה ששינויים בנוקשות במטריצת הרשתית התת-אנדותל הבלתי קבועה וב-ECs משקפים את המגמה שנצפתה בכלי דם רשתית תקינים קבועים מעט, מעידה על תקפותה של גישת הקיבוע הקל.
מדידת נוקשות ישירה של נימי רשתית ממודלים של DR בבעלי חיים לא רק מסייעת לבסס את מכנוביולוגיה של האנדותל כיעד טיפולי חדשני לניהול DR, אלא היא גם מספקת רציונל חזק לפתח טכניקות הדמיה רגישות חדשות להערכה לא פולשנית של נוקשות נימי הרשתית בחולי DR בעתיד. טכניקות לא פולשניות כאלה עשויות לזהות שינויים עדינים בזרימת הדם שצפויים לנבוע מהתקשות נימית, בדומה לשינויים במהירות גלי הדופק העורקי המתגלים בדרך כלל במחלות לב וכלי דם הנגרמות מסוכרת. מדידות קשיחות AFM של נימי רשתית שבודדו מעיניים אנושיות לאחר המוות מתורמים סוכרתיים יספקו הוכחת היתכנות חשובה בהקשר זה. בהתחשב בכך שקשיחות נימי הרשתית עולה בשלב מוקדם במודל העכבר (סטרפטוזוטוצין) של סוכרת מסוג 14, שימוש מוצלח ב- AFM באימות שיטות הדמיה למדידת נוקשות עשוי להוביל לזיהוי קשיחות נימי הרשתית כסמן ביולוגי קליני לפתוגנזה מוקדמת של DR.

נימי רשתית חיוניים לשמירה על הומאוסטזיס ברשתית ותפקוד הראייה. ואכן, הניוון שלהם בסוכרת מוקדמת מעורב מאוד בהתפתחות סיבוכים מסכני ראייה של רטינופתיה סוכרתית (DR), מצב כלי דם המשפיע על כמעט 40% מכלל האנשים עם סוכרת1. דלקת כלי דם תורמת באופן משמעותי לניוון נימי הרשתית ב- DR. מחקרים קודמים הדגימו תפקיד חשוב לרמזים מולקולריים וביוכימיים חריגים בדלקת כלי דם ברשתיתהנגרמת על ידי סוכרת 2,3. עם זאת, עבודה חדשה הציגה פרדיגמה חדשה לפתוגנזה של DR המזהה התקשות נימי רשתית כגורם מכריע אך לא מוכר בעבר של דלקת כלי דם ברשתית וניוון 4,5,6.
באופן ספציפי, העלייה הנגרמת על ידי סוכרת בנוקשות נימי הרשתית נגרמת על ידי upregulation של אנזים crosslinking קולגן ליזיל אוקסידאז (LOX) בתאי אנדותל רשתית (ECs), אשר מקשיח את המטריצה subendothelial (קרום מרתף)4,5,6. התקשות מטריצה, בתורה, מקשיחה את ECs הרשתית שמעל (עקב הדדיות מכנית), ובכך מובילה לעלייה הכוללת בנוקשות נימי הרשתית4. באופן מכריע, התקשות נימי רשתית זו הנגרמת על ידי סוכרת לבדה יכולה לקדם הפעלת EC ברשתית ומוות EC בתיווך דלקת. ניתן לייחס ויסות מכני זה של פגמים ב- EC ברשתית לשינוי במכנוטרנסדוקציה של האנדותל, התהליך שבו רמזים מכניים מומרים לאותות ביוכימיים כדי לייצר תגובה ביולוגית 7,8,9. חשוב לציין, רמזים מכניים EC משתנים ומבנה מטריצה תת-אנדותל היו מעורבים גם בניוון כלי דם כורואידי הקשור לניוון מקולרי הקשור לגיל מוקדם (AMD)10,11,12, מה שמעיד על ההשלכות הרחבות יותר של מכנוביולוגיה וסקולרית במחלות רשתית ניווניות.
יש לציין כי התקשות נימי הרשתית מתרחשת בשלב מוקדם בסוכרת, אשר עולה בקנה אחד עם הופעת דלקת ברשתית. לפיכך, העלייה בנוקשות נימי הרשתית עשויה לשמש הן כמטרה טיפולית והן כסמן אבחוני מוקדם עבור DR. לשם כך חשוב לקבל מדידות קשיחות אמינות וישירות של נימי הרשתית והמטריצה התת-אנדותלית. ניתן להשיג זאת באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM), המציע טכניקה ייחודית, רגישה, מדויקת ואמינה למדידה ישירה של קשיחות תאים, מטריצה חוץ-תאית ורקמות13. AFM מפעיל כוח הזחה זעיר (ברמת ננו-ניוטון) על הדגימה שקשיחותה קובעת את המידה שבה ה-AFM הנכנס מתכופף - ככל שהדגימה נוקשה יותר, כך הקנטיל מתכופף יותר, ולהיפך. השתמשנו ב-AFM באופן נרחב כדי למדוד את הנוקשות של תאי אנדותל בתרבית, מטריצות תת-אנדותליות ונימי רשתית מבודדיםשל עכבר 4,5,6,11,12. מדידות קשיחות AFM אלה סייעו לזהות מכנוביולוגיה אנדותל כגורם מפתח של פתוגנזה של DR ו- AMD. כדי לעזור להרחיב את היקף המכנוביולוגיה בחקר הראייה, כאן אנו מספקים מדריך שלב אחר שלב על השימוש ב- AFM למדידות קשיחות של נימי רשתית עכבר מבודדים ומטריצת תת-אנדותל.

