Name: הערכה של פעילות תיקון שבר גדיל כפול DNA באמצעות תפוקה גבוהה וכמותית מבוססת מבחני כתב (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-14T14:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 1 s
Description: חקור מנגנוני תיקון שברי DNA כפולים בתאים באמצעות מבחני כתב מבוססי זוהר. שיטות אלו מאפשרות גילוי תרופות יעיל לטיפול בסרטן ומאיצות מחקר בתחום תגובת נזקי DNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

כל העבודה מומנה על-ידי Artios Pharma Ltd. איור 1 ואיור 3 נוצרו עם Biorender.com.

כימות DNA Double Strand Break Repair with Nanoluciferase Reporter Assays

<ol><li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).</li>
<li>Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-strand+break+repair-pathway+choice+in+somatic+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (11), 698-714 (2019).</li>
<li>Ramsden, D. A., Carvajal-Garcia, J., Gupta, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism%2C+cellular+functions+and+cancer+roles+of+polymerase-theta-mediated+DNA+end+joining%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanism, cellular functions and cancer roles of polymerase-theta-mediated DNA end joining.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 125-140 (2022).</li>
<li>Ceccaldi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous-recombination-deficient+tumours+are+dependent+on+Pol%CE%B8-mediated+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Homologous-recombination-deficient tumours are dependent on Polθ-mediated repair.</a> Nature. 518 (7538), 258-262 (2015).</li>
<li>van de Kooij, B., van Attikum, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+reporter+constructs+to+monitor+pathway-specific+repair+of+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Genomic reporter constructs to monitor pathway-specific repair of DNA double-strand breaks.</a> Front Genet. 12, 809832(2021).</li>
<li>Gunn, A., Stark, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I-SceI-based+assays+to+examine+distinct+repair+outcomes+of+mammalian+chromosomal+double+strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">I-SceI-based assays to examine distinct repair outcomes of mammalian chromosomal double strand breaks.</a> Methods Mol Biol. 920 (9), 379-391 (2012).</li>
<li>Rajendra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((titratable+and+high-throughput+reporter+assays+to+measure+DNA+double+strand+break+repair+activity+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">titratable and high-throughput reporter assays to measure DNA double strand break repair activity in cells.</a> Nucleic Acids Res. 52 (4), 1736-1752 (2024).</li>
<li>Hall, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+luciferase+reporter+from+a+deep+sea+shrimp+utilizing+a+novel+imidazopyrazinone+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate.</a> ACS Chem. Biol. 7 (11), 1848-1857 (2012).</li>
<li>Wyatt, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+roles+for+polymerase+%CE%B8-mediated+end+joining+in+the+repair+of+chromosome+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Essential roles for polymerase θ-mediated end joining in the repair of chromosome breaks.</a> Mol Cell. 63 (4), 662-673 (2016).</li>
<li>Wood, R. D., Doublié, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+protection+by+DNA+polymerase+%CE%B8%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome protection by DNA polymerase θ.</a> Annu Rev Genet. 56, 207-228 (2022).</li>
<li>Belan, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((POLQ+seals+post-replicative+ssDNA+gaps+to+maintain+genome+stability+in+BRCA-deficient+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">POLQ seals post-replicative ssDNA gaps to maintain genome stability in BRCA-deficient cancer cells.</a> Mol Cell. 82 (24), 4664-4680 (2022).</li>
<li>Zatreanu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pol%CE%B8+inhibitors+elicit+BRCA-gene+synthetic+lethality+and+target+PARP+inhibitor+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Polθ inhibitors elicit BRCA-gene synthetic lethality and target PARP inhibitor resistance.</a> Nat Commun. 12 (1), 3636(2021).</li>
<li>Stockley, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+characterization%2C+and+structure-based+optimization+of+small-molecule+in+vitro+and+in+vivo+probes+for+human+DNA+polymerase+theta%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Discovery, characterization, and structure-based optimization of small-molecule in vitro and in vivo probes for human DNA polymerase theta.</a> J Med Chem. 65 (20), 13879-13891 (2022).</li>
<li>Scott, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-molecule+inhibitor+of+the+BRCA2-RAD51+interaction+modulates+RAD51+assembly+and+potentiates+DNA+damage-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">A small-molecule inhibitor of the BRCA2-RAD51 interaction modulates RAD51 assembly and potentiates DNA damage-induced cell death.</a> Cell Chem Biol. 28 (6), 835-847 (2021).</li>
<li>Schep, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+chromatin+context+on+Cas9-induced+DNA+double-strand+break+repair+pathway+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Impact of chromatin context on Cas9-induced DNA double-strand break repair pathway balance.</a> Mol Cell. 81 (10), 2216-2230 (2021).</li>
</ol>

D.G., E.R., B.M., A.G., S.J.B., G.C.M.S ו-H.M.R.R. הם כולם עובדים ובעלי מניות של Artios Pharma Ltd. G.C.M.S היא בעלת מניות של AstraZeneca PLC. S.J.B. היא מדענית מייסדת ובעלת מניות של Artios Pharma Ltd. פטנט הוגש על חלק מהכתבים המתוארים במחקר זה (WO 2021/001647). Promega הוא המקור של טכנולוגיית NanoLuc® ואת polynucleotides NanoLuc® שונה. Artios Pharma אושרה על ידי Promega לייצר את הפולינוקלאוטידים NanoLuc® מותאמים.

