הכנת תרחיף חד-תאי של תאי אפיתל תימיים של עכבר וצביעה של מולקולות תוך-תאיות לניתוח ציטומטרי זרימה

תאי T הם תאים חיסוניים המגנים על גופנו מפני מחלות זיהומיות וסרטן. בלוטת התימוס היא איבר המייצר תאי T ובוחר תאי T מתפתחים בהתאם למרכיבי הגוף העצמיים. אנו מתעניינים באופן שבו בלוטת התימוס מייצרת ובוחרת תאי T המגנים על גופנו ועם זאת סובלניים לגוף.

המעבדה שלנו תרמה לניתוח תאי אפיתל תימיים, שיש להם תפקיד מפתח בייצור ובחירה של תאי T בתימוס. ניתוח ברמת התא הבודד של תאי אפיתל תימי עזר לנו להבין טוב יותר את המנגנון המולקולרי של התפתחות וברירה של תאי T. תאי אפיתל תימיים מגוונים מאוד עם מבנים מורכבים, מה שהופך את בידודם למאתגר.

הטכנולוגיה הנוכחית לבידוד מתלים חד-תאיים מוגבלת וזקוקה לשיפור. למרות זאת, בידוד תא בודד של תאי אפיתל תימי משפר את הבנתנו את המנגנונים המולקולריים המעורבים בהתפתחותם ובתפקודם. אנו מקווים שהמחקר שלנו יתרום להבנת היצירה וההתחדשות של תאי מערכת החיסון.

אנו מאמינים שהוא ישמש אבן פינה חשובה לקידום בריאות האדם. לאחר קצירת התימוס מהעכבר, הניחו אותו בחמישה מיליליטר של RPMI 1640 המכילים 10 מילי-מולרית HEPES בכלי פלסטיק של 60 מילימטר על קרח. תחת מיקרוסקופ מנתח, השתמש בפינצטה מעוקלת עם קצה עדין כדי להסיר רקמות דם, שאינן בלוטת התימוס ושומן.

חותכים את התימוס לחתיכות קטנות בעזרת מספריים מנתחים. העבירו את חתיכות התימוס לתוך שפופרת של 15 מיליליטר המכילה שלושה מיליליטר של מיליגרם אחד למיליליטר קולגנאז ודיספאזה, ויחידה אחת למיליליטר DNase ב-RPMI 1640 המכילה 2% FBS. דגרו את הצינור באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.

לאחר מכן מערבבים את התרחיף באמצעות פיפטת העברת פלסטיק של שלושה מיליליטר, וממשיכים לדגור כ -30 דקות או עד שלא רואים את שברי הרקמה. הוסף חמישה מיליליטר של חמישה מילי-מולרי EDTA ב-HBSS המכיל 1% FBS. סנן את מתלה התאים דרך רשת ניילון של 60 מיקרון לתוך צינור חדש של 50 מיליליטר.

צנטריפוגה של המתלה ב-350G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס, והשעיית הגלולה ב-10 מיליליטר של מאגר FACS. אחסן את התאים על קרח וקבע את מספרי התאים באמצעות מונה תאים. לאחר קצירת בלוטת התימוס מעכבר שזה עתה נולד, השתמשו בפינצטה מעוקלת עם קצה דק כדי להסיר רקמות דם, רקמות שאינן בלוטת התימוס ורקמות שומן.

העבירו את בלוטת התימוס לשפופרת של 1.5 מיליליטר המכילה 0.2 מיליליטר RPMI 1640 המכיל 10 מילי-מולרי HEPES. בעזרת פיפטה של 200 מיקרוליטר, השליכו את המדיום, ואז הוסיפו 0.5 מיליליטר של 0.5 מיליגרם למיליליטר של קולגנאז ודיספאזה ויחידה אחת למיליליטר של דנאז ב-RPMI 1640 המכילה 2% FBS. דגרו את הצינור בגוש חום בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

במהלך הדגירה מערבבים בעדינות בעזרת פיפטה של מיליליטר אחד. לאחר 10 דקות, הוסף 0.5 מיליליטר של חמישה מילי-מולרי EDTA ב-HBSS המכיל 1% FBS. סנן את מתלה התאים דרך רשת ניילון של 60 מיקרון לתוך צינור חרוטי חדש של 15 מיליליטר.