<table><tbody><tr><td><חזק>בידוד נימי רשתית</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 ומיקרו; m מסנן מזרק PVDF</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGVM33RS</td><td>קושר חלבון נמוך Durapore</td></tr><tr><td>10X Dulbecco פוספט חוצץ מלח ללא % סידן</td><td>% מגנזיום קורנינג</td><td>20-031-CV</td><td>ריכוז סופי 1X, pH 7.4</td></tr><tr><td>צלחת 12 בארות</td><td>פלקון קורנינג</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה 15 מ"ל</td><td>קורנינג</td><td>430791</td><td>ללא רנאז-דנאז, לא פירוגני</td></tr><tr><td>20 מ"ל מזרק Luer-Lok TIP</td><td>BD</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>5 3/4 אינץ' זכוכית בורוסיליקט חד פעמית / פיפטה פסטר לא סטרילית</td><td>FisherBrand</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>60x15 מ"מ צלחת תרבית רקמות</td><td>פלקון קורנינג</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 6 בארות</td><td>פלקון קורנינג</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Aqua-Hold 2 פאפ - 13 מ"ל מעבדת</td><td>מכשירים מדעיים</td><td>עט 9804-02</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק להב</td><td>X-ACTO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פלדת פחמן להב כירורגי #10</td><td>Bard-Parker</td><td>371110</td><td></td></tr><tr><td>שעווה דנטלית</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>50-949-027</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ ניתוח</td><td>תמיסת פורמלין Am-scope</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, ניטרלי חוצץ, 10%</td> <td>Millipore Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td>ריכוז סופי 5% (v/v)</td></tr><tr><td>Kimwipes - רקמת מגב</td><td>Kimtech Science</td><td>34133</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו מרית</td><td>Fine Science</td><td>Tools 10089-11</td><td></td></tr><tr><td>Orbital Shaker</td><td>Lab Genius</td><td>SK-O180</td><td></td></tr><tr><td>PELCO Economy #7 נירוסטה 115 מ"מ&nbsp; פינצטה</td><td>טד פלה, בע"מ</td><td>5667</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ ניגודיות פאזה</td><td>Nikon TS2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מטהר לוגיקה + Class II, סוג A2 ארון בטיחות ביולוגית</td><td>Labconco</td><td>302380001</td><td></td></tr><tr><td>כספת נעילה מיקרוצנטריפוגה צינורות 2 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>22363352</td><td></td></tr><tr><td>סטריאוסקופ</td><td>AmScope</td><td>SM-3 סדרת זום סטריאומיקרוסקופ טרינוקולרי 3.5X-90X</td><td></td></tr><tr><td>שקופית מיקרוסקופיה סופרפרוסט פלוס - לשונית לבנה - ניקוי מראש - 25x75x1.0 מ"מ</td><td>FisherBrand</td><td>1255015</td><td></td></tr><tr><td>Tris Buffer, תמיסת 0.1M, pH 7.4 - דרגת ביוטכנולוגיה</td><td>VWR</td><td>E553-500ML</td><td>pH 8 לתמיסת טריפסין</td></tr><tr><td>טריפסין 1:250 אבקת תרבית רקמות כיתה</td><td>VWR</td><td>VWRV0458-25G</td><td>10% (w/v) תמיסת טריפסין</td></tr><tr><td>מים ביולוגיה מולקולרית כיתה</td><td>קורנינג</td><td>46-000-CM</td><td></td></tr><tr><td><חזקה>מטריצה תת-אנדותלית</חזקה></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X PBS</td><td>קורנינג</td><td>20-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS עם סידן ומגנזיום</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>14040-117</td><td>pH 7.4</td></tr><tr><td>אמוניום הידרוקסיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>338818</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אסקורבית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>קולגן IV נוגדן</td><td>נובוס ביולוגי</td><td>NBP1-26549</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>אתנולמין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>398136</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן פיברונקטין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6140</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount</td><td>Invitrogen-Thermo Fisher Scientific</td><td>00-4958-02</td><td></td></tr><tr><td>ג'לטין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>כיסויי זכוכית (12 מ"מ)</td><td>פישר</td><td>12-541-000</td><td></td></tr><tr><td>גלוטרלדהיד</td><td>מיקרוסקופיה אלקטרונית מדעי</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>תאי אנדותל רשתית אנושיים (HREC)</td><td>Cell Systems Corp</td><td>ACBRI 181</td><td></td></tr><tr><td>MCDB131 בינוני</td><td>קורנינג</td><td>15-100-CV</td><td></td></tr><tr><td>תאי אנדותל רשתית עכבר (mREC)</td><td>Cell Biologics</td><td>C57-6065</td><td></td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>&nbsp; BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין</td><td>גיבקו-תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td><חזק>מדידת AFM </חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ומיקרו; בדיקה m</td><td>Bruker</td><td>SAA-SPH-1UM</td><td>בדיקה חצי כדורית בגובה 19 מיקרון עם רדיוס קצה של 1 מיקרון, קבוע קפיץ 0.25N/m</td></tr><tr><td>70 ננומטר בדיקה LC</td><td>Bruker</td><td>PFQNM-LC-V2</td><td>בדיקה חצי כדורית בגובה 19 מיקרון עם רדיוס קצה של 70 ננומטר, &nbsp; קבוע קפיץ 0.1N/m</td></tr><tr><td>&nbsp; </td><td>מצלמה משפחת XCAM</td><td>Toupcam</td><td>1080P</td></tr><tr><td>HDMI שולחן עבודה להפעלת המצלמה</td><td>Asus</td><td>שולחן עבודה</td><td>מעבד Intel i5-6600 , 8GB</td></tr><tr><td>RAM מחזיק צלחת לכיסוי</td><td>Cellvis</td><td>D29-14-1.5-N</td><td>צלחת תחתונה מזכוכית 29 מ"מ עם &nbsp; מיקרו-באר 14 מ"מ</td></tr><tr><td>Nanowizard 4</td><td>Bruker</td><td>Nanowizard 4</td><td>מיקרוסקופ כוח אטומי Bioscience המותקן על מיקרוסקופ אופטי למדידה רגישה של התכונות המכניות (קשיחות וטופוגרפיה) של דגימות ביולוגיות רכות</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ ניגוד פאזה</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 200</td><td>מיקרוסקופ הפוך עם מטרה פי 10</td></tr></tbody></table>