כאן, תיארנו פרוטוקולים ליצירה ויישום של חבילה של כתבים מבוססי לומינסנציה חוץ-כרומוזומלית למדידת המיומנות התאית של ארבעת מסלולי DSBR העיקריים (HR, NHEJ, MMEJ ו-SSA)7. ניתן להחדיר מצעי כתב לתאים על ידי טרנספקציה חולפת ולהשתמש בהם כדי להעריך את פעילות DSBR באמצעות קריאה רגישה וחזקה מבוססת לוחות של זוהר NanoLuc, אשר משוחזרת עם מעורבות עם מסלולי DSBR תאיים קוגניטיביים.
מספר שלבים של יצירת מצע כתב, טרנספקציה של המצע לתאים ופירוש נתונים הם קריטיים לביצוע מוצלח של בדיקות אלה. למרות שטכניקות ביולוגיה מולקולרית סטנדרטיות משמשות ליצירת מצעי הכתב, הדמיה של התהליך על ידי אלקטרופורזה בג'ל מבטיחה את האיכות והטוהר הגבוהים ביותר של המצעים לפני ההעברה. מכיוון שבדיקות אלה מסתמכות על טרנספקציה חולפת, חלים שיקולים משותפים לשיטות אלה. אלה כוללים אופטימיזציה של צפיפות הזריעה, תנאי טרנספקציה (כולל ריאגנטים וכמויות DNA), והערכת התאמה בפורמטים של טרנספקציה קדימה ואחורה. בדיקות כתבים אלה בוצעו בהצלחה עם מגוון פרוטוקולים של אלקטרופורציה וליפופקציה, ויש לבחון אפשרויות במלואן לפני ביצוע בדיקות אלה. כמו כן, יש להקפיד לבדוק את הרכיבים NanoLuc ואותות Firefly ולא רק את אות התיקון המרוכב הנגזר על ידי נרמול אות NanoLuc (מצע כתב) לאות Firefly (בקרה). ממצאים יכולים לנבוע מהיחס המונע על ידי שינויים באות הגחלילית. לדוגמה, הערכת עיכוב במצב מנה-תגובה באמצעות תרכובת ספציפית מאוד אמורה לדכא את אות ה-NanoLuc באופן טיטרטיבי מבלי להפריע לאות הגחלילית, שאמור להישאר יציב (איור 4G,H). אולם במקרים שבהם אותות הגחלילית מוטרדים, עדיין ניתן לקבוע השפעות שימושיות על התיקון על-ידי זיהוי חלון מינון שבו אות הגחלילית אינו מושפע (איור 5).
בהשוואה למבחני כתב DSBR הנפוצים ביותר, למבחני כתב חוץ-כרומוזומליים אלה המבוססים על לומינסנציה יש כמה יתרונות ברורים. מכיוון שמסלולי DSBR נשמרים מאוד, גם אם המנגנון התאי משתנה בין מודלים תאיים, הבדיקות עדיין יכולות לדווח על מיומנות DSBR ובחירת מסלולים. זה פותח את ההערכה של DSBR לכל מודל של עניין למשתמש, כל עוד תנאי transfection ארעיים אופטימליים נקבעים מראש.
השימוש בננולוציפראז כגן המדווח מציע גם יתרונות על פני אפשרויות פלואורסצנטיות, אשר שימשו באופן מסורתי במבחני כתב DSBR. NanoLuc מתבגר במהירות וזוהה ברגישות גבוהה באמצעות קורא לוחות8. יחד עם מהירות תיקון המצע (כאשר מצעי הכתב מועתקים לתאים עם קצוות DSB מוכנים לתיקון), פורמט זה של בדיקת כתב DSBR אידיאלי עבור התפנית המהירה והחוסן הכמותי הדרושים לסינון מולקולות קטנות כחלק ממפל גילוי תרופות תעשייתי. ואכן, לאחרונה תיארנו את יישום בדיקת כתב MMEJ הבלתי תלויה בכריתה במפל הגילוי המשמש לזיהוי מעכבי מולקולות קטנות בתחום Polθ polymerase13.
קיימת גם גמישות ביישום מבחני הכתב כדי לענות על שאלות ספציפיות לגבי הפרעות גנטיות ופרמקולוגיות של DSBR (איור 3). לדוגמה, לפני הטרנספקציה של מצעי הכתב, תאים יכולים להיות נגועים ב- siRNA כנגד גן מעניין למשך 48-72 שעות. לחלופין, ניתן לבדוק את ההשפעות של ביטוי יתר של גנים על מסלולי DSBR על ידי ביצוע טרנספקציית פלסמיד 24-48 שעות לפני הטרנספקציה של מצעים מדווחים. עבור מחקרים פרמקולוגיים, הפרוטוקול הנוכחי כבר מתאר כיצד ניתן לשלב את השימוש במולקולות קטנות בתהליך העבודה הסטנדרטי, אך פורמטים חלופיים עשויים לכלול שינויים במשטרי טיפול מורכבים, כגון טרום דגירות או שטיפות.
המדרגיות של טרנספקציה חולפת יכולה גם לתמוך בגישות סינון בקנה מידה גדול שבהן טרנספקציה אצווה של מצעי כתב מבוצעת לפני הסינון. יתר על כן, משך הבדיקה מטרנספקציה לקריאה יכול גם להיות מגוון. למרות משכי זמן סטנדרטיים עשויים להיות 16-24 שעות, כמה בדיקות ניתן לקרוא רק 6 שעות7. חששות לגבי רעילות ממולקולות קטנות או siRNA שיכולים לפגוע בכדאיות התא צריכים להילקח בחשבון גם בקביעת משך הבדיקה.
לסיכום, הבדיקות המתוארות במחקר זה ומתוארות במלואן בפרסום7 שפורסם לאחרונה מספקות הערכה מהירה וחזקה של מיומנות DSBR תאית. הם רגישים מאוד וניתנים לטיטרציה, מה שהופך אותם למקובלים על מחקרים גנטיים ופרמקולוגיים כאחד. באופן מכריע, מכיוון שניתן להכניס את מצעי הכתב לתאים על ידי טרנספקציה חולפת, יש להם פוטנציאל להיות מנוצלים בכל מודל תא טרנספקטיבי של עניין, במקום להיות מוגבלים לקווי תאים ספציפיים על ידי אינטגרציה יציבה כמו במקרה של כתבי DSBR כרומוזומליים. עם זאת, מגבלה ברורה של בדיקות חוץ-כרומוזומליות אלה היא שחוסר האינטגרציה בגנום עשוי שלא לשחזר באופן מלא את ההקשר הפיזיולוגי, הכרומטיני, של תיקון הדנ"א ואת רמזי הבקרה והתזמור הקשורים אליו15. לשם כך, מבחני כתב חוץ-כרומוזומליים משלימים את השיטות הקיימות להערכת DSBR ומרחיבים את ארגז הכלים של המשאבים המתאימים הן למחקר בסיסי והן לגילוי תרופות.

