Name: הדמיה ראשונית של מיקרודומיינים Ca2+ בתאי T ראשוניים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 56 s
Description: חקור הדמיה של מיקרודומייני סידן בתאי T ראשוניים באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה. שיטה זו מאפשרת לחקור מסלולי אותות סידן בתאי חיסון ולהבין את תפקודם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>טכניקת הדמיה ברזולוציה גבוהה לאיתור מיקרו-דומיינים Ca2+ בתאי T

<ol><li>Wolf, I. M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frontrunners+of+T+cell+activation%3A+Initial%2C+localized+Ca2%2B+signals+mediated+by+NAADP+and+the+type+1+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Frontrunners of T cell activation: Initial, localized Ca2+ signals mediated by NAADP and the type 1 ryanodine receptor.</a> Sci Signal. 8 (398), 102(2015).</li>
<li>Taguchi, T., Mukai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+signalling+and+membrane+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Innate immunity signalling and membrane trafficking.</a> Curr Opin Cell Biol. 59, 1-7 (2019).</li>
<li>Trebak, M., Kinet, J. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling in T cells.</a> Nat Rev Immunol. 19 (3), 154-169 (2019).</li>
<li>Diercks, B. -P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ORAI1%2C+STIM1%2F2%2C+and+RYR1+shape+subsecond+Ca2%2B+microdomains+upon+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">ORAI1, STIM1/2, and RYR1 shape subsecond Ca2+ microdomains upon T cell activation.</a> Sci Signal. 11, 0358(2018).</li>
<li>Cheng, H., Lederer, W. J., Cannell, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+sparks%3A+Elementary+events+underlying+excitation-contraction+coupling+in+heart+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Calcium sparks: Elementary events underlying excitation-contraction coupling in heart muscle.</a> Science. 262 (5134), 740-744 (1993).</li>
<li>Feske, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling+in+lymphocyte+activation+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling in lymphocyte activation and disease.</a> Nat Rev Immunol. 7 (9), 690-702 (2007).</li>
<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).</li>
<li>Kummerow, C., Junker, C., Kruse, K., Rieger, H., Quintana, A., Hoth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+synapse+controls+local+and+global+calcium+signals+in+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">The immunological synapse controls local and global calcium signals in T lymphocytes.</a> Immunol Rev. 231 (1), 132-147 (2009).</li>
<li>Brock, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P2X4+and+P2X7+are+essential+players+in+basal+T+cell+activity+and+Ca2%2B+signaling+milliseconds+after+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">P2X4 and P2X7 are essential players in basal T cell activity and Ca2+ signaling milliseconds after T cell activation.</a> Sci Adv. 8 (5), 9770(2022).</li>
<li>Weiß, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+to+laminin-1+and+collagen+IV+induces+the+formation+of+Ca2%2B+microdomains+that+sensitize+mouse+T+cells+for+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Adhesion to laminin-1 and collagen IV induces the formation of Ca2+ microdomains that sensitize mouse T cells for activation.</a> Sci Signal. 16 (790), 9405(2023).</li>
<li>Diercks, B. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+Ca2%2B+microdomains+for+the+adaptive+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The importance of Ca2+ microdomains for the adaptive immune response.</a> Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1871 (5), 119710(2024).</li>