בידוד נימי רשתית עכבר ומטריצת תת-אנדותל למדידת נוקשות באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

Isolation of Mouse Retinal Capillaries and Subendothelial Matrix for Stiffness Measurement Using Atomic Force Microscopy

ניוון נימי הרשתית הוא סימן היכר קליני של השלבים המוקדמים של רטינופתיה סוכרתית (DR). המחקרים האחרונים שלנו גילו כי התקשות נימי רשתית הנגרמת על ידי סוכרת ממלאת תפקיד סיבתי מכריע שלא היה מוכר בעבר בניוון מתווך דלקת של נימי הרשתית. העלייה בנוקשות נימי הרשתית נובעת מביטוי יתר של ליזיל אוקסידאז, אנזים המצליב ומקשיח את המטריצה התת-אנדותלית. מכיוון שהתמודדות עם DR בשלב מוקדם צפויה למנוע או להאט את התקדמות DR ואובדן ראייה נלווה, מטריצה תת-אנדותלית ונוקשות נימים מייצגים מטרות טיפוליות רלוונטיות וחדשניות לניהול DR מוקדם. יתר על כן, מדידה ישירה של נוקשות נימי הרשתית יכולה לשמש כשלב אימות פרה-קליני מכריע לפיתוח טכניקות הדמיה חדשות להערכה לא פולשנית של נוקשות נימי הרשתית בבעלי חיים ובבני אדם. בהתחשב בהשקפה זו, אנו מספקים כאן פרוטוקול מפורט למדידת בידוד ונוקשות של נימי רשתית עכבר ומטריצת תת-אנדותל באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי.

