Name: פרוטוקול ממוטב לגלילים שוויצריים במעי וצביעה אימונופלואורסצנטית של רקמה משובצת פרפין (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T14:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: למד טכניקת גלילים שוויצריים לקבלת תוצאות עקביות ואמינות בצביעה אימונופלואורסצנטית של מעי עכברים. פרוטוקול זה מאפשר הדמיה מפורטת של כל אזורי המעי בבלוק פרפין אחד וחוסך משאבים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) מענקי K01 DK121869 ל- ACE ופרסום זה נתמך בחלקו על ידי T32 GM132055 (RME), F31 DK139736 (SAD), T32 DK124191 (SAD), TL1 TR001451 (RS), UL1 TR001450 (RS) ומענקי אבן הפינה של HCS ל- SAD &; RS. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות סטארט-אפ מהאוניברסיטה הרפואית של דרום קרוליינה (MUSC) ל-ACE ונתמכה על ידי MUSC Digestive Disease Research Core Center (P30 DK123704) ו-COBRE in Digestive and Liver Disease (P20 GM120475). ההדמיה בוצעה באמצעות ליבת התא וההדמיה המולקולרית ב-MUSC.

שיטת רול שוויצרית יעילה לאימונוסטיישן איכותי של רקמת המעי

<ol><li>Louvard, D., Kedinger, M., Hauri, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+differentiating+intestinal+epithelial+cell%3A+Establishment+and+maintenance+of+functions+through+interactions+between+cellular+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The differentiating intestinal epithelial cell: Establishment and maintenance of functions through interactions between cellular structures.</a> Annu Rev Cell Biol. 8, 157-195 (1992).</li>
<li>Rieger, J., Pelckmann, L. M., Drewes, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRieger%2C+J+%22Animal+models+of+allergic+disease%3A+Methods+and+protocols%22">Animal models of allergic disease: Methods and protocols</a>. , Springer US. New York, NY. (2021).</li>
<li>Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+prolonged+formalin+fixation+on+the+immunohistochemical+detection+of+infectious+agents+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Pathol%22%5BJournal%5D)">Effects of prolonged formalin fixation on the immunohistochemical detection of infectious agents in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Vet Pathol. 47 (3), 529-535 (2010).</li>
<li>Hayashi, Y., Koike, M., Matsutani, M., Hoshino, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+fixation+time+and+enzymatic+digestion+on+immunohistochemical+demonstration+of+bromodeoxyuridine+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochemis%22%5BJournal%5D)">Effects of fixation time and enzymatic digestion on immunohistochemical demonstration of bromodeoxyuridine in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> J Histochem Cytochemis. 36 (5), 511-514 (1988).</li>
<li>Werner, M., Chott, A., Fabiano, A., Battifora, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+formalin+tissue+fixation+and+processing+on+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Surg+Pathol%22%5BJournal%5D)">Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry.</a> Am J Surg Pathol. 24 (7), 1016-1019 (2000).</li>
<li>Scalia, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+masking+during+fixation+and+embedding%2C+dissected%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Antigen masking during fixation and embedding, dissected.</a> J Histochem Cytochem. 65 (1), 5-20 (2017).</li>
<li>Masood, S., Von Wasielewski, R., Mengel, M., Nolte, M., Werner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+fixation%2C+antibody+clones%2C+and+signal+amplification+on+steroid+receptor+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+J%22%5BJournal%5D)">Influence of fixation, antibody clones, and signal amplification on steroid receptor analysis.</a> Breast J. 4 (1), 33-40 (1998).</li>
<li>Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%26%2334%3Bswiss+roll%26%2334%3B%3A+A+simple+technique+for+histological+studies+of+the+rodent+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">The &#34;swiss roll&#34;: A simple technique for histological studies of the rodent intestine.</a> Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).</li>
<li>Casteleyn, C., Rekecki, A., Van Der Aa, A., Simoens, P., Van Den Broeck, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+area+assessment+of+the+murine+intestinal+tract+as+a+prerequisite+for+oral+dose+translation+from+mouse+to+man%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animals%22%5BJournal%5D)">Surface area assessment of the murine intestinal tract as a prerequisite for oral dose translation from mouse to man.</a> Lab Animals. 44 (3), 176-183 (2010).</li>
<li>Lunnemann, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cecum+axis+%28cecax%29+preservation+reveals+physiological+and+pathological+gradients+in+mouse+gastrointestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Cecum axis (cecax) preservation reveals physiological and pathological gradients in mouse gastrointestinal epithelium.</a> Gut Microbes. 15 (1), 2185029(2023).</li>
<li>Qin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cutting+and+floating+method+for+paraffin-embedded+tissue+for+sectioning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning.</a> J Vis Exp. (139), e58288(2018).</li>
<li>Feldman, A. T., Wolfe, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFeldman%2C+AT+%22Histopathology%3A+Methods+and+protocols%22">Histopathology: Methods and protocols</a>. , Springer New York. New York, NY. (2014).</li>
<li>Yang, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+mechanism+of+mucosal+barrier+erosion+in+the+pathogenesis+of+acquired+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Innate mechanism of mucosal barrier erosion in the pathogenesis of acquired colitis.</a> iScience. 26 (10), 107883(2023).</li>
<li>Dooley, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+5b+is+required+for+proper+localization+of+the+intermicrovillar+adhesion+complex+in+the+intestinal+brush+border%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Myosin 5b is required for proper localization of the intermicrovillar adhesion complex in the intestinal brush border.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 323 (5), G501-G510 (2022).</li>