שברי גדיל כפול של דנ"א (DSB) מייצגים סוג רעיל במיוחד של נזק לדנ"א1 שבגללו תאים פיתחו מסלולי תיקון DSB מרובים (DSBR) כדי לתקן נגעים אלה. ארבעת מנגנוני DSBR העיקריים הם רקומבינציה הומולוגית (HR), הצטרפות קצה לא הומולוגית (NHEJ), הצטרפות קצה בתיווך מיקרוהומולוגיה (MMEJ), וחישול גדיל יחיד (SSA)2,3. מסלולי DSBR תורמים לשמירה על התפתחות רקמות בריאות ופיזיולוגיה ומגנים מפני מחלות כגון סרטן. יתר על כן, מנגנוני תיקון אלה טומנים בחובם פוטנציאל טיפולי לפיתוח מודולטורים של מולקולות קטנות באונקולוגיה מדויקת. לדוגמה, התמקדות בדנ"א פולימראז θ (Polθ), אנזים מרכזי במסלול תיקון MMEJ, משכה עניין בשל הקטלניות הסינתטית שלו עם מחסור ב-HR בסרטן4.
להבנת DSBR יש אפוא השלכות קליניות רחבות ויש צורך בבדיקות תאיות פונקציונליות המסוגלות למדוד את הפעילות של כל מסלולי DSBR העיקריים5. הבדיקות חייבות להיות מתאימות הן לחקירה גנטית והן לחקירה פרמקולוגית וניתנות לפריסה על פני מודלים תאיים בעלי עניין. כדי לתמוך במאמצי גילוי תרופות של מולקולות קטנות, הבדיקות חייבות להיות רגישות מאוד, ניתנות לטיטרציה, בעלות תפנית מהירה וניתנות להרחבה לפורמטים בעלי תפוקה גבוהה המתאימים לסינון מורכבים.
באופן כללי, DSBR נמדד בעבר באמצעות מערכות בדיקת כתב מבוססות פלואורסצנטיות המשולבות ביציבות בגנום התא6. עם זאת, בעוד ששחזור פיזיולוגי של DSBR כרומוזומלי הוא יתרון מובהק, בדיקות כאלה מוגבלות למודל מארח שבו הכתב משולב, משתמשות בהכנת דגימות עתירות עבודה וניתוח לפי ציטומטריית זרימה, ויש להן תפוקה, זמן אספקה, חוסן ורגישות מוגבלים, כל התכונות החיוניות הדרושות למאמצי גילוי תרופות.
כאן אנו מתארים חבילה של מבחני כתבי DSBR המאפשרים הערכה של ארבעת מסלולי DSBR העיקריים. חבילת מצעי בדיקת הכתבים מתוארת באיור 1 ומתוארת עוד יותרבפרסום 7 שפורסם לאחרונה. הם חוץ-כרומוזומליים, המאפשרים את הכנסתם לתאים על ידי טרנספקציה חולפת פשוטה, ושילוב של גן כתב ננולוציפראז8, אשר חייב להיות משוחזר על ידי מעורבות עם מנגנוני DSBR ספציפיים, מוליד רגישות, חוסן ומדרגיות. גרסאות המצע הבאות של כתב DSBR כלולות בפרוטוקול (איור 1):
MMEJ בלתי תלוי כריתה: מצע ליניארי זה מורכב מאזור ליבה של דנ"א דו-גדילי (dsDNA) עם דנ"א חד-גדילי (ssDNA) מעל, המחקה את קצוות הדנ"א המנותחים9. ארבע מיקרוהומולוגיות נוקלאוטידים בקצה של אזורי ssDNA מקודדות את קודון ההתחלה של הגן המדווח. תיקון מצע זה באמצעות MMEJ משחזר את מסגרת הקריאה הפתוחה של גן המדווח (ORF).
MMEJ תלוי כריתה: הגן אקסון N-terminal reporter מופרע על ידי קטע המכיל קודון עצירה, אשר משני צדדיו 8 מיקרוהומולוגיות של זוג בסיסים (bp). כריתת קצה נוקלאוליטית נדרשת לפני תיקון בתיווך MMEJ כדי לשחזר את גן המדווח השלם.
NHEJ בוטה: גן הכתב מחולק למקטעים N ו- C טרמינליים, שהאחרון ממוקם במעלה הזרם של המקדם. ה- DSB מיוצר באמצעות EcoRV והוא דורש קשירה ישירה (ללא עיבוד סופי) על ידי NHEJ כדי ששני חלקי הגן המדווח יחוברו מחדש וה- ORF המדווח ישוחזר.
NHEJ לא בוטה: ה- DSB ממוקם בתוך אינטרון ויהיו לו קצוות מלוכדים או לא מגובשים בהתאם לבחירת אנזים ההגבלה. תיקון מצע זה על ידי NHEJ דורש קשירה שקודמת לעיבוד סופי.
תבנית ארוכה HR: האקסון N-terminal של הגן המדווח נקטע על ידי מקטע DNA המכיל אתרי הגבלה, אשר מחליפים 22 bp של רצף הגן המדווח המקורי. כדי לשחזר רצף זה, תיקון על-ידי HR משתמש בתבנית ההומולוגיה של 2.5 קילו-בסיס (kb) הממוקמת במורד הזרם של אקסון מסוף C.
תבנית קצרה HR: אתר ההגבלה הדרוש ליצירת DSB מחליף חלק מרצף הגן המקורי של המדווח ומציג קודון עצירה בתוך מסגרת. בדומה לגרסת התבנית הארוכה, מצע HR זה דורש את תבנית ההומולוגיה במורד הזרם (360 bp) לתיקון ושחזור מדויקים של ORF המדווח.
SSA: מצע זה מכיל קודון עצירה מוקדמת הממוקם בתוך אקסון N-terminal של הגן reporter. הסרת קודון עצירה זה והחזרת רצף הגן המדווח השלם דורשת תיקון על ידי SSA, הכולל כריתה דו-כיוונית לטווח ארוך לפני יישור ההומולוגיות.
עבור יצירת DSB, חלק ממצעי הכתב יכולים להיות מעוכלים באמצעות I-SceI (איור 1). זה ייצור מצע ליניארי עם קצוות לא מגובשים בכתבי MMEJ תלויי כריתה, NHEJ לא בוטה, תבנית ארוכה HR וכתבי SSA, שיש להם אתרי I-SceI בכיוונים הפוכים. בתבנית הקצרה מצע כתב משאבי אנוש, העיכול של אתר I-SceI היחיד ייצור קצוות מגובשים. ניתן לעכל גם את הפלסמידים הלא קהים של NHEJ, MMEJ תלוי כריתה, תבנית ארוכה HR ו- SSA עם HindIII, אשר יפיקו קצוות מלוכדים משלימים.
אנו מספקים פרוטוקולים ליצירת מצעי בדיקת הכתב ומתארים כיצד ניתן לבצע את הבדיקות, מספקים פרטים על האופן שבו ניתן להשתמש בהם כדי לכמת DSBR, כולל תגובות titratable למולקולות קטנות, הערכת עוצמה תאית, פעילות על המטרה וסלקטיביות מסלול.