נימי רשתית עכבר מדידת קשיחות AFM של נימי רשתית מבודדים כוללת שלבי טיפול בדגימה שעלולים לפגוע בשלמותם המכנוסטרוקטורלית. כדי למנוע זאת ובכך להבטיח את ההיתכנות, האמינות והשחזור של מדידות AFM, העיניים המצוירות קבועות ב-5% פורמלין למשך הלילה ב-4°C לפני בידוד כלי הדם. פרוטוקול קיבוע מתון זה עם ריכוז פורמלין מופחת, טמפרטורת קיבוע נמוכה, זמן קיבוע מוגבל וחוסר ניקוב בקרנית פותח כדי למזער כל ממצאים פוטנציאליים של קישור / התקשות הנגרמים על ידי קיבוע כימי. כפי שניתן לראות באיור 2B,C, הקיבוע המתון יחסית הזה מבטיח שכלי הדם ברשתית המבודדים יהיו חזקים מבחינה מבנית ועמידים מספיק למדידת AFM. לעומת זאת, כלי דם ברשתית שבודדו מעיניים לא מקובעות (בשיטה היפוטונית)4 או מעיניים מקובעות לזמן קצר (למשך 8 שעות) מתפצלים או קורסים, מה שהופך אותם ללא מתאימים למדידת AFM (איור 2B).
מטריצה תת-אנדותל ברשתית נוקשות כלי הדם משקפת את הנוקשות המשולבת של תאי כלי הדם וקרום המרתף (מטריצה תת-אנדותלית)4. מאחר שתאים מסתגלים לנוקשות המטריקס על ידי כך שהם עוברים שינוי דומה בנוקשות שלהם, תהליך המכונה הדדיות מכנית9, קשיחות מטריצה תת-אנדותלית, הופך לגורם חשוב בנוקשות כלי הדם הכללית. למדידת קשיחות מטריצה, חשוב לקבל מטריצה תת-אנדותל צפופה הומוגנית. עבור ECs רשתית אנושיים שגדלו בתרבית בתוספת חומצה אסקורבית, זה בדרך כלל לוקח 10-15 ימים (איור 3A)4,5,6. הבדל זה בתקופת התרבית עשוי לנבוע מהבדלים בין הרבה להרבה ב- ECs רשתית ראשוניים הזמינים מסחרית. יתר על כן, אנו מוצאים בדרך כלל כי ECs רשתית זמינים מסחרית מעכברי C57BL/6 מפקידים מטריצה צפופה יותר בהשוואה לתרבית EC רשתית אנושית ראשונית, ובכך מצביעים על הבדלים ספציפיים למין. כפי שניתן לראות באיור 3A, תמונות עם ניגודיות פאזה מספקות רק תצוגה גסה של המטריצה בקנה מידה של מאקרו. אולם המבנה הפיברילרי העדין יותר בקנה מידה ננו-מיקרו מתגלה בתמונות פלואורסצנטיות קונפוקליות ברזולוציה גבוהה של המטריצה המסומנת בנוגדנים כנגד חלבונים מבניים של מטריצות קולגן IV ופיברונקטין (איור 3B). יש לציין כי חלבוני מטריצה אלה מספקים גם רמזים מאלפים לתאי אנדותל על ידי קשירה לקולטני אינטגרין ספציפיים9.
מדידת קשיחות AFM בחירת קשיחות הקפיץ המתאימה (קבוע קפיץ, k) וממד הגשושית חיונית למדידות אמינות ורגישות. יש לבחור פרמטרים אלה כך שיתאימו לנוקשות ולמידות של הדגימה הביולוגית. לאחר התקנת המגן שנבחר על ה-AFM, קרן הלייזר האינפרא-אדומה חייבת להיות ממוקדת בקצה הקנטיליבר, ונקודת הלייזר המוחזרת חייבת להיות ממורכזת בגלאי האור. יישור לייזר זה מבטיח זיהוי מדויק ורגיש של סטיית הקשיחות וכתוצאה מכך מדידת קשיחות. מדידת קשיחות AFM מתחילה כאשר ה-z-piezo מזיז את המזנון אנכית כלפי מטה לכיוון הדגימה. בשלב זה אין סטייה של הקנטיליבר, מה