<li>Woelk, L. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DARTS%3A+an+open-source+Python+pipeline+for+Ca2%2B+microdomain+analysis+in+live+cell+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">DARTS: an open-source Python pipeline for Ca2+ microdomain analysis in live cell imaging data.</a> Front Immunol. 14, 1299435(2024).</li>
<li>Diercks, B. -P., Werner, R., Schetelig, D., Wolf, I. M. A., Guse, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+calcium+imaging+method+for+local+calcium+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">High-resolution calcium imaging method for local calcium signaling.</a> Methods Mol Biol. 1929, 27-39 (2019).</li>
<li>Python. Python. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.python.org/downloads/">https://www.python.org/downloads/</a> (2024).</li>
<li>Anaconda. Anaconda. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://docs.anaconda.com/free/anaconda/install/index.html">https://docs.anaconda.com/free/anaconda/install/index.html</a> (2024).</li>
<li>git. git. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://git-scm.com/book/en/v2/Getting-Started-Installing-Git">https://git-scm.com/book/en/v2/Getting-Started-Installing-Git</a> (2024).</li>
<li>DARTS. DARTS. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/IPMI-ICNS-UKE/DARTS">https://github.com/IPMI-ICNS-UKE/DARTS</a> (2024).</li>
<li>DARTS. DARTS GitHub Repository. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://ipmi-icns-uke.github.io/DARTS/">https://ipmi-icns-uke.github.io/DARTS/</a> (2024).</li>
<li>Oracle. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.oracle.com/de/java/technologies/downloads/">https://www.oracle.com/de/java/technologies/downloads/</a> (2024).</li>
<li>Time-Dependent Entropy Deconvolution. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://ipmi-icns-uke.github.io/TDEntropyDeconvolution/General/2-usage.html#input-parameters">https://ipmi-icns-uke.github.io/TDEntropyDeconvolution/General/2-usage.html#input-parameters</a> (2024).</li>
<li>Gu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+NADPH+oxidases+DUOX1+and+DUOX2+synthesize+NAADP+and+are+necessary+for+Ca2%2B+signaling+during+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Dual NADPH oxidases DUOX1 and DUOX2 synthesize NAADP and are necessary for Ca2+ signaling during T cell activation.</a> Sci Signal. 14 (709), 3800(2021).</li>
<li>Roggenkamp, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HN1L%2FJPT2%3A+A+signaling+protein+that+connects+NAADP+generation+to+Ca2%2B+microdomain+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">HN1L/JPT2: A signaling protein that connects NAADP generation to Ca2+ microdomain formation.</a> Sci Signal. 14 (675), 5647(2021).</li>
<li>Heßling, L. D., Troost-Kind, B., Weiß, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NAADP-binding+proteins+-+Linking+NAADP+signaling+to+cancer+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophy.+Acta+Mol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">NAADP-binding proteins - Linking NAADP signaling to cancer and immunity.</a> Biochim Biophy. Acta Mol Cell Res. 1870 (7), 119531(2023).</li>
<li>Dynes, J. L., Amcheslavsky, A., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+targeted+single-channel+optical+recording+reveals+multiple+Orai1+gating+states+and+oscillations+in+calcium+influx%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetically targeted single-channel optical recording reveals multiple Orai1 gating states and oscillations in calcium influx.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (2), 440-445 (2016).