Name: בדיקת ליגנד קרבה למיקום חלבונים באתרי נזק לדנא (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-02T14:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: למד לזהות אינטראקציות חלבונים באתרי נזק ל-DNA באמצעות שיטת PLA וצביעת Gamma-H2AX בתאי U2OS. הפרוטוקול מאפשר אפיון מרחבי וזמני של אינטראקציות לצורך מחקר ביולוגי ופיתוח תרפיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>הערכת אינטראקציה בין חלבונים ולוקליזציה בנזק לדנ"א

<ol><li>Xiao, W., Samson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+evidence+for+endogenous+DNA+alkylation+damage+as+a+source+of+spontaneous+mutation+in+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo evidence for endogenous DNA alkylation damage as a source of spontaneous mutation in eukaryotic cells.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 90 (6), 2117-2121 (1993).</li>
<li>Lindahl, T., Barnes, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+endogenous+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Repair of endogenous DNA damage.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 65, 127-134 (2000).</li>
<li>DNA damage, aging, and cancer. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22N+Engl+J+Med%22">N Engl J Med</a>. Hoeijmakers Jan, H. J. 361 (15), 1475-1485 (2009).</li>
<li>Giglia-Mari, G., Zotter, A., Vermeulen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA damage response.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (1), a000745(2011).</li>
<li>Ciccia, A., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+damage+response%3A+Making+it+safe+to+play+with+knives%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The DNA damage response: Making it safe to play with knives.</a> Mol Cell. 40 (2), 179-204 (2010).</li>
<li>Chatterjee, N., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+DNA+damage%2C+repair+and+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22EnvironMol+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of DNA damage, repair and mutagenesis.</a> EnvironMol Mutagen. 58 (5), 235-263 (2017).</li>
<li>Mah, L. J., El-Osta, A., Karagiannis, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GammaH2AX%3A+a+sensitive+molecular+marker+of+DNA+damage+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">GammaH2AX: a sensitive molecular marker of DNA damage and repair.</a> Leukemia. 24 (4), 679-686 (2010).</li>
<li>Paull, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+histone+H2AX+in+recruitment+of+repair+factors+to+nuclear+foci+after+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage.</a> Curr Biol. 10 (15), 886-895 (2000).</li>
<li>Nakamura, A. J., Rao, V. A., Pommier, Y., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complexity+of+phosphorylated+H2AX+foci+formation+and+DNA+repair+assembly+at+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle+%28Georgetown%2C+Tex%29%22%5BJournal%5D)">The complexity of phosphorylated H2AX foci formation and DNA repair assembly at DNA double-strand breaks.</a> Cell cycle (Georgetown, Tex). 9 (2), 389-397 (2010).</li>
<li>Karchugina, S., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+heterodimerization+of+protein+isoforms+using+an+in+situ+proximity+ligation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of heterodimerization of protein isoforms using an in situ proximity ligation assay.</a> J Vis Exp. (140), (2018).</li>
<li>Tubbs, E., Rieusset, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+endoplasmic+reticulum+and+mitochondria+interactions+by+in+situ+proximity+ligation+assay+in+fixed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Study of endoplasmic reticulum and mitochondria interactions by in situ proximity ligation assay in fixed cells.</a> J Vis Exp. (118), (2016).</li>
<li>Nguyen, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nek4+regulates+entry+into+replicative+senescence+and+the+response+to+DNA+damage+in+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+CellBiol%22%5BJournal%5D)">Nek4 regulates entry into replicative senescence and the response to DNA damage in human fibroblasts.</a> Mol CellBiol. 32 (19), 3963-3977 (2012).</li>