שמייצר קו בסיס שטוח של עקומת הגישה (איור 4A). כאשר הגשושית יוצרת מגע עם הדגימה ונכנסת, הקנטיליבר מתכופף, מה שגורם להסטת לייזר על גלאי האור, המתוארת על ידי הסטייה האנכית של עקומת הגישה. לאחר החלת כוח כניסה מוגדר מראש (כוח נקודת הגדרה) על הדגימה, הקנטיל נסוג למצב ההתחלה (גובה יעד Z) הרחק מהדגימה. עקומת הפסילה המוטה מותאמת לאחר מכן למודל הרץ/סנדון כדי לחשב את מודולוס יאנג (קשיחות) של הדגימה.
ממדידת הזחת הכוח המייצג שמוצגת באיור 4, ברור שעקומות הגישה והנסיגה, המתקבלות מנימי רשתית שבודדו מעכבר סוכרתי (איור 4B), תלולות באופן משמעותי מאלה המתקבלות מעכבר שאינו סוכרתי (איור 4A). השיפוע התלול יותר של עקומות הזחת הכוח מצביע על סטייה גדולה יותר הנגרמת על ידי התנגדות מדגם גבוהה יותר להזחת כוח, המשקפת קשיחות מדגם גבוהה יותר13. ואכן, ניתוח נתונים מאוחר יותר של עקומות הזחת כוח מרובות גילה כי נימי רשתית עכבר הופכים נוקשים יותר באופן משמעותי בסוכרת4. כמו כן, יש לציין כי מגע בין הגשושית לבין דגימות ביולוגיות גורם לעיתים קרובות להידבקות משטח לא ספציפית, מה שמוביל לסטייה שלילית של הקנטיליבר במהלך הנסיגה, כפי שניתן לראות מהארכת עקומת הנסיגה מעבר לקו הבסיס (איור 4B). יתר על כן, דגימות ביולוגיות כמו תאים, מטריקס וכלי דם הן ויסקו-אלסטיות מטבען ולכן עשויות לעבור עיוות קבוע ו / או שינוי בנוקשות לכאורה בעקבות הזחת כוח. אם כן, הדבר יבוא לידי ביטוי בחוסר התאמה של עקומות הגישה והפסילה (היסטרזיס). ואכן, השוואת איור 4A ואיור 4B מאששת את המגמה הצפויה שבה הזחת כוח של נימים רכים יותר בעכברים שאינם סוכרתיים מייצרת היסטרזה גדולה יותר מזו שנצפתה אצל עמיתיהם הנוקשים יותר. כפי שדווח בעבר 5,6, נוקשות (מודולוס יאנג) של מטריצות תת-אנדותל המתקבלות מתרביות EC ברשתית מחושבת גם היא באופן הנ"ל.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66922/66922fig01.jpg"> איור 1: המחשה סכמטית של חתך חתך שנעשה בעין עכבר לצורך בידוד רשתית. באמצעות פינצטה כדי להחזיק את עצב הראייה, אזמל משמש לביצוע חתך מלא אחורי ללימבוס כדי להפריד את רשתית העכבר מן העדשה ואת החדר הקדמי. הקו המקווקו הסגול מראה את מיקום החתך האנכי. סכמה זו צוירה באמצעות תוכנת תמונה ואיור מדעית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66922/66922fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66922/66922fig02.jpg"> איור 2: מיטוב פרוטוקול לבידוד כלי דם שלמים ברשתית עכבר למדידת AFM. (A) התמונה הסטריאוסקופית מראה רשתית שלמה המבודדת מעין עכבר קבועה קלות לפני שלבי הבידוד הנימים. סרגל קנה מידה: 2 מ"מ. (B) תמונות ניגודיות פאזה מייצגת בהגדלה של פי 4 מציגות כלי דם ברשתית של עכבר שהתקבלו בשיטות הבידוד השונות. בהשוואה בין השלמות המבנית והעמידות של כלי הדם