<table><tbody><tr><td>10x TBE buffer</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9863</td><td></td></tr><tr><td>20% TBE-אקרילאמיד ג'ל</td><td>Invitrogen</td><td>EC6315BOX</td><td></td></tr><tr><td>50x מאגר TAE</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP13321</td><td></td></tr><tr><td>6x צבע טעינת ג'ל, סגול</td><td>NEB</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>96 בארות צלחת לבנה (עם תחתית ומכסה שקופים)</td> <td>Porvair</td><td>204012</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Cleaver Scientific</td><td>CSL-AG500</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP חרוזים</td><td>בקמן קולטר</td><td>A63881</td><td>לטיהור מבוסס חרוזים של DNA</td></tr><tr><td>פוספטאז אנטארקטי ומאגר 10X</td><td>NEB</td><td>M0289L</td><td></td></tr><tr><td>CLARIOstar</td><td>BMG Labtech</td><td>430-101</td><td>קורא צלחות</td></tr><tr><td>Countess II מונה תאים אוטומטי</td><td>Thermo Fisher</td><td>AMQAX1000</td><td>מונה תאים</td></tr><tr><td>אוליגונוקלאוטידים מותאמים אישית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>הזמנה מותאמת אישית</td><td>למצע MMEJ שאינו תלוי בכריתה. ראה טבלה 2.</td></tr><tr><td>D300e</td><td>Tecan</td><td>30100152</td><td>מתקן תרכובות מבוסס DMSO</td></tr><tr><td>D300e D4+ קלטת</td><td>Tecan</td><td>30097371</td><td>קלטת בנפח גבוה למתקן תרכובות D300e D300e</td></tr><tr><td>T8+ קלטת</td><td>Tecan</td><td>30097370</td><td>קלטת בנפח נמוך למתקן תרכובות D300e</td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד, רכב</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-100ML</td> בדרגת תרבית <td>תאים לתרכובות, בשימוש באיור 4 ואיור 5</td></tr><tr><td>מקור כתב DSBR פלסמידים</td><td>Artios</td><td></td><td>זמין לקהילה האקדמית על פי בקשה&nbsp;</td></tr><tr><td>EcoRV-HF ו-10x CutSmart buffer</td><td>NEB</td><td>R3195M</td><td></td></tr><tr><td>אתנול מוחלט</td><td>VWR</td><td>20821.365</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>PAN-Biotech</td><td>P30-3031&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler סולם DNA בטווח נמוך במיוחד</td><td>Thermo Fisher</td><td>SM1211</td><td>סולם DNA במשקל מולקולרי נמוך</td></tr><tr><td>תאי HEK-293 ATCC</td><td></td><td>CRL-1573</td><td>קו תאים לדוגמה המשמש בפרוטוקול</td></tr><tr><td>HindIII-HF ו-10x CutSmart buffer</td><td>NEB</td><td>R3104M</td><td></td></tr><tr><td>HyClone ביולוגיה מולקולרית כיתה מים</td><td>פישר Scientific</td><td>10275262</td><td></td></tr><tr><td>I-SceI ו-10x Tango Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>ER1771</td><td></td></tr><tr><td>איזופרופנול</td><td>VWR</td><td>20842.33</td><td></td></tr><tr><td>מגיב ומאגר JetPRIME</td><td>PolyPlus</td><td>114-15</td><td>מגיב טרנספקציה מבוסס ליפידים</td></tr><tr><td>MegaStar 1.6</td><td>VWR</td><td>521-1749</td><td>צנטריפוגה לצינורות 15 או 50 מ"ל</td></tr><tr><td>MEM Eagle</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-08056</td><td>מדיום תרבית לתאי HEK-293</td></tr><tr><td>Microplate שייקר</td><td>פישרברנד</td><td>15504070</td><td>שייקר מסלולי מיקרופלייט</td></tr><tr><td>MicroStar 17R</td><td>VWR</td><td>521-1647</td><td>צנטריפוגה לצינורות 1.5 או 2 מ"ל</td></tr><tr><td>MultiDrop</td><td>Thermo Fisher</td><td>5840300</td><td>תא או מתקן ריאגנט על בסיס מים</td></tr><tr><td>MultiDrop קלטת סטנדרטית</td><td>תרמו פישר</td><td>24072670</td><td>קלטת למתקן ריאגנטים MultiDrop</td></tr><tr><td>NanoDLR Stop & מגיב Glo Buffer ו-Substrate</td><td>Promega</td><td>N1630 או N1650</td><td>Reporter luciferase (NanoLuc) כדי להרוות את זוהר הגחלילית ולזהות זוהר NanoLuc. חלק מערכת הבדיקה של Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter</td></tr> Assay <tr><td>System ONE-Glo EX Luciferase Assay Buffer and Substrate</td><td>Promega</td><td>N1630 או N1650</td><td>Control luciferase (Firefly) Assay Reagent לזיהוי Firefly. חלק מערכת הבדיקה של Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay</td></tr><tr><td>System PBS (ללא סידן או מגנזיום)</td> <td>PAN-Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>pGL4 Firefly פלסמיד (או דומה)</td> <td>Promega</td><td>E1310 (או שווה ערך)</td> <td>פלסמיד בקרת Firefly</td></tr><tr><td>pNL1.1 NanoLuc פלסמיד (או דומה)</td> <td>Promega</td><td>N1091 (או שווה ערך)</td> <td>פלסמיד בקרת NanoLuc, להתאמת הגדרות ציוד/ניסויי אופטימיזציה</td></tr><tr><td>ערכת מיצוי ג'ל QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>טעינה מהירה סגול 1 kb סולם DNA</td><td>NEB</td><td>N0552S</td><td>סולם DNA במשקל מולקולרי גבוה</td></tr><tr><td>נתרן אצטט (3 מ'), pH 5.5</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9740</td><td>להתאמת pH במהלך מיצוי ג'ל עם ערכת מיצוי ג'ל QIAquick</td></tr><tr><td>SYBR Gold (10,000x)</td> <td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td>להדמיה של ssDNA ו-dsDNA</td></tr><tr><td>SYBR בטוח (10,000x)</td> <td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td>להדמיה של dsDNA בלבד</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase ו-10x Ligase buffer</td><td>NEB</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain 0.4%</td> <td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td>למדידת כדאיות במהלך ספירת תאים</td></tr><tr><td>תמיסת Trypsin-EDTA; 0.25% טריפסין ו-0.53 מ"מ EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049-100ML</td><td></td></tr><tr><td>XhoI ומאגר 10x CutSmart</td><td>NEB</td><td>R0146M</td><td></td></tr></tbody></table>

