Name: מיצוי RNA חד-חיה יחיד להשוואה של רמות תעתיק יחסיות באמצעות qRT-PCR בטרדיגראד Hypsibius exemplaris (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: למד שיטה מהירה למיצוי RNA מטרדיגרד בודד Hypsibius exemplaris לניתוח ביטוי גנים ב-qRT-PCR. הפרוטוקול משפר את היעילות פי 200 ומאפשר מחקר מולקולרי מדויק של נוירו-עמידות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66935/66935fig01.jpg"> 
איור 1: צינור חד-שפופרת עבור מיצוי RNA מטרדיגראד יחיד. (A) סכמה המציגה את הפרוטוקול עבור מיצוי RNA מטרדיגראד יחיד, כולל שישה מחזורי הקפאה-הפשרה וסינתזת cDNA לאחר מכן. לאחר מכן ניתן להשתמש בדגימות עבור RT-PCR ו-qRT-PCR. (B) תמונה של מיקרו-פיפטה מתחדדת המשמשת לסילוק מים. סרגל קנה מידה: 2 מ"מ. (C) תמונת שדה בהיר של טרדיגראד בנפח קטן של מים (קו מקווקו). הסרת רוב המים במידה המוצגת נדרשת למיצוי מוצלח ומונעת דילול של מאגר הליזיס. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. (D) תמונה שמראה טבילה של דגימות בחנקן נוזלי באמצעות מלקחיים ארוכים כדי להקפיא ולהפשיר במהירות את הדגימות בבטחה. חלק מהתוכן נוצר ב-BioRender. קירק, מ. (2022) BioRender.com/d93s511 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66935/66935fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
הערה: איור 1A מציג סכימה של ההליך. לנהלים מפורטים של טרדיגראד ותרבות אצות, עיין בדוחות שפורסמו בעבר 45,46,47.
1. עיקור מי מעיין
<ol>
	<li>יוצקים 2 ליטר מי מעיין מכד מים בנפח 5 ליטר (ראה טבלת חומרים לפרטים) לבקבוק זכוכית 2 ליטר בטוח לחיטוי.</li>
	<li>הניחו את הפקק על הבקבוק הבטוח לחיטוי ואטמו עם כמות קטנה של סרט חיטוי. אין להדק את הבקבוק; הניחו את הכובע מעל.</li>
	<li>חיטוי מי המעיין למשך 50 דקות במחזור רטוב ללא שלב ייבוש.</li>
	<li>הניחו למים להגיע לטמפרטורת החדר (RT), ואטמו היטב את המכסה לפני אחסונם ב-RT.</li>
</ol>
2. משיכת מיקרופיפטה מזכוכית (עם מושך פיפטה)
<ol>
	<li>אבטח מיקרופיפטה מזכוכית (OD: 1 מ"מ, תעודת זהות: 0.58 מ"מ, אורך: 10 ס"מ) על חולץ מיקרופיפטה. הימנע ממגע עם חוט החימום, מכיוון שהדבר ישנה את צורת הפיפטה ויפגע בחוט.<ol>
		<li>קבע את משיכת הפיפטה באופן אמפירי עבור כל חוט נימה ומושך פיפטה. עם זאת, כדי לשמש כנקודת התחלה לאופטימיזציה, השתמש ב-78 מעלות צלזיוס ובצעד משיכה יחיד של משקל משיכה של 182.2 גרם.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>אפשרו לחוט להתחמם וכוח הכבידה להפריד את המיקרופיפטה מזכוכית לשתי מיקרופיפטות זכוכית עם נקודות חדות (איור 1B).</li>