<li>Danan, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+transit+amplifying+cells+require+mettl3+for+growth+factor+signaling%2C+kras+expression%2C+and+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Intestinal transit amplifying cells require mettl3 for growth factor signaling, kras expression, and cell survival.</a> bioRxiv. , 10.1101/2023.04.06.535853 (2023).</li>
<li>Han, B., Qi, S., Hu, B., Luo, H., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tgf-beta+i+promotes+islet+beta-cell+function+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tgf-beta i promotes islet beta-cell function and regeneration.</a> J Immunol. 186 (10), 5833-5844 (2011).</li>
<li>Chen, L. C., Wang, H. W., Huang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+inherent+niches+in+3d+multicellular+msc+spheroids+reconfigures+metabolism+and+enhances+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Modulation of inherent niches in 3d multicellular msc spheroids reconfigures metabolism and enhances therapeutic potential.</a> Cells. 10 (10), 2747(2021).</li>
<li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cd36+inhibits+beta-catenin%2Fc-myc-mediated+glycolysis+through+ubiquitination+of+gpc4+to+repress+colorectal+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Cd36 inhibits beta-catenin/c-myc-mediated glycolysis through ubiquitination of gpc4 to repress colorectal tumorigenesis.</a> Nat Commun. 10 (1), 3981(2019).</li>
<li>Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+colitis+modeling+using+dextran+sulfate+sodium+%28dss%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine colitis modeling using dextran sulfate sodium (dss).</a> J Vis Exp. (35), e1652(2010).</li>
<li>Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+swiss-rolling+technique+for+intestinal+tissue+preparation+for+immunohistochemical+and+immunofluorescent+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Improved swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses.</a> J Vis Exp. (113), e54161(2016).</li>
<li>Le Naour, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+swiss-rolling+method+for+histological+analyses+of+colon+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Improved swiss-rolling method for histological analyses of colon tissue.</a> MethodsX. 9, 101630(2022).</li>
<li>Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+tissue+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Mouse tissue fixation.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2014 (5), 073403(2014).</li>
<li>Pereira E Silva, A., Lourenço, A. L., Marmello, B. O., Bitteti, M., Teixeira, G. aP. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+techniques+for+a+comprehensive+gut+histopathological+analysis%3A+Swiss+roll+versus+intestine+strips%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Comparison of two techniques for a comprehensive gut histopathological analysis: Swiss roll versus intestine strips.</a> Exp Mol Pathol. 111, 104302(2019).</li>
<li>Williams, J. M., Duckworth, C. A., Vowell, K., Burkitt, M. D., Pritchard, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+preparation+techniques+for+histological+analysis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Prot+Mouse+Biol%22%5BJournal%5D)">Intestinal preparation techniques for histological analysis in the mouse.</a> Curr Prot Mouse Biol. 6 (2), 148-168 (2016).</li>
<li>Boenisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+heat-induced+antigen+retrieval+following+inconsistent+formalin+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Immunohistochem+Mol+Morphol%22%5BJournal%5D)">Effect of heat-induced antigen retrieval following inconsistent formalin fixation.</a> Appl Immunohistochem Mol Morphol. 13 (3), 283-286 (2005).</li>
<li>Hasegawa, Y., Mark Welch, J. L., Rossetti, B. J., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+three-dimensional+spatial+structure+in+the+gut+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Preservation of three-dimensional spatial structure in the gut microbiome.</a> PLoS One. 12 (11), e0188257(2017).</li>
<li>Garabedian, E. M., Roberts, L. J., Mcnevin, M. S., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examining+the+role+of+paneth+cells+in+the+small+intestine+by+lineage+ablation+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Examining the role of paneth cells in the small intestine by lineage ablation in transgenic mice.</a> J Biol Chem. 272 (38), 23729-23740 (1997).</li>
<li>Moshi, J. M., Ummelen, M., Broers, J. L. V., Ramaekers, F. C. S., Hopman, A. H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+antigen+retrieval+protocols+on+the+immunohistochemical+detection+of+epigenetic+DNA+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Impact of antigen retrieval protocols on the immunohistochemical detection of epigenetic DNA modifications.</a> Histochem Cell Biol. 159 (6), 513-526 (2023).</li>
<li>Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat-induced+antigen+retrieval+for+immunohistochemical+reactions+in+routinely+processed+paraffin+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Heat-induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections.</a> Methods Mol Biol. 588, 103-119 (2010).</li>
<li>Pereira, E. S. A., Lourenco, A. L., Marmello, B. O., Bitteti, M., Teixeira, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+techniques+for+a+comprehensive+gut+histopathological+analysis%3A+Swiss+roll+versus+intestine+strips%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Comparison of two techniques for a comprehensive gut histopathological analysis: Swiss roll versus intestine strips.</a> Exp Mol Pathol. 111, 104302(2019).</li>
<li>Bolognesi, M. aO., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+validated+for+routinely+processed+tissues+stain+frozen+sections+unpredictably%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Techniques%22%5BJournal%5D)">Antibodies validated for routinely processed tissues stain frozen sections unpredictably.</a> Bio Techniques. 3 (3), 137-148 (2021).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

