Name: הנדסת חלבונים על ידי תצוגת פני שטח שמרים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-29T13:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: למדו הנדסת חלבונים באמצעות תצוגת פני שטח שמרים לזיהוי וריאנטים המיקשורים לאנטיגנים. השיטה מאפשרת שליטה מדויקת בתנאי הבחירה ויזואליזציה ציטומטרית בזרימה לפיתוח תרפיות תאיות מתקדמות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>אופטימיזציה של תפקודי חלבונים באמצעות טכניקות תצוגת פני שטח של שמרים

תצוגת פני שטח של שמרים היא אחת הטכנולוגיות המרכזיות בתחום הנדסת החלבונים. הוא מאפשר בחירה של גרסאות חלבון עם תכונות רצויות כגון זיקה משופרת או יציבות. היא הוצגה לראשונה בשנת 19971, והיא אחת מטכנולוגיות התצוגה הנפוצות ביותר מלבד תצוגת פאגים 2,3, תצוגת ריבוזום4 ותצוגת תאי יונקים 5,6,7. חלבון העניין (POI) מוצג על פני השטח של תאי שמרים על ידי התכה שלו כדי לעגן חלבונים. קיים מגוון של חלבוני עוגן שונים, ובדרך כלל, נקודת העניין מאוחה למסוף C של חלבון ההזדווגות אגלוטינין שמרים Aga2p 1,8. נוסף על כך, נקודת העניין בדרך כלל מוקפת בשני תגים, כגון תג המגלוטינין (HA-tag) ותג c-myc, המאפשר זיהוי של רמת התצוגה באמצעות נוגדנים מסומנים פלואורסצנטית וציטומטריית זרימה (איור 1A). קמפיינים טיפוסיים לבחירת שמרים כוללים שילוב של בחירת חרוזים מגנטיים ומיון ציטומטרי זרימה. בחירת החרוזים מאפשרת טיפול במספרי תאים גדולים והעשרה של וריאנטים חלבוניים הנקשרים לאנטיגן המטרה גם עם זיקות נמוכות, מאחר שאינטראקציות רב-ערכיות עם החרוזים הטעונים באנטיגן מובילות להשפעות אווידיות, ולכן מונעות אובדן של וריאנטים בעלי זיקה נמוכה (איור 1B). ניתוח ציטומטרי זרימה ובחירה מציעים את היתרון של הדמיה של קשירת גרסאות POI המוצגות לאנטיגן המסומן. כתוצאה מכך, ניתן למיין ולטפח את אוכלוסיות הקשירה, מה שמוביל להעשרת וריאנטים חלבוניים בעלי תכונות רצויות לאורך מספר סבבי מיון. יתר על כן, ניתן לבצע סבבים נוספים של מוטגנזה אקראית כדי להגדיל עוד יותר את המגוון, ומכאן, את הסבירות למצוא מוטציות נוספות התורמות לזיקה ו / או יציבות של החלבון.
תצוגת פני השטח של שמרים מציגה יתרונות מסוימים, כגון (א) מנגנון ביטוי אאוקריוטי, המאפשר קיפול חלבונים חמצוני וכן שינויים אאוקריוטים לאחר תרגום (כגון N-גליקוזילציה), (ב) נורמליזציה של ביטוי עקב זיהוי שני תגי הפפטיד הצמודים לחלבון, (ג) בדיקה חזותית של התקדמות הבחירה על ידי ציטומטריית זרימה (למשל, אחוז התאים הקושרים ועוצמת הקשירה) ו-(ד) האפשרות לנתח מוטציות חלבוניות בודדות על שמרים (למשל, ניתוח יציבות תרמית כמו גם זיקה), המציגים חלופה חוסכת זמן לביטוי וטיהור חלבון מייגע9. למעשה, הן זיקות (ערכי KD) והן יציבויות (ערכי T50) של חלבונים המוצגים בפני השטח של שמרים הראו מתאם טוב עם נתונים שהתקבלו בשיטות ביופיזיקליות וחלבונים מסיסים 9,10,11,12. תצוגת פני השטח של שמרים שימשה להנדסה של מגוון חלבונים, למשל, מקטעי נוגדנים 13,14,15,16, תחום פיברונקטין סוג III10 17,18, rcSso7d19,20, או קשרטין21. באופן דומה, מחקר מקיף נערך כדי לייעל את עיצובי ספריית השמרים על ידי שינוי המיקומים האקראיים, כמו גם שימוש בקודון חומצות אמינו 17,22,23. תצוגת פני השטח של שמרים הוכחה כמוצלחת בהנדסת יציבות 14,15,24,25, זיקה 18,26,27, פעילות אנזימטית 28,29,30,31 וביטוי חלבונים 32. בנוסף, יישומים מתוחכמים יותר כמו קשירה מותנית בנוכחות או היעדר מולקולה קטנה הושגו באמצעות תצוגת משטח שמרים20.