	<li>אחסן את המיקרופיפטות הזכוכית המשוכות הללו בצלחת פטרי סגורה בגודל 100 מ"מ עם שעווה או חימר כדי להחזיק אותן במקומם ולמנוע מהקצוות החדים להישבר.</li>
</ol>
3. משיכת מיקרופיפטה מזכוכית (ללא מושך פיפטה)
<ol>
	<li>הדליקו מבער Bunsen או מקור להבה מבוקר אחר על הגדרה נמוכה.</li>
	<li>קח מיקרופיפטה מזכוכית עם קצה אחד בכל יד.</li>
	<li>החזק את מרכז המיקרופיפטה מזכוכית מעל הלהבה עד שהכוס מתחילה להימס. לאחר מכן, משוך במהירות את שני הקצוות זה מזה. זה ייצור שני טיפים חדים עדינים מאוד.</li>
	<li>שוברים קלות את הקצה בעזרת זוג מלקחיים עדינים סטריליים.</li>
	<li>אחסן את המיקרופיפטות הזכוכית המשוכות הללו בצלחת פטרי סגורה בגודל 100 מ"מ עם שעווה או חימר כדי להחזיק אותן במקומם ולמנוע מהקצוות החדים להישבר.</li>
</ol>
4. מיצוי RNA
<ol>
	<li>השג 0.5 ליטר חנקן נוזלי במיכל בטוח לקריו. זהירות: חנקן נוזלי הוא קריוגני ועלול לגרום לכוויות אם הוא נחשף לעור או לעיניים. בעת הטיפול, השתמש בביגוד מגן, משקפי התזה, כפפות ניטריל, כפפות קריו, מעיל מעבדה ונעליים סגורות. ודא שהמיכל בטוח לחנקן נוזלי לפני הובלת הנוזל. שימוש באמבטיית קרח יבש באתנול לשלב זה עשוי להיות אפשרי גם כן.</li>
	<li>הכינו תערובת מאסטר לסינתזת cDNA: תמיסה של 10 מיקרוליטר המכילה 1 מיקרוליטר של פריימר הקסמר אקראי, 2 מיקרוליטר של DNase, 4 מיקרוליטר של מאגר 5x RT, 1 מיקרוליטר תערובת אנזימים, 1 מיקרוליטר של H2O ו-1 מיקרוליטר של 10 מ"מ dNTPs. אחסן תמיסה זו על קרח.</li>
	<li>הכן מאגר ליזה טרדיגרד (5 מ"מ טריס (pH = 8), 0.5% (v/v) חומר ניקוי 1, 0.5% (v/v) חומר ניקוי 2, 0.25 מ"מ EDTA במים סטריליים ללא נוקלאז). הערה: ניתן לאחסן תמיסה זו על הספסל למשך 6 חודשים. עם זאת, שמור על סטריליות והימנע ממקורות מזהמים RNAse פוטנציאליים.</li>
	<li>יש מספיק מאגר ליזה למיצויים (2 מיקרוליטר / טרדיגראד).</li>
	<li>הוסף מעכב RNAse לתמיסת מאגר הליזיס של טרדיגרד לריכוז סופי של 4 U/μL.</li>
	<li>מערבולת וסובב את התמיסה ב-RT על צנטריפוגה על ספסל במהירות של 2000 x g למשך 5 שניות לפני אחסון התמיסה על קרח.</li>
	<li>הסר כמה טרדיגרדים הדרושים לניסוי מהתרבית באמצעות פיפטה P1000 סטרילית עם קצה מסנן והנח אותם בצלחת פטרי סטרילית 35 מ"מ. הערה: ניתן לעבד כל מספר של טרדיגרדים בדרך זו. בדרך כלל, שלושה טרדיגרדים לכל מצב מעובדים למיצוי.</li>
	<li>שטפו את הטרדיגרדים שלוש פעמים, באמצעות 1 מ"ל של מי מעיין סטריליים שעברו חיטוי ופיפטה P1000 סטרילית עם קצה מסנן. פיפטינג איטי שלהם למעלה ולמטה עוזר להסיר מזהמי אצות.</li>