<li>Basei, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+interaction+partners+for+Nek4.1+and+Nek4.2+isoforms%3A+from+the+DNA+damage+response+to+RNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Sci%22%5BJournal%5D)">New interaction partners for Nek4.1 and Nek4.2 isoforms: from the DNA damage response to RNA splicing.</a> Proteome Sci. 13 (1), 11(2015).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Animal+Cell+Culture+Guide%22">Animal Cell Culture Guide</a>. , https://www.atcc.org/resources/culture-guides/animal-cell-culture-guide (2024).</li>
<li>Soubeyrand, S., Pope, L., Haché, R. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topoisomerase+II%CE%B1-dependent+induction+of+a+persistent+DNA+damage+response+in+response+to+transient+etoposide+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22MolOncol%22%5BJournal%5D)">Topoisomerase IIα-dependent induction of a persistent DNA damage response in response to transient etoposide exposure.</a> MolOncol. 4 (1), 38-51 (2010).</li>
<li>Wei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Etoposide-induced+DNA+damage+affects+multiple+cellular+pathways+in+addition+to+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Etoposide-induced DNA damage affects multiple cellular pathways in addition to DNA damage response.</a> Oncotarget. 9 (35), 24122-24139 (2018).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Melo-Hanchuk, T. D., Slepicka, P. F., Pelegrini, A. L., Menck, C. F. M., Kobarg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NEK5+interacts+with+topoisomerase+II%CE%B2+and+is+involved+in+the+DNA+damage+response+induced+by+etoposide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">NEK5 interacts with topoisomerase IIβ and is involved in the DNA damage response induced by etoposide.</a> J Cell Biochem. 120 (10), 16853-16866 (2019).</li>
<li>George, J., Mittal, S., Kadamberi, I. P., Pradeep, S., Chaluvally-Raghavan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+proximity+ligation+assay+%28PLA%29+for+detection+of+RNA-protein+complex+interactions+in+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Optimized proximity ligation assay (PLA) for detection of RNA-protein complex interactions in cell lines.</a> STAR Protoc. 3 (2), 101340(2022).</li>
<li>Zhang, W., Xie, M., Shu, M. D., Steitz, J. A., DiMaio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proximity-dependent+assay+for+specific+RNA-protein+interactions+in+intact+cells%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A proximity-dependent assay for specific RNA-protein interactions in intact cells.</a> RNA. 22 (11), 1785-1792 (2016).</li>
<li>Hegazy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+ligation+assay+for+detecting+protein-protein+interactions+and+protein+modifications+in+cells+and+tissues+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Proximity ligation assay for detecting protein-protein interactions and protein modifications in cells and tissues in situ.</a> Curr Protoc Cell Biol. 89 (1), e115(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>צלחות שחורות 384 בארות</td><td>Perkin Elmer צלחות</td><td></td><td></td>מנשא תאים</tr><tr><td>חמור&nbsp; אנטי ארנב Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21206</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Duo link חמור אנטי עכבר מינוס</td><td>סיגמא</td><td>DUO92004</td><td></td></tr><tr><td>Duolink מדלל נוגדן</td><td>Sigma</td><td>DUO82008</td><td></td></tr><tr><td>Duolink חסימת תמיסה 1X</td><td>Sigma</td><td>DUO82007</td><td></td></tr><tr><td>מגיב זיהוי Duolink אדום רחוק</td><td>סיגמא</td><td>DUO92013</td><td></td></tr><tr><td>Duolink חמור אנטי עז בתוספת</td><td>סיגמא</td><td>DUO92003</td><td></td></tr><tr><td>Duolink חמור אנטי ארנב בתוספת</td><td>סיגמא</td><td>DUO92002</td><td></td></tr><tr><td>אטופוסיד</td><td>סיגמא</td><td>E1383</td><td></td></tr><tr><td>עז אנטי Nek4</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>SC-5517</td><td>עז אנטי Nek4 שימש ב 1:50 דילול</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo</td><td>H1399</td><td>0.6 ומיקרו; g/mL</td></tr><tr><td>Leica DMI מיקרוסקופ</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>עכבר אנטי Ku70</td><td>תרמו</td><td>MA5-13110</td><td>עכבר אנטי Ku70 שימש ב 1:100 דילול</td></tr><tr><td>עכבר אנטי TOPII & beta;</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>SC-365071</td><td>1:25</td></tr><tr><td>ארנב אנטי Nek5</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>SC-84527</td><td>1:25</td></tr><tr><td>ארנב אנטי Y H2AX</td><td>איתות תאים</td><td>9718S</td><td>1:100 דילול</td></tr><tr><td>U2OS קו תאים</td><td>ATCC</td><td>HTB-96&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