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>&alpha;-CD3</td><td>BD Pharmingen</td><td>553058</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-CD28</td><td>BD Pharmingen</td><td>553295</td><td></td></tr><tr><td>Anaconda</td><td>Anaconda</td><td>https://docs.anaconda.com/free/anaconda/install/index.html&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>מסננת תאים</td><td>Biofil</td><td>CSS-013-070</td><td>70 ומיקרו; קוטר</td></tr><tr><td>m Countess אוטומטי מונה תאים</td><td>Invitrogen</td><td>A49865</td><td></td></tr><tr><td>תלושי כיסוי</td><td>Paul Marienfeld GmbH</td><td>101202</td><td></td></tr><tr><td>DARTS</td><td>GitHub</td><td>https://github.com/IPMI-ICNS-UKE/DARTS&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>דולבקו s פוספט חוצץ</td><td>מלח Gibco, Thermo Fisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>EasySep CD4 + T תאי בידוד ערכת</td><td>Stemcell</td><td>19852</td><td></td></tr><tr><td>EasySep מגנטי Multistand</td><td>Stemcell</td><td>18010</td><td></td></tr><tr><td>Fluo 4-AM</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>Fura Red-AM</td><td>Invitrogen</td><td>F3020</td><td></td></tr><tr><td>Gibco RPMI 1640 בינוני</td><td>Gibco, תרמו פישר</td><td></td><td></td>11875093</tr><tr><td>Git</td><td>GitHub</td><td>https://git-scm.com/book/en/v2/Getting-Started-Installing-Git</td><td></td></tr><tr><td>שמן טבילה</td><td>Leica</td><td>11513859</td><td></td></tr><tr><td>סרום עגל ניובורן</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4637</td><td></td></tr><tr><td>Oracle</td><td>Oracle</td><td>https://www.oracle.com/de/java/technologies/downloads/&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטמיצין</td><td>Gibco, תרמו פישר</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>פולי-L-ליזין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>חלבון G חרוזים מגנטיים</td><td>Merck</td><td>LSKMAGG02</td><td>10 ומיקרו; קוטר</td></tr><tr><td>M Python</td><td></td><td>Python https://www.python.org/downloads/&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>גריז סיליקון (בסיסילון)</td><td>Bayer</td><td>291-1220</td><td></td></tr><tr><td>אנטרופיה תלוית זמן Deconvolution</td><td>GitHub</td><td>https://ipmi-icns-uke.github.io/TDEntropyDeconvolution/General/2-usage.html#input-parameters</td><td></td></tr><tr><td></td><td>TWEEN201</td><td></td> <td>q-biogene</td></tr></tbody></table>

הדמיה ראשונית של מיקרודומיינים ca2+ בתאי t ראשוניים

Imaging Initial Ca2+ Microdomains in Primary T Cells

בפרוטוקול זה, תיארנו שיטה מעודכנת לתמונה וניתוח ראשוניים של מיקרו-דומיינים Ca2+ בתאי T ראשוניים של עכבר בהתבסס על עבודה קודמת של הקבוצה שלנו 1,13. גישה זו סייעה בחשיפת מעורבותם של ערוצי CRAC כגון ORAI1, STIM1 ו-STIM2, כמו גם ערוצי שחרור תוך-תאיים Ca2+ כמו RyR1 באירועי איתות מוקדמיםשל Ca2+ 4.
כדי לעשות זאת, חקרנו היווצרות ספונטנית של מיקרו-דומיין Ca2+ על ידי הדמיה של עכבר ראשי לא מגורה Orai1-/-, Stim1-/-, Stim2-/-, ו-Ryr1-/- והשווינו אותם לתאי T של עכבר WT ראשי. הניתוח של היווצרות מיקרו-דומיין Ca2+ הקיף את מהירות תחילת האות, משרעת Ca2+ ומספר האותות למישור קונפוקלי. יש לציין כי למעט תאי Stim2-/- T, כל תאי KO T הציגו ירידה משמעותית באותות Ca2+ מקומיים וריכוז Ca2+ ציטוסולי חופשי בסיסי מופחת בהשוואה לתאי WT. זה הוביל אותנו למסקנה כי היווצרות של Ca2+ microdomains קשורה באופן מורכב לאינטראקציה של ORAI1, STIM1, ו RyR14. בנוסף, זיהינו ואפיינו בהצלחה מיקרודומיינים ספונטניים של Ca2+ בקרום הפלזמה. מיקרודומיינים אלה של Ca2+ התאפיינו באמפליטודה Ca2+ של 290 ננומטר ± 12 ננומטר. שימוש בגישה מקודדת צבע עבור אותות Ca2+ איפשר הדמיה של מיקרו-דומיינים Ca2+ ברחבי התא. התוצאות הדגישו עוד יותר את ההתחלה המהירה של מיקרו-דומיינים Ca2+ , הנראים תוך אלפיות השנייה, ואת היכולת של שיטה זו לזהות אותות Ca2+ עם תוחלת חיים של כמה אלפיות שנייה4. מיקרו-דומיינים ספונטניים אלה של Ca2+ זוהו מאוחר יותר כמיקרו-דומיינים Ca2+ תלויי הידבקות (ADCM), התלויים לא רק ב-SOCE אלא גם פועלים באמצעות מפל האיתות FAK/PLC-γ/IP3 10 ומעורבות של P2X49. יתר על כן, טכניקה זו הייתה בסיסית באישור אוקסידזות כפולות 1 ו-2 (DUOX1/2) כאנזימים מייצרי NAADP21 ו-HN1L/JPT222 כאחד החלבונים קושרי NAADPשהתגלו לאחרונה 23.