	<li>באמצעות מיקרוסקופ מנתח בהגדלה של פי 25 עד פי 50, העבירו טרדיגראד בודד מתרבית שטיפה זו לצלחת פטרי סטרילית חדשה בגודל 35 מ"מ באמצעות פיפטה P10 סטרילית עם קצה מסנן.</li>
	<li>השתמש בפיפטה P200 סטרילית עם קצה מסנן כדי לשטוף את הטרדיגראד הבודד ב-100 מיקרוליטר של מים סטריליים נטולי נוקלאז. הערה: שלב כביסה זה משמש להסרה נוספת של מזהמים, כולל ריבונוקלאזים.</li>
	<li>העבירו את הטרדיגרד השטוף לתחתית צינור PCR נקי וסטרילי ב-1-2 מיקרוליטר של מים סטריליים נטולי נוקלאז באמצעות פיפטת P10 סטרילית עם קצה מסנן, תוך הקפדה על כך שהטרדיגראד לא נדבק לצד הקצה.</li>
	<li>דמיין את הטרדיגראד תחת מיקרוסקופ מנתח בהגדלה של פי 25.</li>
	<li>כדי להקל על פינוי מים של מים, שברו קלות את קצה המיקרופיפטה הזכוכית הנמשכת מחוץ לצינור. ודא שהקדח גדול מספיק כדי למשוך את המים אך לא את הטרדיגראד.</li>
	<li>באמצעות פעולה נימית של מיקרופיפטת זכוכית משוכה, הסר מים עד שהחיה מוקפת בבועת מים קטנה בקוטר של כשני אורכי טרדיגראד.</li>
	<li>עקוב אחר תהליך פינוי המים באמצעות היקף החיתוך כדי לוודא שמפלס המים מתאים והטרדיגראד נשאר לחות. הערה: איור 1C מציע דוגמה לכמות המים שיש להסיר. זהו צעד קריטי. בועת מים קטנה תקיף את הטרדיגראד כדי למנוע את התייבשותו, אך יש להסיר כמה שיותר עודפי מים כדי למנוע דילול של מאגר הליזיס. לדוגמא של מפלסי המים הנותרים, עיין באיור 1C.</li>
	<li>מיד לאחר הסרת המים, הוסף 2 מיקרוליטר של מאגר ליזה טרדיגרד לתחתית הצינור, מערבולת קצרה, וצנטריפוגה את הצינור ב-RT למשך 5 שניות ב-2000 x גרם על צנטריפוגה על השולחן.</li>
	<li>הנח מיד את הדגימות המכילות את הטרדיגרדים לתוך מתלה צינור PCR וודא שהן מוחזקות היטב על ידי המתלה.</li>
	<li>אחזו במדף באמצעות זוג מלקחיים ארוכים וגסים וטבלו בעדינות את המדף המכיל את הדגימות לתוך החנקן הנוזלי עד להקפאה מלאה (איור 1D).</li>
	<li>הסר את המתלה מהחנקן הנוזלי והניח אותו מיד על קרח. אפשר לדגימה להפשיר (לוקח ~45 שניות עד דקה אחת). עקוב אחר הדגימה כל 15 שניות על ידי הוצאתה מהקרח ובדיקתה באופן גלוי. לאחר שהדגימה שקופה לעין, עברו לשלב הבא.</li>
	<li>חזור על שלבים 4.18-4.19 חמש פעמים נוספות. בסך הכל נדרשים שישה מחזורי הקפאה-הפשרה לליזה ומיצוי מקסימליים (איור 2A,B).</li>
	<li>לאחר השלמת ההקפאה-הפשרה, הניחו דגימות על קרח והתקדמו מיד לשלב הבא. אין להקפיא את הדגימות בשלב זה לאחסון, מכיוון שהדבר יפחית את ה-RNA הזמין להכנת cDNA.</li>
</ol>
5. סינתזת cDNA
<ol>
	<li>הוסף 2 מיקרוליטר של תערובת מאסטר לסינתזת cDNA לצינור ה-PCR המכיל ליזאט טרדיגראד. העבירו בקצרה את הצינור וסובבו אותו ב-RT ב-2000 x גרם למשך 5 שניות עם צנטריפוגה שולחנית לפני החלפת הדגימות על קרח.</li>