כאן, אנו מציגים שיטה אופטימלית לקיבוע רקמות בטכניקת הרול השוויצרית כדי לשמר את ארכיטקטורת המעי ולקדם אימונוסטיין מדויק. לאחר השליטה, טכניקה זו יכולה לשמש כדי לחקור מגוון רחב של שאלות מחקר הקשורות פיזיולוגיה של המעי וביולוגיה התא19. פורסמו מספר שיטות גלגול שוויצריות אופטימליות והן שימושיות מאוד20,21. יתרון של טכניקה זו הוא הקלות של פתיחה מדויקת של המעי על נייר פילטר. זה מאפשר לרקמה להיות קבועה שטוחה, מניעת רקמה מסתלסלת פנימה בעת גלגול, וזה מועיל במיוחד בעת ניתוח רקמה דלקתית עם שרירים מעובים. בנוסף, חיוני להדגיש את התפקיד הקריטי של חתך רקמות בהשגת תוצאות אמינות. חתך נכון מבטיח שימור של ארכיטקטורת רקמות ומאפשר אימונוסטינה מדויקת, ובסופו של דבר תורם להצלחת הניתוחים במורד הזרם11. הגישה הממוטבת פחות קשה בהשוואה לפרוטוקולים אחרים, ומניבה תוצאות עקביות בקרב אנשים שונים. הטכניקה המוצגת במאמר זה מספקת גם ארכיטקטורת רקמות שהשתמרה היטב, רב-תכליתיות ו-immunostaining הניתן לשחזור באמצעות נוגדנים מגוונים.
היבט קריטי של פרוטוקול זה הוא זמן הקיבוע והעיבוד. קיבוע ועיבוד לא נכונים של רקמות עלולים לפגוע באנליזות היסטוכימיות. רקמה מקובעת יתר על המידה הופכת לפריכה, בעוד רקמה לא מקובעת נשארת רכה מדי. גם רקמות מוגזמות וגם רקמות לא מקובעות קשות לחיתוך ופוגעות בהכתמה חיסונית. לאחר הניתוח על נייר סינון, יש להכניס מיד את הרקמה לפורמלין כדי להפחית שינויים לאחר המוות22. בפרוטוקול זה, רקמת מורין קבועה בפורמלין בן לילה. מספר מחקרים השתמשו בזמן קיבוע זה 20,23,24. עם זאת, Boenisch et al. הראו כי immunostaining עקבי ברקמה קבועה פורמלין עד 4 ימים25. אופטימיזציה של זמן תיקון וקיבוע נדרש בהתאם לניתוחים הרצויים. לדוגמה, הקיבוע של קרנוי מועדף לעתים קרובות עבור כתמי ריר26. בחירת הקיבועים ומשך זמן הקיבוע צריכה להיות אופטימלית על ידי כל חוקר בהתאם לגישתו הניסויית. מומלץ להשתמש במעבד רקמות אוטומטי כדי להבטיח זמני עיבוד מדויקים ועקביים. המעבדה שלנו משתמשת בסיכות קטנות כדי להחזיק את רקמת המעי במקום כמו גלילים. ללא סיכות, הרקמה עלולה להתגלגל במהלך העיבוד. מכיוון שסיכות אלה די קטנות וחדות, יש לנקוט אמצעי זהירות. אנו ממליצים להשתמש בחותכי חוטים כדי להסיר את הקצה החד של הסיכה לפני עיבוד הרקמות. ליבות היסטולוגיה מסוימות לא יקבלו רקמות עם סיכות; לכן, עדיף לבדוק לפני השימוש. גישה חלופית היא להשתמש באגר כדי לעגן רקמות לפני עיבוד27 או שניתן להשתמש בספוגי קסטות בקלטות כדי לסייע בשמירה על גלילים.
Immunostaining הוא פרוטוקול הדורש אופטימיזציה עבור כל נוגדן. מומלץ להשתמש בנוגדנים מאומתים בנוקאאוט במידת האפשר. שיטה זו לקיבוע ועיבוד רקמות גורמת להכתמה ברורה, ומאפשרת זיהוי קל של קשירת נוגדנים בהשוואה לאות רקע כאשר נעשה שימוש בנוגדנים לא מאומתים. בחירה מקבעת, שליפת אנטיגן ודילול נוגדנים יכולים להשפיע על הספציפיות של הנוגדן. אנו ממליצים לחוקרים להעריך בזהירות ולייעל את הפרוטוקול על ידי התאמת הקיבוע, שליפת האנטיגן וזמן הדגירה עבור כל נוגדן. כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר, יש לבדוק נוגדנים בדילולים שונים כדי לקבוע ריכוז אופטימלי ובמאגרי שליפת אנטיגן שונים. שליפת אפיטופים משפרת את ההכתמה החיסונית על ידי שבירת גשרי מתילן שנוצרו במהלך הקיבוע. בפרוטוקול זה, נעשה שימוש בשליפת אפיטופים הנגרמת על ידי חום ולא בשליפת אפיטופים הנגרמת על ידי פרוטאוליטים, מכיוון שעיכול אנזים סביר יותר לשבש את מורפולוגיה של רקמות28. מאגרי שליפת האפיטופים הנפוצים ביותר הנגרמים על ידי חום הם חוצץ ציטראט, tris-HCl ו- tris-EDTA, כאשר חיץ ציטראט הוא העדין ביותר במורפולוגיית רקמות29. בחירת החיץ משתנה ויש לקבוע אותה עבור כל נוגדן. מאגרי אחזור אנטיגן רבים, פתרונות חסימה ודילולי נוגדנים זמינים באופן מסחרי. עם זאת, פתרונות אלה יכולים להיות יקרים מאוד וחסכוניים. סיפקנו מתכונים של פתרונות נפוצים לשליפת אנטיגן ופתרונות חסימה ודילול נוגדנים כדי להבטיח כדאיות כלכלית. 
מגבלה של שיטה זו היא שקיבוע ועיבוד יכולים לשנות אפיטופים של רקמות ומסכות. גישה חלופית היא immunostain רקמה קפואה טרייה. רקמה קפואה טרייה מוקפאת, ומאפשרת הימנעות מחשיפה לחומרים רעילים, שימור מבנה החלבונים ושיפור הנגישות של חלק מהאפיטופים. עם זאת, ארכיטקטורת הרקמה והמורפולוגיה גרועות יותר מאלה של רקמה קבועה ומשובצת פרפין. אתגרים נוספים של רקמות קפואות טריות כוללים את החומרים והלוגיסטיקה הנדרשים כדי לחתוך ולאחסן בלוקים ומגלשות קפואים. ניתוח של לחמניות שוויצריות לעומת רצועות של רקמת מעי מראה הבדלים בגובה וברוחב הווילי והבדלים בתאי החיסון בלמינה פרופריה, כפי שתואר בדו"ח מוקדם יותר30. תוצאות אלה מצביעות על כך שלחמניות שוויצריות במעיים משנות כמה תכונות מעיים, שיש לקחת בחשבון בעת תכנון ניסויים. בנוסף, נדרש אימות מחדש של נוגדנים מכיוון שנוגדנים רבים הנקשרים במיוחד לרקמה משובצת פרפין קבועה פורמלין אינם מכתימים היטב ברקמה קפואה טרייה31.
ניתן להשתמש ב-immunostaining של רקמת המעי כדי לענות על מגוון רחב של שאלות בנוגע לביולוגיה ופיזיולוגיה של תאי מערכת העיכול. טכניקה זו נמצאת בשימוש נרחב כדי לזהות שינויים אפיתל הגדרת דלקת מעיים, בעקבות זיהום חיידקי, ובמהלך התקדמות סרטן. השיטה המוצגת כאן אידיאלית לשימור רקמת המעי מכיוון שהיא חסכונית, לא מאתגרת מבחינה טכנית, וניתנת לשחזור ברמה גבוהה. כדי להבטיח את התוצאות הטובות ביותר, אנו מעודדים אופטימיזציה של השלבים המתוארים בפרוטוקול זה בהתבסס על תכנון הניסוי וההשערה הנבדקת.