הערכה של פעילות תיקון שבר גדיל כפול dna באמצעות תפוקה גבוהה וכמותית מבוססת מבחני כתב

Assessment of DNA Double Strand Break Repair Activity Using High-throughput and Quantitative Luminescence-Based Reporter Assays

תיקון שברים כפולי גדיל של DNA (DSBs) חיוני לשמירה על יציבות הגנום ועל כדאיות התא. תיקון DSB (DSBR) בתאים מתווך באמצעות מספר מנגנונים: רקומבינציה הומולוגית (HR), הצטרפות קצה לא הומולוגית (NHEJ), הצטרפות קצה בתיווך מיקרוהומולוגיה (MMEJ) וחישול גדיל יחיד (SSA). בדיקות תאיות חיוניות למדידת המיומנות והאפנון של מסלולים אלה בתגובה לגירויים שונים.
כאן, אנו מציגים חבילה של מבחני כתב חוץ-כרומוזומליים שכל אחד מהם מודד את המבנה מחדש של גן כתב ננולוציפראז על ידי אחד מארבעת מסלולי DSBR העיקריים בתאים. עם טרנספקציה חולפת לתאים בעלי עניין, ניתן למדוד תיקון של מצעי כתב ספציפיים למסלול תוך פחות מ-24 שעות על ידי זיהוי של לומינסנציה של ננולוציפראז (NanoLuc).
בדיקות חזקות אלה הן כמותיות, רגישות, ניתנות לטיטרציה וניתנות להתאמה לפורמט סינון בתפוקה גבוהה. תכונות אלה מספקות יישומים נרחבים במחקר תיקון DNA וגילוי תרופות, ומשלימות את ערכת הכלים הקיימת כיום של בדיקות DSBR תאי.