	<li>מניחים את הדגימות בתרמו-סייקלר ודוגרים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לחסל פריימרים, בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לביצוע שעתוק הפוך, ולבסוף, אנזימים משביתי חום בטמפרטורה של 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.</li>
	<li>לאחר הדגירה, הניחו מיד את הצינור על קרח ודללו את הדגימה לנפח כולל של 25 מיקרוליטר על ידי הוספת 21 מיקרוליטר של מים סטריליים ללא נוקלאז. עבור תמלילים עם מספר עותק נמוך, שנה את שלב הדילול הזה כפי שנקבע אמפירית.</li>
</ol>
6. qPCR
<ol>
	<li>קבע את טמפרטורת החישול של ערכת הפריימר באמצעות סך ה-RNA שהוכן מכמויות גדולות יותר של טרדיגרדים, למשל, שיטת המיצוי בתפזורת שהוצגה ב-Boothby, 201843.</li>
	<li>הפעל שיפוע טמפרטורת PCR כדי לקבוע את טמפרטורת החישול האופטימלית לפני הפעלת qRT-PCR (עבור כל הגדרות ה-PCR המשמשות בפרוטוקול זה, עיין בטבלה 1 ובטבלה 2).</li>
	<li>להפשיר צינור אחד של צבע מחוון סופר לערבב על קרח ולבודד מהאור. הניחו צלחת qPCR של 96 בארות על קרח והניחו 5 מיקרוליטר של תערובת סופר, 2 מיקרוליטר מים, 1 מיקרוליטר מכל פריימר (10 מיקרומטר) ו-1 מיקרוליטר של תוצר cDNA במספר הבארות הרצויות.</li>
	<li>אטום את לוחית ה-PCR עם אטם צלחת והפעל את ה-qRT-PCR באמצעות טמפרטורת חישול המתאימה לערכת הפריימר (לכל הגדרות qRT-PCR המשמשות במאמר זה, עיין בטבלה 3).</li>
</ol>
7. כימות ופרשנות תוצאות
<ol>
	<li>השווה את התוצאות כמותית לגן ביקורת אחד או יותר, שביטויו צפוי להיות קבוע בתנאים שנכפו. במחקר זה נעשה שימוש בגן האקטין.</li>
	<li>השג והשווה את ערכי Ct או סף המחזור עבור כל באר לערכי Ct של תגובות הגן של משק הבית הבקרה. חשב את שינוי הקיפול בביטוי הגנים באמצעות המשוואה הבאה: 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66935/66935eq01.jpg" style="margin: auto;"> 
	<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66935/66935eq02.jpg" style="margin: auto;"> 
	<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/66935/66935eq03.jpg" style="margin: auto;"> הערה: ביטוי גן קיפול משורטט עבור כל תעתיק וטרדיגראד כ-2-(ΔΔCt)48.</li>
	<li>כדי לקבל הערכה גסה של מספר התעתיק מערךC t, השתמש במשוואה הבאה: 
	<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/66935/66935eq04.jpg" style="margin: auto;"> כאשר N הוא מספר התעתיקים, ו-2 הוא יעילות ה-PCR המשוערת או עליית הקיפול בקרינה למחזור של PCR48.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>מיצוי RNA אופטימלי עבור qRT-PCR בטרדיגראדים בודדים