הארכיטקטורה התאית של המעי מציבה אתגר ייחודי בשמירה על שלמותו המבנית כאשר רקמת המעי נשמרת לצורך צביעה חיסונית. המעי הדק מורכב ממבנים מוארכים דמויי אצבעות המכונים וילי1. וילי אלה לעתים קרובות הופכים מעוותים במהלך תהליכי הטמעה. הבטחת שלחוקרים יש טכניקות להטמעה נכונה של מעיים כדי להשיג חתכים, המאפשרים הדמיה של כל אזורי המעי, כמו גם את השכבות המרכיבות את המעי (כלומר, muscularis propria, רירית והסרוסה), היא חיונית לניתוח ניסויי חזק2. קיבוע לא מספק, קיבוע מוגזם וטיפול לא נכון ברקמות יפגעו בשלמות הרקמה, וכתוצאה מכך ייגרם נזק לא מכוון לאפיתל המעי 3,4. פגיעה באפיתל המעי במהלך שלבים אלה יכולה להפחית באופן משמעותי את איכות הניתוחים הבאים, כמו immunofluorescence, ללא קשר ליעילות של פרוטוקולים אימונוהיסטוכימיים ונוגדנים בשימוש.
אימונוסטיין, כמו קיבוע רקמות תקין, הוא חלק חשוב במחקר הביו-רפואי. כאשר הוא נעשה היטב, immunostaining יכול להאיר היבטים שלא היו ידועים בעבר של מבנה התא ותפקודו. צביעה אימונופלואורסצנטית של חלקי פרפין יכולה להיות מאתגרת עקב שינויים פיסיקוכימיים הנובעים מתהליך הקיבוע והטמעת הפרפין5. קיבוע והטמעת פרפין גורמים למיסוך אנטיגן שיכול להפריע לזיהוי אימונופלואורסנציה של אפיטופים מעניינים6. קיבוע מושהה עלול לגרום להתפרקות פרוטאוליטית, וכתוצאה מכך הכתמה מוחלשת או נעדרת של אפיטופים קריטיים7. בנוסף, נוגדנים הם לעתים קרובות לא מדויקים עם רמות גבוהות של רקע. פרוטוקולי אימונוסטיין המקדמים קשירת נוגדנים עקבית וספציפית ויחס אות לרעש גבוה יכולים לספק מידע רב ערך לחוקרים. 
כאן, אנו מספקים פרוטוקול מקיף שנועד להשיג תמונות אימונופלואורסנציה באיכות גבוהה באמצעות קיבוע רקמת מעי, הכנת גליל שוויצרי8 ו immunostaining. תוך שימת דגש על הנחיות לשמירה על שלמות המעי, הפרוטוקול נועד לספק לחוקרים מתודולוגיה חזקה לשיפור האיכות והאמינות של מחקרי הדמיה אימונופלואורסצנטית. ביקשנו גם להשתמש במשאבים חסכוניים, כולל נייר סינון ואחזור אנטיגן ביתי, פתרונות חסימה ודילול נוגדנים כדי להפוך את הפרוטוקול לנגיש יותר למעבדות שאולי הגבילו את הכספים. באשר לכל פרוטוקולי הניסוי, החוקרים צריכים לייעל את הפרוטוקול הנוכחי בהתבסס על הגישה הניסויית שלהם ותחומי העניין שלהם.