בדיקת ליגנד קרבה למיקום חלבונים באתרי נזק לדנ"א

Proximity Ligand Assay to Localize Proteins in DNA Damage Sites

ראינו אינטראקציה Nek4-Ku70 בהיעדר טיפול etoposide. אולם האינטראקציה הזו יכולה להתרחש מחוץ לגרעין (איור 1A). האינטראקציה של Nek4-Ku70 גדלה לאחר נזק לדנ"א והיא מרוכזת בגרעין (איור 1A). במקרה של אינטראקציה Nek5-Topoisomerase II β (TOPIIβ), המשמשת בבדיקה זו כבקרה חיובית המבוססת על תוצאות ספרות18, האינטראקציה מוגברת במידה ניכרת על-ידי טיפול אטופוסידי (איור 1B).
הטיפול באטופוסיד מקדם תוספת של כמעט 40% (ממוצע של 9 נקודות/גרעין בתאים שטופלו ברכב לעומת 12-14 נקודות/גרעין בתאים שטופלו באטופוסידים). האינטראקציה של Nek4 ו- Ku70 אינה בלעדית לתנאי נזק ל- DNA. ואכן, Nguyen et al.12 הראו כי חלבונים אלה יכולים לתקשר בהיעדר עלבון תאי ואינם תלויים בדנ"א, כלומר האינטראקציה אינה תמיד באתרי נזק לדנ"א.
צביעת γ-H2AX נעדרת בתנאי בקרה, אך מתגברת לאחר 20 דקות של טיפול באטופוסיד ונמשכת עד 3 שעות של טיפול (איור 1C). חלק מנקודות האינטראקציה קרובות לצביעת γ-H2AX (איור 1C). לאחר שעה אחת של טיפול, רוב נקודות האינטראקציה של Nek4-Ku70 מרוכזות במוקדי נזק לדנ"א (איור 1C).
ההפלה עבור Nek4 היא סביב 70% (נתונים לא מוצגים), כלומר האות לא יבוטל לחלוטין. אנו מאמינים כי ההבדל במספר הנקודות/גרעינים אינו שווה לדלדול חלבונים מכיוון שהחלבון המזכיר יוקדש לתגובת נזק לדנ"א ולאחר מכן יתקשר עם Ku70. ממוצע הנקודות/גרעין שנמצאו בתאי Nek4 שטופלו במשך 3 שעות עם אטופוסיד הוא 10, כלומר ירידה של כ-30% בהשוואה לתאי PLKO ביקורתיים באותו מצב. אם ניקח בחשבון שאטופוסיד מגביר את האינטראקציה של Nek4-Ku ב-40% הקשורים לתאים שטופלו ברכב, ויש לנו 70% מ-Nek4 knockdown, תאי knockdown יציגו סביב 10 נקודות/גרעין. האינטראקציה של Nek4 ו-Ku70 אינה בלעדית לתגובת נזק לדנ"א, ולמרות שהיא מוגברת לאחר נזק לדנ"א, השינוי העיקרי הוא בלוקליזציה של האינטראקציה.
התוצאות המוצגות כאן מציגות כלי חשוב למיקום האינטראקציה של חלבונים בהקשר של תגובת נזק לדנ"א. Nek4 ו-Ku70 כבר היו מעורבים ב-DDR, ונראה ש-Nek4 חשוב לגיוס Ku70/Ku80 למוקדי נזק לדנ"א12. עם זאת, ניתן לחקור את המאפיינים המרחביים והזמניים של אינטראקציה זו באמצעות PLA במקביל לצביעת γ-H2AX.
טכניקות אחרות, כגון co-immunoprecipitation ו immunofluorescence, יכול לספק מידע דומה, אבל בנפרד. שימוש בסמן γ-H2AX כהפניה מאפשר ניטור זמני ומרחבי של האינטראקציה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67072/67072fig01v4.jpg"> איור 1: אינטראקציה של Nek4 - Ku70 בתנאי נזק לדנ"א. (A) תאי U2OS הודגרו עם אטופוסיד (25 מיקרומטר) במשך 20 דקות, שעה ו-3 שעות. DMSO (0.05% למשך 3 שעות) שימש כרכב. לאחר הטיפול, התאים תוקנו עם מתנול קר כקרח, וה- PLA בוצע באמצעות אנטי Nek4 עיזים ועכבר אנטי Ku70 כנוגדנים ראשוניים. הגרעין הוכתם ב-Hoechst 33342 ומוצג בכחול; נקודות PLA מוצגות באדום. תאי ביקורת היו תאים שטופלו באטופוסיד במשך שעה אחת והודגרו רק עם נוגדן ראשוני אחד (עז אנטי-Nek4) ושני נוגדנים משניים. הבקרה הביולוגית הייתה תאי הפלה Nek4 (shRNA Nek4) שטופלו במשך 3 שעות עם אטופוסיד. (B) בקרה חיובית של הבדיקה בהתבסס על תוצאות ספרותיות: תאי U2OS הודגרו עם 25 מיקרומטר של אטופוסיד במשך שעה אחת, וה-PLA בוצע עם עכבר אנטי-Nek5 וארנב אנטי-TOPIIβ. הגרף מייצג ניסוי אחד ומייצג את ממוצע שגיאות התקן (SEM) הממוצע פלוס הממוצע מכל התאים המורכבים לפחות ב-4 שדות שונים (לפחות 35 תאים לבקרה ו-50 תאים לכל שאר התנאים). המשמעות התקבלה באמצעות מבחן t ו- *: p&lt;0.05, **p&lt;0,01 ו- *** p&lt;0,001 בהשוואה לרכב DMSO. (C) לאחר PLA, התאים שהוצגו ב-(A) נשטפו עם PBS והודגרו עם נוגדן נגד γ-H2AX של ארנב. לאחר שעה של דגירה, הנוגדן המשני נגד ארנב שימש לזיהוי מוקדי נזק ל- DNA ומוצג בירוק. האזורים המכילים צביעה משותפת של PLA ו- γ-H2AX מוגדרים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67072/67072fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
איור משלים 1: מבנה התיקיות. התמונות מ- Nucleus ו- PLA צריכות להיות ממוקמות בתיקיות שונות, כפי שמוצג כאן. שמות הקבצים צריכים להתחיל בקידומת ספציפית (לדוגמה, DAPI, PLA) ולכלול תמונה מתאימה בכל תיקייה (לדוגמה, DAPI_control1.tif ו- PLA_control1.tif). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67072/Supplementary%20figure%201_RE.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
תרשים משלים 2: חלון פרמטרים של מאקרו. לאחר פתיחה/הפעלה של המאקרו ב- ImageJ/FIJI, המשתמש יתבקש לבחור תיקיות נתונים ולהזין את הפרמטרים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67072/Supplementary%20figure%202_RE.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ קידוד משלים 1: קובץ מאקרו שנוצר עבור imageJ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67072/pla_dots_per_nucleus_basei_et_al_2024.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