תיקון של כל אחד ממבחני הכתב ניתן לאתר ולכמת באמצעות אותו הליך. תיקון נכון של מצע על ידי מסלול התיקון הקוגנטי שלו בתאים יהווה מחדש ORF שלם ופונקציונלי המקודד NanoLuc. ניתן לזהות אות זוהר זה באמצעות קורא לוחות.
co-transfection עם פלסמיד שלם קידוד Firefly luciferase משמש בקרת transfection. בקרה זו משרתת שתי מטרות. ראשית, הוא מספק תקן לנרמל את אות NanoLuc, כפי שהוא צריך להיות מופרע על ידי אפנון של DSBR באמצעים גנטיים או פרמקולוגיים. שנית, הוא יכול לספק אינדיקציה להפרעות תאיות מחוץ למטרה המשפיעות על אות הלוציפראז, כגון אפנון מחזור התא, השפעות על שעתוק / תרגום, או רעילות כללית.
היחס בין NanoLuc ל-Firefly משמש כתחליף לתיקון. ניתן לייצא ולנתח ערכי Luminescence על ידי נרמול שני אותות לוציפראז מתוך אותה באר. במקרה של מחקרי הפרעה גנטית (למשל, השוואת סוג פראי ו- KO או non-targeting ו- siRNA מטרה), התיקון בדרך כלל מנורמל לדגימת ההורים (תאים מסוג בר או תאים שטופלו ב- siRNA בקרה שאינו ממוקד). במקרה של אפנון פרמקולוגי, ערכים ממדגם שטופל בתרכובת מנורמלים לערך המיוצר על ידי טיפול ברכב.
אימות מלא של חבילת הכתבים המתוארת פורסם לאחרונה7. נתונים המדגימים אפיון אפנון גנטי ופרמקולוגי של DSBR מוצגים באיור 4 (מותאם מ-7). Polθ הוא המתווך העיקרי של MMEJ ואובדן או עיכוב של אנזים זה צפוי לעבד באופן ספציפי MMEJתאי 3,10. באמצעות קו תאים שבו POLQ, הגן המקודד Polθ, הושמד11, בדיקת כתב MMEJ שאינה תלויה בכריתה מראה כי MMEJ אכן מדוכא כמעט לחלוטין. הערכה של אותות ההארה של הרכיב NanoLuc ו-Firefly מראה שפגם התיקון שנצפה מונע על-ידי הפחתה באות ה-NanoLuc (המקודד על-ידי מצע הכתב) בעוד שאות ה-Firefly (בקרה) אינו מוטרד (איור 4A-C). לעומת זאת, הערכת מיומנות NHEJ באמצעות כתב NHEJ בקצה הבוטה מראה כי נוקאאוט POLQ אינו מעכב את תיקון מצע הכתב (איור 4D-F). יחד, נתונים גנטיים אלה תומכים בתפקיד הספציפי של Polθ בתיקון בתיווך MMEJ. התצפיות האלה משוחזרות באופן פרמקולוגי מלא עם ART55812,13, מעכב חזק מאוד וספציפי שדווח לאחרונה של תחום הפולימראז של Polθ (איור 4G), שבו נצפה עיכוב טיטראטיבי של MMEJ, אשר נובע מירידה ספציפית בננולוק ולא באות הגחלילית (איור 4H). יתר על כן, ובהסכמה עם נתונים גנטיים, אין השפעה על NHEJ (איור 4I,J). יחד, נתונים אלה מדגישים כיצד ניתן להשתמש בכתבים אלה כדי לאפיין את המודולציה הגנטית של מסלולי DSBR ולהראות עוצמה תאית וספציפיות מטרה/מסלול של מולקולות קטנות.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66969/66969fig04.jpg"> איור 4: השפעות של נוקאאוט גנטי ועיכוב פרמקולוגי של Polθ על אותות כתב MMEJ ו-NHEJ. תאי eHAP1 WT ו-POLQ(-) הודבקו בפלסמיד בקרת Firefly ועם (A-C) כתב MMEJ שאינו תלוי בכריתה או (D-F) כתב NHEJ קהה. אחוז תיקון MMEJ או NHEJ הוא היחס בין לומינסנציה של NanoLuc על פני לומינסנציה של Firefly, מנורמל לבקרה שטופלה ב- DMSO, 24 שעות לאחר הטרנספקציה. הנתונים מייצגים ממוצע ± SEM של שלושה משכפלים ביולוגיים, כל אחד בממוצע 8 משכפלים טכניים. תאי HEK-293 הודבקו בפלסמיד בקרת Firefly ו-(G,H) בכתב MMEJ שאינו תלוי בכריתה או בכתב NHEJ בקצה הקהה (I,J) וטופלו במעכב Polθ polymerase ART558. אחוז התיקון הוא היחס בין לומינסנציה של NanoLuc על פני לומינסנציה של Firefly, מנורמל לבקרה שטופלה ב- DMSO, 24 שעות לאחר הטרנספקציה. אחוז עיכוב של אותות ההארה הבודדים ב-(G) ו-(I) חושב ביחס לבקרה שטופלה ב-DMSO והוצג בהתאמה ב-(H) וב-(J). הנתונים מייצגים ממוצע ± SEM של 2 משכפלים ביולוגיים, כל אחד בממוצע 4 משכפלים טכניים. נתון זה נלקח מ Rajendra et al.7. קיצורים: NanoLuc = Nanoluciferase; MMEJ = חיבור קצה בתיווך מיקרוהומולוגיה; NHEJ = צירוף קצה לא הומולוגי; WT = סוג פראי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66969/66969fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66969/66969fig05.jpg"> איור 5: עיכוב אות כתב HR על-ידי מעכב RAD51 CAM833. (A) תאי HEK-293 הודבקו במצע כתב HR בתבנית ארוכה, פלסמיד בקרת Firefly luciferase, וטופלו במעכב RAD51 CAM83314. NanoLuc ו- Firefly luminescence נקראו 16 שעות לאחר הטרנספקציה. אחוז תיקון HR הוא היחס בין זוהר NanoLuc על פני לומינסנציה של Firefly, מנורמל לבקרה שטופלה ב- DMSO. קווים מקווקווים מדגישים אחוז עיכוב HR וריכוז CAM833 בעקומה EC50. הנתונים מייצגים ממוצע ± SEM של 2 משכפלים ביולוגיים, כל אחד בממוצע 4 משכפלים טכניים. (B) אחוז עיכוב של אותות ההארה הבודדים ב-(A) חושב ביחס לבקרות שטופלו ב-DMSO. קווים מקווקווים מדגישים את אחוז עיכוב NanoLuc ו-Firefly ב-3.33 מיקרומטר CAM833 (EC50). הירידה באות הגחלילית בריכוזי CAM833 ≥-10 מיקרומטר מעידה על רעילות תרכובות במינונים גבוהים; עם זאת, הפחתת אות NanoLuc נצפית בריכוזים שבהם אות Firefly אינו מושפע, דבר המצביע על כך ש- CAM833 גורם לעיכוב HR על המטרה. נתון זה נלקח מ Rajendra et al.7. קיצורים: NanoLuc = Nanoluciferase; HR = רקומבינציה הומולוגית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66969/66969fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">מצע כתב</td>