בפרוטוקול זה, אנו מתארים את כל השלבים החיוניים למסע בחירה עם תצוגת משטח שמרים עם הדוגמה של ספריית G4 (המבוססת על תחום פיברונקטין סוג III10, Fn3) שנבחרה כנגד חלבון קושר רטינול אנושי אנטיגן 4 (hRBP4) בנוכחות המולקולה הקטנה A112020. סלקציה זו נערכה כדי להניב אינטראקציה חלבון-חלבון התלויה במולקולה קטנה שיכולה לשמש כמתג מולקולרי. יש לציין כי בעוד שגישות חלופיות אפשריות עם תצוגת משטח שמרים, בחירות שמרים טיפוסיות בדרך כלל שואפות להיקשר לאנטיגן מטרה ללא כל זיקה קודמת לקשירה. אנו מכסים את כל השלבים של קמפיין בחירת שמרים, הכולל טיפוח ספריית שמרים, בחירת חרוזים, מיון ציטומטרי זרימה והבשלת זיקה על ידי PCR נוטה לשגיאות (epPCR). לכן, פרוטוקול זה משלים פרוטוקולים קודמים של תצוגת פני שטח של שמרים33,34 וניתן להשתמש בו כבסיס לבחירות תצוגה של פני השטח של שמרים (איור 1) עם כל ספריית שמרים נתונה ואנטיגן מטרה לפי בחירה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66994/66994fig1v5.jpg"> 
איור 1: עקרון תצוגת פני השטח של שמרים ותהליך עבודה טיפוסי עבור בחירות של משטחי שמרים. (A) נקודת העניין משוכפלת לתוך וקטור תצוגת פני שטח שמרים ובדרך כלל מוקפת בתג N-terminal HA- ובתג c-myc מסוף C. המבנה מאוחה לחלבון ההזדווגות של השמרים Aga2p לתצוגה על פני השטח. החלבון המתואר הוא הקלסר המהונדס "RS3" ממזהה PDB: 6QBA20. (B) תרשים זרימה הממחיש תהליך עבודה טיפוסי עבור קמפיינים לבחירת משטחי שמרים, המשלבים העשרה של גרסאות חלבון עם תכונות רצויות על ידי בחירת חרוזים ומיון ציטומטרי זרימה, כמו גם epPCR להבשלת אהדה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66994/66994fig1largev5.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<table><tbody><tr><td>10-בטא מוכשרים חשמליים E. coli&nbsp;</td><td>NEB</td><td>C3020K</td><td></td></tr><tr><td>Agar-Agar, Kobe I</td><td>Carl Roth</td><td>5210.5</td><td></td></tr><tr><td>מלח נתרן Ampicillin</td><td>Carl</td><td>Roth K029.2</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן Anti-c-myc, שיבוט 9E10, AF488</td><td>Invitrogen</td><td>MA1-980-A488 (Thermo Fisher)</td><td></td></tr> <tr><td>נוגדן נגד c-myc, שיבוט 9E10, AF647</td><td>Invitrogen</td><td>MA1-980-A647 (Thermo Fisher)</td><td></td></tr> <tr><td>נוגדן נגד HA, שיבוט 16B12, AF488</td><td>BioLegend</td><td>901509 (Biozym)</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד HA, שיבוט 16B12, AF647</td><td>BioLegend</td><td>682404 (Biozym)</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>NEB</td><td>R3136S</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין, חלק אתנול קר</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>חומצת לימון מונוהידראט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1909</td><td></td></tr><tr><td>D-Galactose</td><td>קארל רוט</td><td>4987.2</td><td></td></tr><tr><td>D-גלוקוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Difco שמרים בסיס חנקן</td><td>בקטון דיקינסון (BD)&nbsp;</td><td>291940</td><td></td></tr><tr><td>די-נתרן מימן פוספט הפטהידראט</td><td>קארל רוט</td><td>X987.3</td><td></td></tr><tr><td>DL-דיתיותרייטול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>D-סורביטול</td><td>קארל רוט</td><td>6213.1</td><td></td></tr><tr><td>דולבקו' s פוספט חוצץ מלח (10x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads קלסר ביוטין</td><td>Invitrogen</td><td>11047 (Fisher Scientific)</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 מגנט</td><td>תרמו פישר</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>EBY100</td><td>ATCC</td><td>MYA-4941</td><td></td></tr><tr><td>קובטת אלקטרופורציה 1 מ"מ (עבור E.coli)VWR</td><td></td> <td>732-1135</td><td></td></tr><tr><td>קובטה אלקטרופורציה 2 מ"מ (לשמרים)</td> <td>VWR</td><td>732-1136</td><td></td></tr><tr><td>אתנול מוחלט</td><td>MERCK</td><td>1070172511</td><td></td></tr><tr><td>GeneMorph II ערכת מוטגנזה אקראית</td><td>Agilent Technologies</td><td>200550</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Bacto Casamino</td><td>Acids Becton Dickinson (BD)</td><td>223120</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>AppliChem</td><td>131339.1211</td><td></td></tr><tr><td>LE agarose& נ.ב.פ;</td><td>Biozym</td><td>840004</td><td></td></tr><tr><td>ליתיום אצטט דיהידראט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4158</td><td></td></tr><tr><td>Monarch DNA ערכת מיצוי ג'ל</td><td>NEB</td><td>T1020S</td><td></td></tr><tr><td>Monarch PCR & ערכת ניקוי DNA</td><td>NEB</td><td>T1030S</td><td></td></tr><tr><td>Multifuge 1S-R</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NheI-HF</td><td>NEB</td><td>R3131S</td><td></td></tr><tr><td>מדיום צמיחה</td><td>NEB</td><td>B9035S</td><td></td></tr><tr><td>pCTCON2</td><td>Addgene</td><td>#41843</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין G מלח נתרן</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן פנטה-שלו, AF488</td><td>Qiagen</td><td>35310</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן פנטה-שלו, AF647</td><td>Qiagen</td><td>35370</td><td></td></tr><tr><td>פפטון אקס קזאין מעוכל טריפטית</td><td>קארל רות'</td><td>8986.3</td><td></td></tr><tr><td>Q5 DNA פולימראז בנאמנות גבוהה&nbsp;</td><td>NEB</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>SaII-HF</td><td>NEB</td><td>R3138S</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אצטט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S8750-1KG</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>קארל רוט</td><td>3957.2</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דימימן פוספט מונוהידרט</td><td>קארל רוט</td><td>K300.2</td><td></td></tr><tr><td>מסנן עליון בקבוק הברגה Steritop</td><td>MERCK</td><td>S2GPT01RE</td><td></td></tr><tr><td>סטרפטווידין, AF488</td><td>Invitrogen</td><td>S32354 (תרמו פישר)</td><td></td></tr><tr><td>סטרפטווידין, AF647</td><td>Invitrogen</td><td>S32357 (תרמו פישר)</td><td></td></tr><tr><td>סטרפטומיצין סולפט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S6501</td><td></td></tr><tr><td>תלת-נתרן ציטראט דיהידרט</td><td>קארל רוט</td><td>4088.1</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis ספקטרופוטומטר</td><td>אג'ילנט</td><td>8453</td><td></td></tr><tr><td>תמצית שמרים, מיקרו-גרגירי</td><td>קארל רוט</td><td>2904.4</td><td></td></tr><tr><td>Zymoprep שמרים פלסמיד Miniprep II</td><td>מחקר Zymo</td><td>D2004&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