The DNA damage response is a genetic information safeguard that protects cells from perpetuating damaged DNA. The characterization of the proteins that ...

proximity-ligand-assay-to-localize-proteins-in-dna-damage-sites

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מתאר את בדיקת קשירת הקרבה כדי לחקור אינטראקציות חלבון-חלבון באתרן בתאי נמטודה. הקרבה של החלבונים המעניינים יוצרת את תבנית הדנ"א המעגלית בעזרת גשושית PLA המחוברת לנוגדן משני. הגשושית מוגברת עוד יותר באמצעות תמיסת ההגברה, המייצרת DNA חד גדילי ארוך ואחריו הכלאה של הגשושית הגלאי, המאפשרת לוקליזציה של אינטראקציות חלבון-חלבון בתאים.

בדיקת קשירת קרבה ללימוד אינטראקציות חלבון-חלבון באתרו

לייזרים משמשים לעתים קרובות במחקרים של התגובה התאית לנזקי DNA. עם זאת, הם מייצרים נגעים אשר מרווח, תדירות, ואת התנגשויות עם מזלגות שכפולים נדירות מאופיינות. כאן, אנו מתארים גישה המאפשרת קביעת פרמטרים אלה עם crosslinks interstrand לייזר מקומי.

ניתוח מולקולה בודדת של מותאמת לשפה לייזר Psoralen Adducts

הנה, הוא הוכיח כיצד באתרו Proximity Ligation Assay (PLA) ניתן להשתמש כדי לזהות ולחזות אינטראקציות חלבונים ישיר חלבון בין כספומט p53 בתרביות תאים ההשעיה חשופים ללחץ genotoxic.