			<td>פלסמיד מקור (גודל ב- KB, התנגדות)</td>
			<td colspan="3">דור DSB</td>
			<td>גודל צפוי של מצע הכתב הסופי (kb)</td>
		</tr><tr><td colspan="2">MMEJ שאינו תלוי בכריתה</td>
			<td>4.0, קאן</td>
			<td colspan="3">כריתת זנבות 3 אינץ' באמצעות קשירת כובעים</td>
			<td>1.6</td>
		</tr><tr><td colspan="2">MMEJ תלוי כריתה</td>
			<td>6.5, כאן</td>
			<td colspan="3">I-SceI (לא מגובש), HindIII (מלוכד)</td>
			<td>6.5</td>
		</tr><tr><td colspan="2">NHEJ בוטה</td>
			<td>4.3, כאן</td>
			<td colspan="3">קהה מסתיים בכריתה מפלסמיד על ידי EcoRV</td>
			<td>1.7</td>
		</tr><tr><td colspan="2">NHEJ לא בוטה</td>
			<td>6.7, כאן</td>
			<td colspan="3">I-SceI (לא מגובש), HindIII (מלוכד)</td>
			<td>6.5</td>
		</tr><tr><td colspan="2">תבנית ארוכה HR</td>
			<td>9.2, כאן</td>
			<td colspan="3">I-SceI (לא מגובש), HindIII (מלוכד)</td>
			<td>9.2</td>
		</tr><tr><td colspan="2">תבנית קצרה HR</td>
			<td>9.3, אמפר</td>
			<td colspan="3">I-SceI (מגובש)</td>
			<td>9.3</td>
		</tr><tr><td colspan="2">SSA</td>
			<td>9.5, כאן</td>
			<td colspan="3">I-SceI (לא מגובש), HindIII (מלוכד)</td>
			<td>9.5</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: פלסמידים של מצע כתב. קיצורים: DSB = שבר גדיל כפול; MMEJ = חיבור קצה בתיווך מיקרוהומולוגיה; NHEJ = צירוף קצה לא הומולוגי; HR = רקומבינציה הומולוגית; SSA = חישול גדיל יחיד; קאן = קנמיצין; אמפר = אמפיצילין.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3">רצף (5'-3')</td>
			<td>הספק</td>
			<td>טיהור</td>
			<td>פונקציה</td>
		</tr><tr><td colspan="3">5'[Phos]TCGAGGACTTGGTCCAGGTT GTAGCCGGCTGTGTCGCCAGTCC CCAACGAAATCTTCGAGTGTGAAGACCAT</td>
			<td>סיגמא</td>
			<td>דף</td>
			<td>כובע שמאלי, אוליגונוקלאוטיד ארוך</td>
		</tr><tr><td colspan="3">5'[Phos]GCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCC</td>
			<td>סיגמא</td>
			<td>דף</td>
			<td>כובע שמאלי, אוליגונוקלאוטיד קצר</td>
		</tr><tr><td colspan="3">5'[Phos]AGCTTTATTGCGGTAGTTTATCA CAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGTGG GCCTCGGCGGCCAAGCTAGGCAATCC GGTGTGTTGGTAAAGCCACCATGG</td>
			<td>סיגמא</td>
			<td>דף</td>
			<td>כובע ימני, אוליגונוקלאוטיד ארוך</td>
		</tr><tr><td colspan="3">5'[Phos]CGAGGCCCACTGACTGCGTTA GCAATTTAACTGTGATAAACTACCGCAATAA</td>
			<td>סיגמא</td>
			<td>דף</td>
			<td>כובע ימני, אוליגונוקלאוטיד קצר</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 2: אוליגונוקלאוטידים למכסות ליצירת מצע כתב MMEJ בלתי תלוי בכריתה. קיצורים: ssDNA = DNA חד-גדילי; dsDNA = DNA דו-גדילי; MMEJ = חיבור קצה בתיווך מיקרוהומולוגיה; PAGE = אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד. מיקרוהומולוגיות מסומנות בקו תחתון.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>בדיקת כתב</td>
			<td>כתב NanoLuc מצע DNA (מיקרוגרם DNA/1x106 תאים)</td>
			<td>פלסמיד לוציפראז בקרת גחליליות (מיקרוגרם DNA/1x106 תאים)</td>
		</tr><tr><td>MMEJ שאינו תלוי בכריתה</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.66</td>
		</tr><tr><td>MMEJ תלוי כריתה</td>
			<td>1</td>
			<td>0.66</td>
		</tr><tr><td>NHEJ בוטה</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.66</td>
		</tr><tr><td>NHEJ לא בוטה</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.66</td>
		</tr><tr><td>תבנית ארוכה HR</td>
			<td>1</td>
			<td>0.66</td>
		</tr><tr><td>תבנית קצרה HR</td>
			<td>2</td>
			<td>0.66</td>
		</tr><tr><td>SSA</td>
			<td>1</td>
			<td>0.66</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 3: כמויות DNA עבור טרנספקציה חולפת של מצעי כתב NanoLuc ופלסמיד לוציפראז בקרת Firefly (HEK-293, פורמט צלחת 96 באר). קיצורים: MMEJ = חיבור קצה בתיווך מיקרוהומולוגיה; NHEJ = צירוף קצה לא הומולוגי; HR = רקומבינציה הומולוגית; SSA = חישול גדיל יחיד.