הנדסת חלבונים על ידי תצוגת פני שטח שמרים

Protein Engineering by Yeast Surface Display

ספריית G4 נבחרה כנגד האנטיגן hRBP4 הקשור לתרופה המולקולה הקטנה A1120. צביעת הספריות לצורך מיון ציטומטרי של זרימה בוצעה כמתואר בשיטה 6, ואסטרטגיית הגאטינג המיושמת מוצגת באיור 2A. השער הראשוני כלל את כל התאים בהתבסס על מורפולוגיה של התא, והשער השני (היסטוגרמה של FSC-Width) הראה אסטרטגיית gating מחמירה שהוחלה לבחירת תאים בודדים ולהסרת צברי תאים. השער השלישי והאחרון הראה תצוגה של וריאנטים חלבוניים (ציר x) לעומת קשירת אנטיגן (ציר y). תאי שמרים המציגים אותות תצוגה וקשירה מוינו. חשוב לציין, שער המיון נקבע בצורה מחמירה כדי להעשיר תחומי קשירה באות מחייב גבוה ולכן זיקה גבוהה. הבחירה הקפדנית הזו הניבה העשרה של הצגת תאי שמרים שנקשרים באופן ספציפי לאנטיגן המטרה לאורך כל מסע הבחירה (איור 2B). בסבבי מיון ציטומטריים מאוחרים יותר, ריכוז האנטיגן ירד פי 10 (מ-100 ננומטר ל-10 ננומטר). לכן, אות הקשירה הכולל הופחת, ורק קלסרים עם זיקה גבוהה עדיין היו ניתנים לזיהוי ולמיון (איור 2C).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66994/66994fig2v5.jpg"> 
איור 2: תוצאות מייצגות מבחירת משטח שמרים של ספריית G4 מבוססת Fn3 לצורך קשירה לאנטיגן (hRBP4 בנוכחות A1120). (A) אסטרטגיית הגאטינג הכללית למיון ספריות שמרים. השער הראשון (FSC לעומת SSC) הוא לבחור את כל תאי השמרים ולא לכלול אירועי פיזור; השער השני (היסטוגרמה של FSC-W) נועד להסיר צברי תאים ולבחור רק תאי שמרים בודדים. השער השלישי משרטט את רמת תצוגת פני השטח (זיהוי תג HA או c-myc) לעומת קשירה לאנטיגן (כאן hRBP4 בנוכחות 5 מיקרומטר A1120, שזוהה על ידי נוגדן אנטי-שלו). בנוסף, הספרייה הוכתמה בנוגדנים משניים בלבד (ללא אנטיגן), שם לא צפויה קשירת אנטיגן. תאים ממוינים מסומנים בכחול. (B) אבולוציה של ספריית G4 לאורך 3 סבבים של מיון ציטומטרי זרימה. ניתן לצפות בהעשרת האוכלוסייה המחייבת בכל סבב סלקציה. (C) השימוש בריכוזי אנטיגן נמוכים יותר מאפשר בחירה של וריאנטים חלבוניים בעלי זיקה גבוהה יותר לאנטיגן המטרה. עם הפחתת ריכוז האנטיגן (כאן hRBP4) פי 10, מופיעים אלכסונים שונים, המעידים על נוכחות של שיבוטים בעלי זיקה גבוהה יותר (תאים ממוינים, כחולים) או נמוכה יותר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66994/66994fig2largev5.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Protein engineering enables the improvement of existing functions of a given protein or the generation of novel functions. One of the most widely used and ...

protein-engineering-by-yeast-surface-display

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבנייה וסינון של ספריות מוטנטיות עבור מסעות אבולוציה מכוונים ב-Saccharomyces cerevisiae.

בימוי שיטת אבולוציה<em&gt; שמר האפייה</em&gt;: יצירת ספריית Mutant והקרנה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשימוש במצעים המוצגים על פני השטח של שמרים לבדיקות שינוי אנזימטיות. הפלטפורמה הודגמה באמצעות ניתוח פעילות הדפוספורילציה של טירוזין פוספטאז SHP-2 כנגד אחד המצעים שלו כבדיקת שינוי אנזימטי מייצגת.