<table><tbody><tr><td>10 ומיקרו; L טיפים מחסום פרימיום כריכה נמוכה, מתלה, סטרילי</td><td>Genesee Scientific</td><td>23-401</td><td>מתייחס כ-Sterile Filter-tippped P 10 Pipette&nbsp; טיפים</td></tr><tr><td>1000 ומיקרו; L&nbsp; טיפים לפיפט פרימיום, כריכה נמוכה, מתלה, סטרילי</td><td>Genesee Scientific</td><td>23-165RS</td><td>מתייחס כ-Sterile Filter-tippped P 1000 Pipette&nbsp; טיפים</td></tr><tr><td>200 ומיקרו; L&nbsp; טיפים מחסום פרימיום כריכה נמוכה, מתלה, סטרילי</td><td>Genesee Scientific</td><td>23-412</td><td>מתייחס כ-Sterile Filter-tippped P 200 Pipette&nbsp; טיפים</td></tr><tr><td>4 כוכבים ישר פינצטה חזקה בינונית&nbsp;</td><td>אקסלטה&nbsp;</td><td>00-SA-DC</td><td>מתייחס כמלקחיים ארוכים</td></tr><tr><td>מתלה PCR 96 בארות עם מכסה מגוון, 5 מתלים / יחידה</td><td>Genesee Scientific</td><td>27-202A</td><td>מתייחס כמתלה PCR</td></tr><tr><td>Andwin Scientific&nbsp; סרט חיטוי נטול עופרת 3M 1 אינץ'</td> <td>תרמו פישר מדעי&nbsp;</td><td>NC0802040</td><td>מתייחסים לקלטת חיטוי&nbsp;</td></tr><tr><td>קלטת חיטוי</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>AB1170</td><td>מתייחס כאטמי צלחת PCR</td></tr><tr><td>ספסל v8</td><td>ספסל</td><td>N/A</td><td>מתייחס כספסל &nbsp;</td></tr><tr><td>BioRadShell קשיח 96 בארות PCR לוחית</td><td>BioRad&nbsp;</td><td>HSS9641</td><td>מתייחס כלוחית PCR&nbsp;</td></tr><tr><td>מעיל מעבדה BULWARK FR:&nbsp;</td><td>גריינג'ר&nbsp;</td><td>26CF64</td><td>מתייחס למעיל מעבדה</td></tr><tr><td>C1000 Touch Bio-rad Thermocycler&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1851148</td><td>מכונה Thermocycler&nbsp;</td></tr><tr><td>C1000 Touch Bio-rad Thermocycler עם מודול אופטיקה CFX&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1845097</td><td>מתייחס ל-qPCR thermocycler&nbsp;</td></tr><tr><td>כלורוקוקום היפנוספורום.&nbsp; &nbsp;</td><td>קרולינה</td><td>152091</td><td>מתייחסת כאל אצות</td></tr><tr><td>קורנינג&nbsp; בקבוקי אחסון מדיה לשימוש חוזר PYREX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>06-414-1E</td><td>מתייחסים כבקבוקי זכוכית 2 ליטר בטוחים לחיטוי</td></tr><tr><td>Daigger & מערבל מעבדה Vortex-Genie 2 של החברה&nbsp;</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td>3030A</td><td>מתייחס ל-Vortexer&nbsp;</td></tr><tr><td>דיירקט-זול מיקרו פרפ&nbsp;</td><td>Zymo מחקר&nbsp;</td><td>R2060</td><td>מתייחס לערכת מיצוי RNA&nbsp;</td></tr><tr><td>Dumont 5 ביולוגיה פינצטה</td><td>כלים מדעיים משובחים&nbsp;</td><td>11254-20</td><td>מתייחס כמלקחיים עדינים</td></tr><tr><td>EDTA&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S311-500&nbsp;</td><td>מתייחס כ-EDTA&nbsp;</td></tr><tr><td>פיג'י נגד 2.14.0/1.54f&nbsp;</td><td>ImageJ,N</td><td>/A</td><td>מתייחס כ-FIJI/ImageJ</td></tr><tr><td>נימה עבור חולץ פיפטה&nbsp;</td><td>Tritech Research</td><td>PC-10H</td><td>מתייחס כחוט נימה</td></tr><tr><td>פישרברנד כלכלה משקפי</td> השפעה <td>פישר סיינטיפיק</td><td>19-181-501</td><td>מתייחס כמשקפי ספלאש&nbsp;</td></tr><tr><td>מיקרופיפטה זכוכית 1 מ"מ קוטר פנימי 0.58, אורך 10 ס"מ</td><td>TriTech Research</td><td>GD-1&nbsp;</td><td>מתייחס כמיקרופיפטה מזכוכית</td></tr><tr><td>Hypsibius exemplaris Z151 