<table><tbody><tr><td>&beta;-CATENIN</td><td>GeneTex</td><td>GTX101435</td><td></td></tr><tr><td>נייר סינון תאית</td><td>Cytiva</td><td>10427804</td><td>נייר Whatman עבה</td></tr><tr><td>שקופיות זכוכית טעון</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23888114</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Epredia</td><td>152440</td><td></td></tr><tr><td>חיתוך סיכות גודל 00</td><td>Phusis</td><td>B082DH4TZF</td><td></td></tr><tr><td>E-CADHERIN</td><td>מו"פ D Systems</td><td>AF748</td><td></td></tr><tr><td>כפפות מקפיא</td><td>Tempshield</td><td>UX-09113-02</td><td></td></tr><tr><td>בלוק חימום</td><td>Premiere</td><td>XH-2001</td><td>מחמם שקופיות</td></tr><tr><td>Histo-Clear II</td><td>אלקטרונים מיקרוסקופיה מדעי</td><td>64111-04</td><td>מגיב ניקוי</td></tr><tr><td>Hoescht</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>עט הידרופובי</td><td>Millipore</td><td>402176</td><td></td></tr><tr><td>LAMININ</td><td>GeneTex</td><td>GTX27463</td><td></td></tr><tr><td>LAMP1</td><td>סנטה קרוז</td><td>SC-19992</td><td></td></tr><tr><td>קלטות גדולות</td><td>Tissue-Tek</td><td>4173</td><td></td></tr><tr><td>סיכות Minutien</td><td>כלי מדע עדינים NC9679721</td><td></td><td></td></tr><tr><td>עכבר על עכבר חסימת מגיב</td><td>מעבדות וקטור</td><td>MKB-2213</td><td>עכבר על עכבר בלוק</td></tr><tr><td>MUC2</td><td>GeneTex</td><td>GTX100664</td><td></td></tr><tr><td>PCNA</td><td>תא איתות טכנולוגיה</td><td>2586S</td><td></td></tr><tr><td>סיר לחץ</td><td>Cuisinart</td><td>B000MPA044</td><td></td></tr><tr><td>ProLong זהב antifade</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>P36934</td><td>הרכבה בינונית</td></tr><tr><td>מלקחיים פעולה הפוכה</td><td>Dumont</td><td>5748</td><td></td></tr><tr><td>Slide Rack</td><td>Tissue-Tek</td><td>62543-06</td><td></td></tr><tr><td>סט צביעת שקופיות</td><td>Tissue-Tek</td><td>62540-01</td><td>כלים עמידים בפני ממס ומסגרת מתכת</td></tr><tr><td>קלטות קטנות</td><td>Fisherbrand</td><td>15-200-403B</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ציטראט דיהידראט</td><td>פישר ביוריאגנטים</td><td>BP327-1</td><td></td></tr><tr><td>טלאושטיין ג'לטין</td><td>סיגמא</td><td>G7765</td><td>חסימת מאגר</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A16046</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J20605-AP</td><td></td></tr><tr><td>מגבונים</td><td>KimTech</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Xylenes</td><td>Fisher Chemical</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr><tr><td>&gamma;-ACTIN</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-65638</td><td></td></tr></tbody></table>