איור 2 מציג דוגמאות מייצגות של מיקרו-דומיינים מסוג Ca2+ בתאי T ראשוניים מסוג CD4+ במגע חרוזים מ-WT וכן בעכברי P2x4-/- ו-P2x7-/-. התאים הועמסו בצבעי Ca2+ Fluo-4 AM ו-Fura Red AM וצולמו בקצב רכישה של 25 מילישניות (40 פריימים לשנייה). כדי לחקות את היווצרות סינפסת תאי T, התאים עוררו באמצעות חרוזים מצופים אנטי-CD3/אנטי-CD28. היווצרות ראשונית של מיקרו-דומיין Ca2+ נותחה 1 שניות לפני ועד 15 שניות לאחר מגע חרוזים באמצעות צינור DARTS. במגע עם חרוזים, תא WT הראה היווצרות מהירה של מיקרו-דומיינים Ca2+ בשנייה הראשונה לאחר הגירוי באתר מגע החרוזים (איור 2A). מיקרו-דומיינים אלה של Ca2+ התרחבו עוד יותר ברחבי התא ב-15 השניות הבאות לאחר מגע החרוזים. בניגוד לתא WT, תאי P2x4-/- ו-P2x7-/- (איור 2B) הראו ירידה בהיווצרות מיקרו-דומיין Ca2+ לאחר גירוי חרוזים, כמו גם עבור P2x4-/-- רמה בסיסית נמוכה יותר לפני מגע חרוזים. ממצאים מייצגים אלה עולים בקנה אחד עם התוצאות שפורסמו בעבר על ידי Brock et al.9, המצביעות על היווצרות מיקרודומיין Ca2+ בתאי WT T מיד לאחר מגע חרוזים מעל 15 שניות ואותות נמוכים יותר לכל מסגרת בתאי P2x4-/- ו- P2x7-/- . יתר על כן, המשרעת בתאי P2x4-/-הופחתה באופן משמעותי, מה שביסס עוד יותר את התפקיד של איתות פורינרגי במיקרו-דומיינים Ca2+ תלויי הידבקות.
יתר על כן, שיטה זו יכולה לשמש גם כדי להמחיש מיקרו-דומיינים ראשוניים של Ca2+ בתאי CD4+ T אנושיים ראשוניים (איור 3). בהתאם לתאי T ראשוניים, מיקרו-דומיינים ראשוניים של Ca2+ מתעוררים באתר הקשר עם החרוזים. עם זאת, נראה כי התגובה הכוללת של Ca2+ מתרחשת בסקאלת זמן שונה בהשוואה לתאי T CD4+ murine.
ניתוח של אותות Ca2+ מקומיים באופן ידני אינו אפשרי מכיוון שהוא די מייגע וסובייקטיבי לחוקר הבודד. לכן, פיתחנו בעבר אלגוריתם ב-MATLAB Simulink באמצעות ארגזי הכלים שלה לעיבוד תמונהואופטימיזציה לעיבוד 13 לניתוח מיקרו-דומיינים מקומיים של Ca2+ .
לאחרונה, פיתחנו צינור חדש, קוד פתוח, לאחר עיבוד בשם DARTS עבור ניתוח מיקרו-דומיין Ca2+ בדימות תאים חיים ברזולוציה גבוהה באמצעות פלטפורמת התוכנה Python12. כאן, ניתן לבחור אלגוריתמים שונים של דה-קונבולוציה, בהתאם להעדפת המשתמש, נורמליזציה של צורת התא המבוצעת כדי לפצות על שינויים מורפולוגיים בצורת התא, ומיקרוסקופ ופרמטרים ספציפיים למדידה מוגדרים (למשל, קנה מידה, קצב פריימים, זמן נמדד) (איור 4).