Strain&nbsp;</td><td>קרולינה</td><td>133960</td><td>מתייחס ל-Tardigrades&nbsp; או H. exemplaris&nbsp;</td></tr><tr><td>חנקן נוזלי Dewar 1 ליטר</td><td>אגר מדעי&nbsp;</td><td>AGB7475</td><td>מתייחס למיכל בטוח לקריו&nbsp;</td></tr><tr><td>מקסימה H מינוס ערכת סינתזת cDNA גדיל ראשון&nbsp;</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>K1651</td><td>מתייחס ל-cDNA Synthesis Master Mix&nbsp;</td></tr><tr><td>Narishige דו-שלבי זכוכית Micropipette Puller&nbsp;</td><td>מחקר טריטק</td><td>&nbsp; PC-10</td><td>מתייחס לחולץ מיקרופיפטה&nbsp;</td></tr><tr><td>כפפות ניטריל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>17-000-314</td><td>מתייחס לכפפות ניטריל&nbsp;</td></tr><tr><td>צלחת פטרי, PS, 35/10 מ"מ, עם פתחי אוורור</td><td>גרנייה</td><td>627102</td><td>מתייחס לצלחת פטרי 35 מ"מ&nbsp;</td></tr><tr><td>פיפטמן P10, 1&ndash; 10 ומיקרו; L, מפלט מתכת</td><td>Gilson</td><td>F144055M</td><td>מתייחס כ-P 10 Pipette</td></tr><tr><td>PIPETMAN P1000, 100&ndash; 1000 ומיקרו; L, מפלט מתכת</td><td>גילסון</td><td>F144059M</td><td>מתייחס כ-P 1000 פיפטה</td></tr><tr><td>PIPETMAN P200, 20&ndash; 200 ומיקרו; L, מפלט מתכת</td><td>Gilson&nbsp;</td><td>F144058M</td><td>מתייחס כ- P 200 פיפטה</td></tr><tr><td>פאונד חימר דוגמנות 4 צבעים זה&nbsp;</td><td>עודף מדע אמריקאי</td><td>&nbsp; 96517P001</td><td>מתייחס כ-Clay&nbsp;</td></tr><tr><td>פריזמה v10.0&nbsp;</td><td>GraphPad</td><td>N/A</td><td>מתייחס לפריזמה&nbsp;</td></tr><tr><td>ללא RNAse, 8 רצועות 0.2 מ"ל צינורות PCR עם כובעים&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>AM12230</td><td>מתייחס כצינור PCR סטרילי</td></tr><tr><td>RNasin Ribonuclease מעכב</td><td>Promega&nbsp;</td><td>N2111</td><td>מתייחס כמעכב RNAse&nbsp;</td></tr><tr><td>מי מעיינות&nbsp;</td><td>נסטלה Pure Life</td><td>44221229</td><td>מתייחס כמי מעיין</td></tr><tr><td>SsoAdvanced אוניברסלי SYBR ירוק סופרמיקס</td><td>BIO RAD</td><td>1725271</td><td>מתייחס כמחוון צבע סופר מיקס&nbsp;</td></tr><tr><td>מערכת סטריאו-מיקרוסקופ עם אופטיקה ותאורה&nbsp;</td><td>TriTech Research</td><td>SMT1</td><td>מתייחס למיקרוסקופ מנתח</td></tr><tr><td>Supertek Scientific&nbsp; מבערי טיריל</td><td>תרמו פישר S09572B מדעי</td><td></td><td>מתייחס כמבער בונסן &nbsp;</td></tr><tr><td>צנטריפוגה שולחנית</td><td>Qualitron</td><td>&nbsp; DW-41-115-NEW</td><td>מתייחס כצנטריפוגה שולחנית&nbsp;</td></tr><tr><td>טמפשילד&nbsp; כפפות קריו</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>11-394-305</td><td>מתייחס לכפפות קריו&nbsp;</td></tr><tr><td>תרמו סיינטיפיק&nbsp; Nunc Petri</td><td>Dishes Thermo Fisher Scientific</td><td>08-757-099</td><td>מתייחס כצלחת פטרי 100 מ"מ&nbsp;</td></tr><tr><td>טריס בייס</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>T395-500&nbsp;</td><td>מתייחס ל-Tris או Tris Base&nbsp;</td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>פלוקה&nbsp;</td><td>93443</td><td>מתייחס כחומר ניקוי 1&nbsp;</td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P1379-500&nbsp;</td><td>מתייחס כחומר ניקוי 2</td></tr><tr><td>מים - מאושר על ידי PCR/RT-PCR, ללא נוקלאז</td><td>Growcells</td><td>PCPW-0500</td><td>המכונה מים סטריליים ללא נוקלאז</td></tr></tbody></table>