פרוטוקול ממוטב לגלילים שוויצריים במעי וצביעה אימונופלואורסצנטית של רקמה משובצת פרפין

Optimized Protocol for Intestinal Swiss Rolls and Immunofluorescent Staining of Paraffin Embedded Tissue

המעי הוא איבר מורכב המורכב מהמעי הדק והגס. המעי הדק יכול להיות מחולק עוד יותר תריסריון, jejunum, ו ileum. לכל אזור אנטומי במעי יש תפקיד ייחודי המתבטא בהבדלים במבנה התאים. חקירת שינויים במעי דורשת ניתוח מעמיק של אזורי רקמות שונים ושינויים תאיים שונים. כדי לחקור את המעי ולדמיין חתיכות גדולות של רקמה, חוקרים משתמשים בדרך כלל בטכניקה המכונה לחמניות שוויצריות מעיים. בטכניקה זו, המעי מחולק לכל אזור אנטומי קבוע בכיוון שטוח. לאחר מכן, הרקמה מגולגלת בזהירות ומעובדת להטבעת פרפין. קיבוע וכיוון נכונים של רקמות הם טכניקת מעבדה שלעתים קרובות מתעלמים ממנה, אך היא חשובה באופן קריטי לניתוח במורד הזרם. בנוסף, גלגול שוויצרי לא תקין של רקמת המעי עלול לפגוע באפיתל המעי השברירי, מה שמוביל לאיכות רקמה ירודה לצביעת מערכת החיסון. הבטחת רקמה קבועה היטב ומכוונת כראוי עם מבנים תאיים שלמים היא צעד חיוני המבטיח הדמיה אופטימלית של תאי המעי. אנו מציגים שיטה חסכונית ופשוטה להכנת לחמניות שוויצריות כדי לכלול את כל חלקי המעי בבלוק אחד משובץ פרפין. אנו מתארים גם צביעה אימונופלואורסצנטית אופטימלית של רקמת המעי כדי לחקור היבטים שונים של אפיתל המעי. הפרוטוקול הבא מספק לחוקרים מדריך מקיף להשגת תמונות אימונופלואורסנציה באיכות גבוהה באמצעות קיבוע רקמת מעי, טכניקת סוויס-רול וצביעת מערכת החיסון. שימוש בגישות מעודנות אלה משמר את המורפולוגיה המורכבת של אפיתל המעי ומטפח הבנה עמוקה יותר של הפיזיולוגיה של המעי והפתוביולוגיה.