המבודדים, נמצא כי עיכול טריפסין של רשתית מעיניים משוקעות בפורמלין 5% למשך 24 שעות ב-4°C (קופסה אדומה) מניב את כלי הדם ברשתית המתאימים ביותר למדידת קשיחות AFM. כלי רשתית שבודדו בשיטה זו הציגו רשת כלי דם ברורה שהתפשטה באופן אחיד לאורך משטח הזכוכית. סרגל קנה מידה: 500 מיקרומטר. (C) תצוגה בהגדלה גבוהה (20x) של רשת נימי רשתית שלמה, בדומה לזו המוצגת ב-(B), מאשרת את השלמות המבנית הגבוהה של נימים המתקבלים מעיניים מקובעות קלות. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. נתון זה שונהמ-4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66922/66922fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66922/66922fig03.jpg"> איור 3: מטריצות דה-תאיות שהתקבלו מתרביות REC ראשוניות של בני אדם ועכברים. (A) תמונות ניגודיות פאזה מייצגות בהגדלה של 20x המציגות אגרגטים של מטריצות תת-אנדותל על כיסויי זכוכית לאחר דה-צלולריזציה של תרביות REC של בני אדם או עכברים בני 10 ימים (10 d) או 15 יום (15 d). סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. (B) תמונות פלואורסצנטיות קונפוקליות מייצגות בהגדלה גבוהה (100x) של מטריצות דה-צלולריות שהתקבלו מתרביות REC אנושיות 15d ומסומנות בנוגדנים אנטי-קולגן IV ואנטי-פיברונקטין חושפות קולגן ננו-פיברילרי צפוף IV ומטריצת פיברונקטין (fibronectin). סרגל קנה מידה: 20 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66922/66922fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66922/66922fig04.jpg"> איור 4: עקומות מרחק כוח ממדידת קשיחות AFM של נימי רשתית עכבר. תרשימים קוויים מציינים גישה מייצגת (צבע בהיר) ועקומת נסיגה (צבע כהה) ממדידת כניסת כוח יחיד במיקום אחד של נימי רשתית עכבר מבודדים מעכבר (A) שאינו סוכרתי או (B) סוכרתי. עקומות הכוח המתקבלות באמצעות גשושית SAA-SPH ברדיוס של 1 מיקרומטר, משרטטות את הקשר בין מרחק דגימת הקנטילבר (נשלט על ידי z-piezo) לבין הכוח האנכי המופעל הגורם להסטת קנטיליבר. (A) החץ הצהוב מציין את התקרבות הקנטיל המונעת על ידי z-piezo לכיוון הדגימה, החץ הלבן מציין את נקודת המגע שבה הגשושית יוצרת מגע עם הדגימה, והחץ הירוק מציין את הסטת הקנטליבר עד לכוח הזחה (שיא) (*). (B) הן עקומות הגישה והן עקומות הנסיגה המתקבלות מנימי רשתית שבודדו מעכברים סוכרתיים מציגות שיפוע תלול במידה ניכרת מאלה של עמיתיהם שאינם סוכרתיים (מוצג ב-A), מה שמצביע על נוקשות נימים גבוהה יותר בעכברים סוכרתיים. ראש החץ מציין ירידה בעקומת הנסיגה מתחת לקו הבסיס, המשקפת את הסטייה השלילית של הגשושית הנגרמת על ידי הידבקות בין הגשושית לדגימה במהלך הכניסה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66922/66922fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