מיצוי rna חד-חיה יחיד להשוואה של רמות תעתיק יחסיות באמצעות qrt-pcr בטרדיגראד hypsibius exemplaris

Single-Animal, Single-Tube RNA Extraction for Comparison of Relative Transcript Levels via qRT-PCR in the Tardigrade Hypsibius exemplaris

פיתוח ואופטימיזציה של מיצוי RNA סינגל-טרדיגראד תוך התאמת הפרוטוקול מ-Ly et al., 201542 עבור מיצוי RNA בטרדיגראדים, מערכת STST ממוטבת כדי למקסם את כמות ואיכות התכשיר (איור 1A). RT-PCR בוצע עבור תמלילי אקטין, וכימת תפוקת התעתיק על ידי הגברת אזור של 527 bp המשתרע על פני אקסונים 1 ו-2 (ניתן למצוא רצפים עבור פריימרים אלה בטבלה 1). הצפיפות האופטית של פס האקטין הצפוי כומתה כעוצמת הקרינה עם ImageJ/FIJI. כל אזורי העניין שכומתו היו בגודל שטח...

מיצוי RNA חד-חיה יחיד להשוואה של רמות תעתיק יחסיות באמצעות qRT-PCR בטרדיגראד Hypsibius exemplaris

The tardigrade Hypsibius exemplaris is an emerging model organism renowned for its ability to survive environmental extremes. To explore the molecular ...

single-animal-single-tube-rna-extraction-for-comparison-relative

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שרירי התעופה של דרוזופילה משמשים כמערכת מודל להתפתחות שרירים ופיזיולוגיה. סרטון זה מתאר את שרירי התעופה של מבוגרים ומדגיש פרוטוקול לניתוח שרירי טיסה עקיפים מתפתחים המתאימים לריצוף RNA מגלמים.

דרוזופילה דיסקציה מאוחרת של שריר התעופה העקיפה של הגלמים (IFM): שיטה לאיסוף רקמות בתפוקה גבוהה

Microdissection כבר מועסק באופן נרחב לבדיקה של DNA, RNA וחלבונים בתוך רקמה. לייזר מיקרוסקופית הלכידה (LCM) הוא השיטה הנפוצה ביותר, אך טכניקה חדשה כרסום, mesodissection, זמינה לאחרונה. אנו מדגימים מיצוי RNA מפרפין פורמלין mesodissected הקבוע שקופיות רקמות גלומות של גרנולומות חפת Mycobacterium.

גישה החדשנית Microdissection לשחזור<em&gt; חפת Mycobacterium</em&gt; תמלילים ספציפיים מפרפין קבוע פורמלין משובץ ריאות גרנולומות

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) מסוגל ללכוד תרגום ספציפי לסוג התא של mRNA. כאן אנו מדווחים על פרוטוקול TRAP הראשון המוקדש לבידוד mRNA באוכלוסיות תאים נדירות של עוברי דרוזופילה.