בוצעה צביעת המטוקסילין ואוזין (H&amp;E), כפי שתואר קודם לכן12. בשיטה האופטימלית, לחמניות שוויצריות במעיים כללו את כל שלושת המקטעים של המעי הדק והמעי הגס בשקופית אחת. איכלוס המעי כולו בשקופית מאפשר לחוקרים לנתח שינויים בכל חלקי המעי וחוסך עלויות על ריאגנטים של חתך וצביעה (איור 1). כמו כן, חשיפת כל מקטעי המעי לאותם תמיסות בו זמנית כאשר immunostaining מסייעת להבטיח תוצאות מדויקות. מיקרוגרף H&amp;E מדגים את ארכיטקטורת המעי השמורה של כל חלקי המעי הדק והמעי הגס (איור 2). מדידה של וילי תריסריון לא הראתה הבדל משמעותי בגובה הווילי ברקמת מעי שלא נפתחה בהשוואה לשיטת גליל שוויצרית זו, מה שמרמז על כך שפתיחת המעי אינה משבשת את ארכיטקטורת הרקמה (איור 2D). Immunostaining של לחמניות שוויצריות המעי מראה את השכבות השונות של המעי, כמו גם את כל ציר הקריפטה villous. התמונות הפלואורסצנטיות מראות רמות רקע נמוכות מצביעת הנוגדנים הראשונית והמשנית ומתארות בבירור את התאים הבודדים הנמצאים באפיתל. איור 3 מראה את המורפולוגיה של מקטעי מעיים שונים ואת הצביעה של תאי גביע (תאים חיוביים MUC2)13, הקרום האפי (γ-ACTIN)14, הקרום הצידי של תאי אפיתל (E-CADHERIN)15 וגרעינים. פרוטוקול זה מתאים לזיהוי תאים רבים ושונים, כולל תאים שגשוגיים (PCNA)16, אינטרסטיציום (LAMININ; איור 4A) 17, התחום הליזוזומלי (LAMP1)14, והאפיתל (β-CATENIN; איור 4B) 18.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66977/66977fig01.jpg"> איור 1: תהליך עבודה להכנה ועיבוד של לחמניות שוויצריות במעיים. (A) מקטעי מעיים נשטפים עם מזרק המכיל PBS ולאחר מכן נשטפים ב-PBS. (B) רקמת מעי רטובה מונחת על נייר סינון יבש. (C) המעי נחתך לאורכו על נייר סינון ו-(D) נמרח בעדינות. (E) פיסת נייר סינון מונחת על גבי המעי הפתוח, והמעי נדחק בעדינות בין נייר הסינון לבין הסיכות. מקטעי המעי קבועים במהלך הלילה, ו-(F) מגולגל באמצעות מלקחיים. (G) המעי נעקר בעדינות מהמלקחיים הפועלים ההפוכים, ו-(H) יש לו מראה רוזטה. (ט, י) רקמת המעי נעוצה ומונחת בקלטת גדולה. (K) כל ארבעת מקטעי המעי מונחים באותה קסטה לצורך עיבוד רקמות והטבעתן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66977/66977fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66977/66977fig02v2.jpg"> איור 2: צביעת המטוקסילין ואאוזין בכל ארבעת חלקי המעי. (A) סריקת אריחים מדגימה את היכולת לדמיין את המעי כולו בשקופית אחת עם גלילים שוויצריים בודדים של התריסריון, הג'ג'ונום, האילאום והמעי הגס. (B) מיקרוגרף של גליל שוויצרי במעי ו-(C) כניסה בהגדלה גבוהה יותר כדי להראות ארכיטקטורת וילי וקריפטה. (D) כימות אורך המעי הדק במעי הדק לא מראה הבדל משמעותי בין רקמה מגולגלת שוויצרית לרקמה שלא נפתחה. פסי קנה מידה = 1000 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66977/66977fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66977/66977fig03.jpg"> איור 3: צביעה אימונופלואורסצנטית של כל ארבעת חלקי המעי. עכברי ביקורת בוגרים C57BL/6J עברו חיסון עבור גרעינים (ציאן), סמן הממברנה הצידית, E-CADHERIN (ירוק), תאי גביע שזוהו על ידי MUC2 (צהוב), וסמן גבול המברשת האפיקלית γ-ACTIN, (מגנטה). פסי קנה מידה = 50 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66977/66977fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66977/66977fig04.jpg"> איור 4. מכתים immunofluorescence של המעי. (A) מיקרוגרף מייצג של צביעה אימונופלואורסצנטית של מעי העכבר מדגיש גרעינים (ציאן), תאים מתרבים, PCNA (ירוק), ולמינה פרופריה, למינין (מגנטה). (B) תמונת זיהוי אימונופלואורסנציה (ציאן), סמן קרום התא β-CATENIN (ירוק), והסמן הליזוזום LAMP1 (מגנטה) במעי. פסי קנה מידה = 50 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66977/66977fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

המעי חיוני לעיכול וספיגה. כל אזור - תריסריון, ג'ג'ונום, איליאום, המעי הגס - משרת פונקציות נפרדות בשל מבנים תאיים ייחודיים. לימוד הפיזיולוגיה של המעי דורש ניתוח רקמות קפדני. פרוטוקול זה מתאר קיבוע ועיבוד רקמות בטכניקת הרול השוויצרית, ומבטיח אימונוסטיין מדויק באמצעות שימור וכיוון נכון של הרקמות.

The intestine is a complex organ composed of the small and the large intestines. The small intestine can be further divided into duodenum, jejunum, and ...

optimized-protocol-for-intestinal-swiss-rolls-immunofluorescent

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מדגים שיטה מבוססת אימונופלואורסנציה להדמיית תאי ציצית מעיים בקריוסקציות ג'ג'ונום של עכבר צף חופשי. בתוך וילי המעי, לוקליזציה משותפת של פלואורסצנטיות ירוקה בקצה הלומינלי עם מסת שורש אדומה מורחבת מצביעה על נוכחות של תאי ציצית.

שיטה מבוססת אימונופלואורסנציה להדמיית תאי Tuft בקריוקציות Jejunum

הפרוטוקול המתואר כאן מיועד להערכה מבנית של תכשיר רשתית שלם. זה כולל תיאורים של דיסקציה של רקמות, הרכבה על תוספת ממברנה פוליטטרפלואורואתילן הידרופילית (PTFE), העמסת בולוס עם סמנים פלואורסצנטיים, והשוואה של קיבוע עם קרבודימיד ופרפורמלדהיד לניתוח אימונוהיסטוכימי של רכיבים תאיים וסינפטיים.

