הנדסת חלבונים על ידי תצוגת פני שטח שמרים

במעבדה שלי אנחנו מהנדסים את הדור הבא של טיפולים תאיים על ידי שילוב של הנדסת חלבונים עם הנדסה תאית. לכן אנו מהנדסים רכיבי חלבון כדי להשיג פונקציות חדשות או לשפר תפקודים קיימים, ולאחר מכן משלבים חלבונים ריקים אלה בטיפולים תאיים. פיתחנו עוד יותר תצוגת משטח לשימוש עבור יישומים מיוחדים, כולל הנדסת יציבות חלבונים, הנדסה של מתגי חלבון מווסתים של מולקולות קטנות, ומיקוד ספציפי של אישורי קולטן פעיל הקשורים לסרטן.

היתרון של תצוגת משטח שמרים בהשוואה לטכנולוגיות תצוגה אחרות כגון תצוגת פאגים או ריבוזום, הוא ההדמיה הציטומטרית של הזרימה של הספרייה בתהליך המיון ובקרה מדויקת של תנאי הבחירה, כגון ריכוז האנטיגן וקשיחות שער המיון. כדי להתחיל, להכין את החרוזים לבחירת החרוזים הראשונה על ידי השעיה מחדש של 10 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים קושר ביוטין ב 990 מיקרוליטר של PBSA. לכביסה, הניחו את הצינור על מדף מגנטי למשך שתי דקות כשהמכסה פתוח.

לאחר מכן הסר בזהירות את supernatant. השהה מחדש את החרוזים השטופים בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר במיליליטר אחד של PBSA עם 6.7 עד 33 פיקומולי של אנטיגן ביוטינילציה. לאחר הדגירה, הניחו את הצינור על מדף מגנטי למשך שתי דקות כשהמכסה פתוח, הסירו את הסופרנאטנט ושטפו את החרוזים הטעונים באנטיגן במיליליטר אחד של PBSA.

לאחר שהחרוזים מתיישבים, הסר את PBSA. ואז להשעות מחדש את חרוזי האנטיגן טעון ב 50 מיקרוליטר של PBSA. הכינו את התאים, חרוזי האנטיגן ותמיסה של חרוזי דובים לבחירות שליליות.

לאחר השטיפה, יש להשהות מחדש את חרוזי האנטיגן ב-50 מיקרוליטר של PBSA ולהשעות מחדש את חרוזי הדוב ב-150 מיקרוליטר של PBSA. עבור הבחירה השלילית הראשונה, להוסיף 50 מיקרוליטר של חרוזים חשופים שטופים 950 מיקרוליטר של תאים שטופים PBSA לדגור על התערובת במשך 1.5 שעות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, הניחו את הצינורות המכילים את מתלי תאי חרוזי הדוב על מדף מגנטי כשהמכסה פתוח.

פיפטה כל נוזל במכסה לתוך הצינור, ולחכות שתי דקות. לאחר מכן מעבירים את התאים הלא קשורים לצינור מיקרו צנטריפוגה טרי ומוסיפים 50 מיקרוליטר של חרוזי דוב שטופים. לאחר שלושה סבבים של ברירה שלילית, הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת חרוזים טעונה אנטיגן לתאים.

דוגרים במשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס. כעת הניחו את התאים המכילים את החרוזים הטעונים באנטיגן על מדף מגנטי כשהמכסה פתוח. פיפטה כל נוזל שנמצא במכסה לתוך הצינור.

המתן שתי דקות לפני השלכת תאים לא מאוגדים. בצע את כל השלבים הנותרים כמתואר לבחירת חרוזי האנטיגן הראשונה. לאחר שלוש ברירה שלילית ואחת חיובית, יש להשהות מחדש תאים במהירות במיליליטר אחד של SDCAA ולהעביר לבקבוק שייקר המכיל נפח גדול יותר של SDCAA.

לאחר אינדוקציה לילית של ביטוי פני השטח של חלבונים ב-SGCAA בספריות שמרים, יש מספיק תאים כדי לכסות את המגוון הגדול פי 10 ולהשליך את הסופרנטנט. השהה מחדש את הגלולה ב- PBSA והעבר אותה לצינורות מיקרו צנטריפוגות. השתמש 30 מיליון תאים עבור צביעה בכל צינור.

הכינו כמה שיותר צינורות בהתאם לגיוון, כולל צינור בקרה אחד ללא האנטיגן. ואז צנטריפוגה את הצינורות ב 2000 x גרם במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. יש להשהות מחדש את הגלולה ב-200 מיקרוליטר של PBSA המכיל את האנטיגן, ולדגור במשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר ביצוע הצנטריפוגה פעם נוספת, להסיר PBSA מן הכדור. לאחר מכן, יש להשהות מחדש את התאים ב-100 מיקרוליטר של PBSA קר המכיל נוגדנים לצביעת תצוגה ולזיהוי אנטיגן. דוגרים במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר הדגירה, צנטריפוגה את התאים ב 2000 x גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. מוסיפים מיליליטר אחד של PBSA לגלולה וחוזרים על הצנטריפוגה. לאחר מכן להסיר את רוב supernatant, משאיר רק 20 עד 30 מיקרוליטר כדי למנוע את הגלולה להתייבש.

השהה מחדש את הגלולה ב- PBSA קר ממש לפני המיון. כעת מיין את התאים ישירות לתוך SDCAA מדיום. לאחר המיון, מעבירים את התאים לבקבוק שייקר המכיל נפח גדול יותר של מדיום SDCAA ודגרים ב-30 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-180 סל"ד.