אנו מציגים פרוטוקולים להערכת מיומנות מסלול תיקון שבר גדיל כפול בתאים באמצעות חבילה של מצעי כתב חוץ-כרומוזומליים מבוססי לומינסנציה.

הערכה של פעילות תיקון שבר גדיל כפול DNA באמצעות תפוקה גבוהה וכמותית מבוססת מבחני כתב

The repair of DNA double strand breaks (DSBs) is crucial for the maintenance of genome stability and cell viability. DSB repair (DSBR) in cells is ...

assessment-dna-double-strand-break-repair-activity-using-high

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

מאמר זה מתאר GFP מבוססי...

ניתוח תיקון DNA פעמיים גדיל Break (DSB) בתאי יונקים

אנו מתארים את שיטת מדידה כמותית בזמן אמת, של ה-DNA glycosylase ופעילויות איי פי endonuclease ב lysates גרעיני התא. Assay מניב שיעורי פעילות תיקון דנ"א מקובל ניתוח הקינטית ניתנת להתאמה עבור כימות של פעילות ה-DNA תיקון רקמות lysates הגידול או עם חלבונים מטוהרים.

כמותי, בזמן אמת, ניתוח של פעילות כריתת מאגר תיקון lysates סלולריים ניצול הנגע ספציפיים משואות מולקולרית

קרינה פלואורסצנטית קונאפוקלית מיקרוסקופ לייזר מיקרו-הקרנה הצעה וכלים גרימת נזק לדנ א וניטור התגובה של חלבונים תיקון ה-DNA באזורים נבחרים גרעיני תת. טכניקה זו התקדמה באופן משמעותי את הידע שלנו של גילוי הנזק, איתות, גיוס. כתב יד זה מדגים הטכנולוגיות הללו לבחון סטרנד ליחיד מעבר לתיקון.

היישום של לייזר מיקרו-הקרנה בחינת יחיד ותיקון כפול Strand Break בתאים בתרבית

המטרה של פרוטוקול זה נועד לכמת תיקון crosslinks DNA-חלבון מוגדר על פלסמיד ה-DNA. פלסמידים lesioned הם transfected לתוך שורות תאים בתרבית של הנמען, משקל נמוך-מולקולרי נקצרו תקנים שלאחר נקודות זמן מרובים. קינטיקה תיקון ה-DNA יש לכמת באמצעות הארכת תחל סטרנד ספציפיים ואחריו qPCR.

הנועד פשוטה, מהירה, כמותית למדוד תיקון של חלבון-דנ א Crosslinks על פלסמידים Transfected בתרבית של תאים

תיקון של זוגיות-גדיל DNA מעברי הוא תהליך דינמי, הדורשים לא רק היווצרות תיקון מכלולי השברים, אבל גם הרזולוציה שלהן לאחר הנגע הוא ממוען. כאן, אנו משתמשים מיקרוסקופ immunofluorescence עבור ארעי לטווח ארוך כפול גדילי ומעברי ככלי לנתח מנגנון תחזוקה זה הגנום.

אפיון תהליכי תיקון DNA-ארעי ומעברי DNA ארוך כפול-strand על ידי מיקרוסקופ Immunofluorescence

פרוטוקול זה מציג מערכת גנים כתב חדשה ואת ההתקנה הניסיונית כדי לזהות שעתוק ב- DNA כפול גדיל נשבר עם רגישות מולקולה אחת.

הדמיה של תאים חיים של פעילות תמלול בהפסקות דו-סטרנד DNA

יישום מודל orthotopic של קרצינומה של תאי כליה בעכברים עם מערכת חיסון תקינים מקנה החוקר מערכת קלינית רלוונטית המוגדרת על ידי הנוכחות של גרורות גידול ריאות כליות עיקריות באותה החיה. מערכת זו יכולה לשמש כדי preclinically לבדוק מגוון של טיפולים in vivo.

קרצינומה תא syngeneic עכבר הדגם של גרורתי כליות עבור הערכה כמותית אורך ורוחב של טיפולים פרה-קליניים

כתב יד זה מספק פרוטוקול לניתוח של מעברי כפול-גדיל ה-DNA על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence של γH2AX ושל 53BP1.

מיקרוסקופ immunofluorescence של γH2AX ו 53BP1 לניתוח את היווצרות והתיקון של מעברי כפול-גדיל ה-DNA

במגוון רחב של מחלות אינדיקציות, דגמים רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית מתנהג הסמים מפותחת, מיושמים לתוך גילוי תוכניות. המערכת החדשה דגם המתוארים כאן מדגים איך תלת מימדי הגידול יכול להיות תרבותי ולא הוקרן תפוקה גבוהה 1536-ובכן צלחת מערכת מבוססת לחיפוש תרופות חדשות אונקולוגיה spheroids.

מהדור בתפוקה גבוהה תלת מימדי הגידול Spheroids להקרנה סמים

כאן, אנו מציגים את הקרנת הסרט פרה coumarins נגד סרטן באמצעות תרבות תלת-ממד, דג זברה.

הערכת פרה Bioactivity של OT48 נגד סרטן קומרין Spheroids, מבחני היווצרות המושבה ועל דג זברה Xenografts

חקור מנגנוני תיקון שברי DNA כפולים בתאים באמצעות מבחני כתב מבוססי זוהר. שיטות אלו מאפשרות גילוי תרופות יעיל לטיפול בסרטן ומאיצות מחקר בתחום תגובת נזקי DNA.

הערכה של פעילות תיקון שבר גדיל כפול DNA באמצעות תפוקה גבוהה וכמותית מבוססת מבחני כתב

גלה סרטונים נוספים