הוסף תשעה מיליליטר של RPMI 1640 המכיל 10 מילי-מולרי HEPES לשפופרת. צנטריפוגה של תרחיף התא ב-350G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס, והשעיה מחדש של הגלולה ב-1 עד 3 מיליליטר של מאגר FACS. אחסן את התאים על קרח וקבע את מספרי התאים באמצעות מונה תאים.

כדי להתחיל, הוסף 16 כפול 10 לעוצמתם של 6 תאי תימוס של עכברים יילודים או לאחר לידה בצינור תחתון עגול של פוליסטירן בנפח חמישה מיליליטר. צנטריפוגה של תרחיף התא ב-350G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס והשליכו את הסופרנטנט. השעו מחדש את גלולת התא בריכוז עבודה של 10 מיקרוליטר של נוגדן חד שבטי לקולטן נגד FC במאגר FACS.

דגרו את הצינור בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. הוסף 40 מיקרוליטר כל אחד של נוגדן חד שבטי נגד CD45, נוגדן חד שבטי נגד EpCAM, נוגדן חד שבטי נגד Ly-51 ו-UEA-1 במאגר FACS. מערבבים את תכולת הצינור ודוגרים בחום של ארבע מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.

לאחר הדגירה, הוסף שני מיליליטר של מאגר FACS. צנטריפוגה של תרחיף התא ב-350G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס, והשהה מחדש את הגלולה במיקרוליטר אחד של תמיסת Ghost Dye violet 510. מערבבים את תכולת הצינור ודוגרים בחום של ארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

כעת הוסף שני מיליליטר של מאגר FACS וצנטריפוגה את תרחיף התא לפני קיבוע התאים במיליליטר אחד של 2% אלדהיד פרפורמי למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. הוסף 3.5 מיליליטר PBS לצינור. צנטריפוגה של תרחיף התאים ב-700G למשך שמונה דקות בארבע מעלות צלזיוס וחדירה לתאים עם מיליליטר אחד של קיבוע תוך תאי וחדירת מאגר.

מערבבים את תכולת הצינור ודוגרים בארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר הדגירה, צנטריפוגה את תרחיף התא והוסף מיליליטר אחד של מאגר חדירה. שוב, צנטריפוגה את התרחיף, לפני הוספת 100 מיקרוליטר כל אחד מריכוזי עבודה של נוגדן אנטי-בטא-5t או נוגדן אנטי-CCL21.

דגירה למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר. הוסף מיליליטר אחד של מאגר חדירות וצנטריפוגה את תרחיף התא ב-700G למשך שמונה דקות בארבע מעלות צלזיוס. כעת הוסיפו 100 מיקרוליטר של ריכוזי עבודה של IgG נגד ארנב ודגרו למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר הוספת מאגר חדירה, צנטריפוגה את תרחיף התאים. השעו מחדש את כדור התא ב-200 מיקרוליטר של מאגר FACS וערבבו היטב. סנן את מתלה התאים דרך רשת ניילון 60 מיקרון לפני ניתוח ציטומטרי זרימה.

פרופילי זרימה ציטומטריים של תאי תימוס מעוכלים של קולגנאז ו-Dispase מעכברים בני יום אפס ועכברים בני שבועיים הראו כי למעלה מ-90% מאותות החלקיקים מייצגים תאים ברי קיימא. אותות פלואורסצנטיים של תאים ברי קיימא יוצגו על ידי CD45 ו-EpCAM. במהלך שלבי היילוד, cTECs היו שכיחים יותר מ-mTECs, אך לאחר הלידה, mTECs שלטו בשל יעילות שחרור נמוכה של cTEC.

קיבוע וחדירה של תאים מאפשרים זיהוי של מולקולות תוך-תאיות בתוך TECs. ביטוי Beta5t זוהה ברוב ה-cTECs, אך לא ב-mTECs. CCL21 זוהה בשבריר מ-mTECs אך לא ב-cTECs.

לשם השוואה, האוויר התבטא בתת-אוכלוסייה של mTECs.