איתור ויזואליזציה של DNA הנזק- Induced חלבון קומפלקסים ההשעיה תא תרבויות באמצעות Assay קשירת הקרבה

Microirradiation לייזר הוא כלי שימושי עבור מחקרים של תיקון ה-DNA בתאים חיים. בגישה מתודולוגי לשימוש של לייזרים UVA לזירוז נגעים דנ א שונים מוצג. לנו יש אופטימיזציה שיטה microirradiation המקומי המתחזק מחזור תא נורמלי; לפיכך, תאים לקרינה להמשיך לעבור מיטוזה.

מיקרוסקופיה קונפוקלית טכניקות ללמוד אינטראקציות חלבון-חלבון וקינטיקה ב DNA נגעים מתקדמות

לומד DNA נזק תיקון קינטיקה דורש מערכת לזירוז נגעים ב גרעיני תת אזורים מוגדרים. אנו מתארים שיטה ליצור מעברי גדילי זוגיות המותאמות לשפות אחרות באמצעות סריקה בלייזר מיקרוסקופ קונפוקלי מצויד 405 ננומטר לייזר ולספק שגרות אוטומטיות כדי לכמת את הדינמיקה של הגורמים תיקון הפצעים כאלה.

חקירה של חלבון הגיוס נגעים הדנ א באמצעות 405 ננומטר לייזר מיקרו-הקרנה

המטרה של פרוטוקול זה נועד לכמת תיקון crosslinks DNA-חלבון מוגדר על פלסמיד ה-DNA. פלסמידים lesioned הם transfected לתוך שורות תאים בתרבית של הנמען, משקל נמוך-מולקולרי נקצרו תקנים שלאחר נקודות זמן מרובים. קינטיקה תיקון ה-DNA יש לכמת באמצעות הארכת תחל סטרנד ספציפיים ואחריו qPCR.

הנועד פשוטה, מהירה, כמותית למדוד תיקון של חלבון-דנ א Crosslinks על פלסמידים Transfected בתרבית של תאים

בעקבות נזק DNA, תאים אנושיים להפעיל מסלולי תיקון חיוניים כדי לשחזר את שלמות הגנום שלהם. כאן, אנו מתארים את השיטה של חיסון עקיף כאמצעי לזיהוי חלבוני תיקון DNA, לנתח את הגיוס המרחבי והזמני שלהם, ולעזור לחקור אינטראקציה חלבון-חלבון באתרים של נזק DNA.

הדמיה של אינטראקציה חלבוני תיקון DNA על ידי אימונופלואורסץ

בעוד התנגשויות מזלג שכפול עם צינורות DNA יכול לגרום לשברים גדיל כפול, פחות ידוע על האינטראקציה בין replisomes וחסימת נגעים. השתמשנו במבחן קשירת הקרבה כדי להמחיש מפגשים אלה ולאפיין את ההשלכות על קומפוזיציה רפלימית.

הדמיה של מפגשים רפליזומיים עם נגע חוסם מתויג אנטיגן

כאן מוצג פרוטוקול לבדיקת אנזימים לחילוף חומרים של חומצות גרעין, תוך שימוש בדוגמאות של אנזימי ליגאז, נוקלאז ופולימראז. הבדיקה משתמשת באוליגונוקלאוטידים מסומנים פלואורסצנטית ולא מסומנים שניתן לשלב ליצירת דופלקסים המחקים נזקי RNA ו/או DNA או מתווכי מסלול, ומאפשרים אפיון התנהגות אנזימים.

שימוש באוליגונוקלאוטידים סינתטיים שעברו שינוי כדי להעריך אנזימים לחילוף חומרים של חומצות גרעין

אנו מתארים פרוטוקול פשוט לזהות חלבונים במוח אשר נקלטות על ידי התחנה הסופית C מלא אורכו של ה-ATP-מגודרת P2X2 קולטנים. הרחבה ויישום שיטתי של גישה זו כל הקולטנים P2X צפוי להוביל להבנה טובה יותר של איתות לקולטן P2X.

Proteomics כדי לזהות חלבונים אינטראקציה עם ליגנד P2X2-מגודרת ערוצי קטיון

למד לזהות אינטראקציות חלבונים באתרי נזק ל-DNA באמצעות שיטת PLA וצביעת Gamma-H2AX בתאי U2OS. הפרוטוקול מאפשר אפיון מרחבי וזמני של אינטראקציות לצורך מחקר ביולוגי ופיתוח תרפיות.

בדיקת ליגנד קרבה למיקום חלבונים באתרי נזק לדנ"א

גלה סרטונים נוספים