פרוטוקול אופטימלי עבור רשתית Wholemount הכנה להדמיה ואימונוהיסטוכימיה

תאי אפיתל במעי גזע (ISCs) מתערבבים עם תאי פנט. תאים אלה נבדלים צאצאים של ISC, התומך בISCs ולספק הגנה אנטי-בקטריאלי. כאן אנו מדגימים כיצד אנו השתמשנו במודלי עכבר מהונדסים מותנים לקבוע כי תאי פנט לשחק תפקיד מכריע בשמירה על epithelia המעיים.

פרוטוקולים לניתוח תפקידם של תאי פנט התחדשות Murine המעי באמצעות מותנה<em&gt; Cre-לקס</em&gt; מודלי עכבר

זיהוי מדויק ומיקום של תאי אפיתל לאורך רירית רירית המעי חיוני להגדיר שושלות תאים שונות. הדמיה תקינה של רקמות מעי היא קריטית לזיהוי דפוסי ביטוי חלבון עם רזולוציה מקסימלית. מחקר זה נועד להתוות שיטות האופטימליות ותנאי רקמות מעי עכבר עיבוד.

טכניקה Swiss-מתגלגל משופר עבור הכנת רקמת המעי עבור immunohistochemical ו ניתוח Immunofluorescent

אנו מציגים פרוטוקולים עבור בידוד של מעיים 3D מבנים מרקמות ויוו ומוטבעים במבחנה המרתף מטריקס organoids, ואת קיבוע שונות פרט מכתים פרוטוקולים אופטימיזציה עבור תיוג חיסונית של microtubule, חלבונים centrosomal, מהחיבור באותה מידה כמו תא סמני כולל החלבון בתאי גזע Lgr5.

חיסונית-פלורסנט תיוג של Microtubules וחלבונים Centrosomal Vivo לשעבר רקמת המעי ו 3D במבחנה Organoids מעיים

. Kuga et al. גילה כי זרחון-סטטוס נוגדנים ספציפיים נגד אקטין מחייב חלבון girdin phosphorylated-טירוזין 1798 (pY1798) יכול לשמש כדי לתייג אניץ תאים (TCs). פרוטוקול זה מאפשר הדמיה חזקה של TCs באמצעות צביעת immunofluorescent של מעי צם לתרשים cryosections עם נוגדנים pY1798.

השימוש נוגדנים Anti-פוספו-girdin להמחיש אניץ מעיים בתאי עכבר לתרשים מעי צם Cryosections

ניקוד שיטתי של דלקת מעיים באמצעות מערכת חופשית בסיוע מחשב הוא כלי רב עוצמה להשוות כמותית שינויים היסטופטולוגיים במודלים קוליטיס המאופיינת על ידי נוכחות של כיבים ושינויים דלקתיים. הערכת ניקוד קוליטיס היסטולוגית מחזקת תצפיות קליניות ומאפשרת פרשנות נתונים.

ניתוח ניקוד שיטתי עבור דלקת מעיים במודל קוליטיס נתרן סולפט הנגרמת על ידי מורין

פרוטוקול יעיל זה מפרט זרימת עבודה לזיהוי ותמונה של חיידקים בדגימות רקמות מורכבות, החל מתיקון הרקמה ועד להכתמת חיידקים עם פלואורסצנטיות בהכלאה במקום .

הדמיה של אינטראקציות מארחות מיקרוביוטה במעיים באמצעות פלואורסצנטיות בהכלאה במקום , כתמי לטין והדמיה

הפרוטוקול המפורט שלנו מתאר את היצירה והשימוש במודל מעי על שבב מתקדם, המדמה רירית מעיים אנושית עם מבנים תלת-ממדיים וסוגי תאים שונים, ומאפשר ניתוח מעמיק של תגובות חיסוניות ותפקודים תאיים בתגובה להתיישבות מיקרוביאלית.

מודל מעי-על-שבב חיסוני לניתוח תגובות חיסוניות של רירית המעי

פרוטוקול זה מתאר שיטת צביעת חיסון לכל הקיבה, שעובדה על ידי טכניקת "Swiss roll" שפותחה במקור למעי העכברים.

מיפוי מרחבי משופר של שכבות שרירי הקיבה בעכברים באמצעות טכניקת גלגול שוויצרית מותאמת

למד טכניקת גלילים שוויצריים לקבלת תוצאות עקביות ואמינות בצביעה אימונופלואורסצנטית של מעי עכברים. פרוטוקול זה מאפשר הדמיה מפורטת של כל אזורי המעי בבלוק פרפין אחד וחוסך משאבים.

פרוטוקול ממוטב לגלילים שוויצריים במעי וצביעה אימונופלואורסצנטית של רקמה משובצת פרפין

גלה סרטונים נוספים