לאחרונה זיהינו התקשות נימי רשתית כפרדיגמה חדשה לתפקוד לקוי של הרשתית הקשור לסוכרת. פרוטוקול זה מפרט את השלבים לבידוד נימי הרשתית של עכבר והמטריצה התת-אנדותלית מתרביות אנדותל ברשתית, ולאחר מכן תיאור של טכניקת מדידת הנוקשות באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי.

Retinal capillary degeneration is a clinical hallmark of the early stages of diabetic retinopathy (DR). Our recent studies have revealed that ...

isolation-mouse-retinal-capillaries-subendothelial-matrix-for

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הנוקשות של מטריקס תאיים משפיעה התנהגויות רבות של תאים חסיד. קשיחות מטריקס משתנה מרחבית ברחבי רקמה, ועוברת שינוי בתנאי מחלה שונים. כאן אנו לפתח שיטות כדי לאפיין שינויים מרחביים קשיחות ברקמה נורמלית fibrotic ריאות עכבר באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי microindentation.

מיקרו מכונות אפיון רקמת הריאה באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

מסמך זה מדגים פרוטוקול כדי לאפיין את התכונות מכאניות של תאי חיים באמצעות microindentation באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM).

מדידת התכונות המכאניות של תאי חיים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים לבידוד אבי העורקים מעכבר ומדידת המודול האלסטי שלהם באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי.

מדידת הקשיחות של<em&gt; Ex Vivo</em&gt; עכבר Aortas באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

אנו מציגים שיטה לחקור שינויים אוסטאופתית מוקדם ברמה התאית בסחוס הפרקולריות באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM).

יישום של מיקרוסקופ כוח אטומי כדי לזהות אוסטיאוארתריטיס מוקדם

אנו מציגים פרוטוקול למדידת המודולי האלסטי של אזורים עשירים בקולגן בכבד רגיל וחולה באמצעות מיקרוסקופיה של כוח אטומי. השימוש בו זמנית במיקרוסקופיית קיטוב מספק דיוק מרחבי גבוה ללוקליזציה של אזורים עשירים בקולגן במקטעי הכבד.

מדידת נוקשות הכבד באמצעות מיקרוסקופיה של כוח אטומי בשילוב עם מיקרוסקופיית קיטוב

מאמר זה נועד להדריך את הקורא בפעולה של כוח אטומי משולב אופטי מיקרוסקופ הדמיה לגירוי מכני של תאים חיים בתרבות. פרוטוקול צעד אחר צעד מוצג. נתונים נציג קבוצה שמראה תא חי בתגובה לגירוי מכני מוצג.

תגובת תא חי כדי גירוי מכני שנלמדה על ידי מיקרוסקופית כוח משולב אופטי אטומית

ההשפעה של קשיחות מתחת לקרקע על התפקוד התאי יכול להיות...

שיחקרו את ההשפעות של מטריקס נוקשות על פונקציה נייד באמצעות Acrylamide מבוססי הידרוג

בסרטון זה נדגים כיצד לבודד בתאי גזע הרשתית מן אפיתל ריסי העין העכבר לגדל אותם בתרבית כדי ליצור כדורים רשתית משובט. התחומים כי הם מבודדים להחזיק את המאפיינים העיקריים של בתאי גזע: התחדשות עצמית multipotentiality.

בידוד של גזע תאים רשתית העין של העכבר

ההחזקה של virions על פני השטח היא דרישה להדמיית virion יחיד על ידי הדמיית פלואורסצנטיות ברזולוציה סופר או מיקרוסקופיה כוח אטומי (AFM). כאן אנו מדגימים שיטת הכנה לדוגמה להדבקה מבוקרת של virions למשטחי זכוכית המתאימים לשימוש AFM והדמיה פלואורסצנטית ברזולוציה סופר.

הכנה לדוגמה למיקרוסקופיה של כוח אטומי של Virion יחיד והדמיית פלואורסצנטיות ברזולוציה גבוהה במיוחד

כאן, אנו מציגים עבור בידודו של שלמה, שלמה עכבר פרוטוקול עטין לחקור מורפולוגיה ductal וביטוי מטריצה חוץ-תאית (ECM). בלוטות בטן העכבר #4 היו מופק עכברים nulliparous נקבה שבוע 8-10, קבוע בפורמלין במאגר נייטרלי, למחלקה והמוכתמות בעזרת אימונוהיסטוכימיה ECM חלבונים.

בידוד של בלוטות מוגדלות ללא פגע, כל עכבר לניתוח של בלוטת מורפולוגיה וביטוי מטריצה חוץ-תאית

למד בידוד נימי רשתית עכבר ומטריצת תת-אנדותל למדידת נוקשות באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי. שיטה זו מאפשרת חקר תפקיד הנוקשות הווסקולרית בדלקת רשתית סוכרתית.

בידוד נימי רשתית עכבר ומטריצת תת-אנדותל למדידת נוקשות באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

גלה סרטונים נוספים