מלכודת RC, תרגום ריבוזום זיקה טיהור מאוכלוסיות תאים נדירות של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

מסופק פרוטוקול לכימות גנים ותעתיקים של חיידקים 16S rRNA ממשקעי חוף באמצעות PCR בזמן אמת. המתודולוגיה כוללת מיצוי משותף של DNA ו-RNA; הכנת RNA נטול DNA; וכימות גן rRNA 16S וכימות תעתיק באמצעות RT-q-PCR, כולל בניית עקומה סטנדרטית.

הפקת DNA-RNA סימולטני החוף משקעים וכימות של 16S rRNA גנים תעתיקי ידי בזמן אמת PCR

זיהום במהלך רצף גנומית של אורגניזמים מיקרוסקופיים עדיין בעיה גדולה. כאן, אנו מראים שיטה רצף הגנום של דובוני מים מן להצטננות עם עמוד 50 קטנה כמו של ה-DNA גנומי ללא הגברה הגנום כולו כדי למזער את הסיכון של זיהום.

הגנום קלט ultralow רצף ספריית הכנה מ להצטננות Tardigrade

פרוטוקול זה מתאר את השלבים הקריטיים של אמצעי הזהירות הנדרשים לביצוע תגובת שרשרת של פולימראז שעתוק במהופך מולטיפלקס תא בודד לאחר תיקון-קלאמפ. טכניקה זו היא שיטה פשוטה ויעילה כדי לנתח את פרופיל ביטוי של קבוצת גנים מתא יחיד מאופיין על ידי תיקון-קלאמפ הקלטות מראש.

תגובת שרשרת של פולימראז מולטיפלקס שעתוק במהופך תא בודד לאחר תיקון-קלאמפ

כאן, אנו מציגים עבור בידודו של RNA DNA, חלבונים מדגם זהה, פרוטוקול, במאמץ להפחית את הווריאציה לשפר הפארמצבטית, להקל על פרשנויות.

משולב נוקלאוטיד שיחולץ חלבון ב Caenorhabditis elegans

פרוטוקול זה מתאר יעיל באתר היברידיזציה באתרו כדי לזהות את רמות ביטוי mRNA ודפוסי מרחבית של גנים היעד בנוזל הסיפונקולוס nuomic .

באתרו היברידיזציה עבור סיפונקולוס נודוס מנוזל קואוממית

במאמר זה פרוטוקול תפוקה גבוהה עבור קביעה מהירה ואמינה של רמות ביטוי גנים בדגימות C. elegans יחיד או בתפזורת מתואר. פרוטוקול זה אינו דורש בידוד RNA ומייצר cDNA ישירות מדגימות. ניתן להשתמש בו יחד עם פלטפורמות qPCR ננופלואידיות מרובות תפוקה גבוהה בזמן אמת.

RT-PCR כמותי בעל תפוקה גבוהה בדגימות סי.

פרוטוקול זה נועד לבודד mRNA ריבוזומלי ספציפי לסוג התא באמצעות מודל העכבר NuTRAP.

לבודד רנ"א ספציפיים לסוג תא מדגימות רקמות הטרוגניות קפואות ללא מיון תאים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את שיטת הגידול של חרקים מזיקים טורטריים במעבדות. ההליכים להבחנה בין מין החרקים ולמיצוי חומצות גרעין לריצוף בתפוקה גבוהה נקבעים באמצעות שני מזיקים מומנטיים.

גידול המוני ומחקרים מולקולריים בחרקים מזיקים בטורטריים

למד שיטה מהירה למיצוי RNA מטרדיגרד בודד Hypsibius exemplaris לניתוח ביטוי גנים ב-qRT-PCR. הפרוטוקול משפר את היעילות פי 200 ומאפשר מחקר מולקולרי מדויק של נוירו-עמידות.

מיצוי RNA חד-חיה יחיד להשוואה של רמות תעתיק יחסיות באמצעות qRT-PCR בטרדיגראד Hypsibius exemplaris

גלה סרטונים נוספים