שינוי אנזימטי והערכת ציטומטריית זרימה של חלבונים המוצגים על פני השטח של שמרים

פיתחנו מטריצה ​​ריאות decellularized תאיים ו bioreactor הרומן biomimetic שניתן להשתמש בהם כדי לייצר רקמת הריאה תפקודית. על ידי זריעת תאים לתוך המטריצה ​​ו culturing ב bioreactor, אנו מייצרים רקמה מדגים חילוף הגזים יעיל כאשר מושתלים in vivo לתקופות קצרות של זמן.

נוהל הנדסה ריאות

אנו מתארים שיטה למדידת אנרגיה מחייב, כפי שבא לידי ביטוי מתח הפנים רקמות, בין תאים בתוך הרקמה, כמו אגרגטים 3D. הבדלים מתח הפנים רקמות הוכחו לתאם עם הפולשנות של ריאות, שרירים, גידולים במוח, הם הגורמים הבסיסיים של כינון יחסים מרחביים בין סוגי תאים שונים.

מדידה של לכידות צבירה ידי Tensiometry Surface רקמות

טכניקה צדדי ליתוגרפיה פלזמה פותחה כדי ליצור דפוסים משטח יציב להדרכת מצורף הסלולר. טכניקה זו יכולה להיות מיושם כדי ליצור רשתות התא כולל אלה המחקות רקמות טבעיות שימש לחקר מספר סוגי תאים שונים.

Surface פלזמה ליתוגרפיה דפוסים של יצירת רשתות Cell

העיצוב של קידוד סינטטי אופרון גם מנגנון ההפרשה ומונומרים המבניים של סיבי curli מתואר. ייצור יתר של amyloids אלה ופולימרי חסיד מאפשר מדידת רווח של היצמדות...

הנדסת חיידקי חסיד ידי יצירת Curli אופרון סינטטי יחיד

ניתן לשלב nanosensors סול ביולוגית pH מגיב לפולי (חומצה לקטית-Co-גליקולית) (PLGA) פיגומי electrospun. פיגומי דיווח עצמיים המיוצרים יכולים לשמש לניטור באתר של תנאי microenvironmental תוך תאי culturing על הפיגום. זה מועיל כמבנה התאי 3D יכול להיות במעקב בזמן אמת מבלי להפריע לניסוי.

פיגומים דיווח עצמי לתרבית תאים 3-Dimensional

שיטה להשיג nanofibers וננו המורכב מחלבונים מטריצת חוץ תאיים בודדים או מרובים מתוארת. שיטה זו משתמשת באינטראקציות חלבון פני השטח כדי ליצור חומרים המבוססים על חלבונים חופשיים עומדים עם הרכב מתכונן וארכיטקטורה לשימוש במגוון רחב של יישומי הנדסה וביוטכנולוגיה רקמות.

Nanofibers חלבון ECM ועצרת ביוזמת פני שטח באמצעות ננו תכנון הנדסי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המסביר את השימוש במיקרוסקופ כוח בדיקה קלווין ככלי ליצירת מפות פוטנציאל פני השטח ברזולוציה גבוהה בקנה מידה ננומטרי. כלי זה יושם כדי להעריך את תפקיד פוטנציאל פני השטח על יכולת הקישור של מיקרואורגניזמים למשטחי מצע.

משטח מדידת פוטנציאל של חיידקים באמצעות קלווין Probe מיקרוסקופית כוח

זהו קו מנחה לבניית רקמת כלי דם in vivo באמצעות לולאה עורקית מיקרו-כירורגית או תצורת פדיקל זורם בתוך תא הנדסת רקמות. ניתן להשתמש ברקמות כלי הדם שנוצרות להתחדשות איברים והחלפת פגמים ברקמות, כמו גם לבדיקת תרופות ומודלים של מחלות.

הנדסת רקמות ידי עצמותי כלי דם בתוך<em&gt; In vivo</em&gt; הנדסת רקמות קאמרית

למדו הנדסת חלבונים באמצעות תצוגת פני שטח שמרים לזיהוי וריאנטים המיקשורים לאנטיגנים. השיטה מאפשרת שליטה מדויקת בתנאי הבחירה ויזואליזציה ציטומטרית בזרימה לפיתוח תרפיות תאיות מתקדמות.

הנדסת חלבונים על ידי תצוגת פני שטח שמרים

גלה סרטונים נוספים