לאחר בחירת פרמטרים לניתוח מיקרו-דומייןCa 2+ , נפתח חלון קופץ שני עבור כל מדידה בנפרד כדי להגדיר את מגע החרוז (איור 5). כדי להגדיר את איש הקשר של החרוז, המשתמש יכול לגלול ידנית בקובץ tiff באמצעות המחוון ולבחור את מסגרת איש הקשר של החרוז בנפרד. איש קשר לחרוז נבחר על-ידי לחיצה באתר איש הקשר של החרוז (איור 5, מגע חרוז וחרוז מסומן על-ידי טבעת צהובה וחץ) וכן על-ידי בחירת תאים. יש לחזור על שלב זה עבור כל תא מעניין. לבסוף, עיבוד התמונה האוטומטי מוחל ונתוני התוצאות מסוכמים ונשמרים בגיליון אלקטרוני.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67075/67075fig01.jpg"> איור 1: זרימת עבודה של הכנת שקופיות להדמיה. (A) הוסף ופיזר BSA ו- PLL על השקופית באמצעות החלקה שנייה של כיסוי זכוכית. (ב,ג) כדי לבנות תא, הדביקו את טבעות הגומי באמצעות שומן סיליקון על המגלשה. ודא כי הטבעת כולה מכוסה בשכבה דקה של שומן כדי לקבל בידוד נאות של החדר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67075/67075fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67075/67075fig02.jpg"> איור 2: תאים מייצגים של מיקרו-דומיינים Ca2+ תלויי קולטן תאי T בתא בר מוריני ראשוני (WT) (A), P2x4-/- או P2x7-/-(B) CD4+ T. תאי CD4+ T בודדו באופן שלילי והועמסו עם Fluo-4 AM ו- Fura Red, כמתואר לעיל. תאי T נותחו באמצעות צינור DARTS, וכתוצאה מכך תמונות תאים דומות לתוצאותשפורסמו בעבר 9. (A) תא T ראשי WT 1 שניות לפני גירוי עם חרוזים מצופים נגד CD3/anti-CD28 ועד 15 שניות לאחר גירוי (סרגל קנה מידה 5 מיקרומטר), וכן תרשים משטח תלת-ממדי של התקרבות מ-0 שניות עד 0.65 שניות באזור מגע החרוזים (סרגל קנה מידה 1 מיקרומטר). (B) נתיב עליון: נציג P2x4-/- תא T ראשי 1 שניות לפני ועד 15 שניות אחרי גירוי חרוזים. נתיב תחתון: נציג P2x7-/- תא T ראשי 1 שניות לפני ועד 15 שניות אחרי גירוי חרוזים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67075/67075fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67075/67075fig03.jpg"> איור 3: מיקרו-דומיינים Ca2+ בתא T אנושי ראשוני מייצג לאחר גירוי TCR. תאי CD4+ T אנושיים ראשוניים בודדו מתאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) על ידי מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) ממעילים באפי והועמסו ב- Fluo-4 AM ו- Fura Red, כמתואר לעיל. האיור מראה תא T אנושי ראשוני 1 שניות לפני גירוי עם חרוזים מצופים נגד CD3 ועד 15 שניות לאחר גירוי (סרגל קנה מידה 5 מיקרומטר), כמו גם תרשים משטח תלת-ממדי של זום מ-6.25 שניות עד 7.5 שניות באזור מגע החרוזים (סרגל קנה מידה 1 מיקרומטר). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67075/67075fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67075/67075fig04.jpg"> איור 4: ממשק המשתמש הגרפי (GUI) של DARTS. ממשק המשתמש הגרפי מחולק לארבעה תחומים. באזור קלט/פלט, עליך לספק מידע על הנתונים הגולמיים, כולל ספריית המקור ותצורת התמונה (שני ערוצים לכל קובץ או ערוצים נפרדים), וכן ספריית התוצאות. באזור תכונות המדידה, יש לתאר את הניסוי עם כל המידע הרלוונטי שלו, כגון קנה מידה (מיקרון לפיקסל), קצב פריימים ומרווח מדידה ביחס לנקודת ההתחלה שנקבעה מאוחר יותר. לאחר מכן, ניתן להרכיב צינור עיבוד המורכב משלבים לאחר עיבוד, נורמליזציה של צורה, והניתוח בפועל (זיהוי מיקרו-דומיין וצבירת נתונים של לוח חיצים). לבסוף, ניתן לשמור את ההגדרות במחשב או לטעון אותן. לאחר הגדרת הניתוח, לחץ על התחל כדי להמשיך. כדי לקרוא עוד על ההגדרה, בקר בכתובת https://ipmi-icns-uke.github.io/DARTS/General/Usage.html. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67075/67075fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67075/67075fig05.jpg"> איור 5: הגדרה ידנית של מגעי חרוזים. אם מוסיפים חרוזים לתאים במהלך הניסוי, יש להגדיר ידנית את זמן המגע הראשוני של החרוז עם תא מעניין ואת מיקום המגע. זה נעשה על ידי גלילה בין המסגרות עם המחוון ומציאת מיקום (x,y) בנקודת זמן t. כדי למלא באופן אוטומטי את שדה פרטי הקשר של החרוז, המשתמש לוחץ על החצי השמאלי של תמונת המיקרוסקופ במיקום איש הקשר של החרוז. לאחר מכן, כדי לשייך תא לאיש הקשר של החרוז, המשתמש לוחץ על מיקום בתוך התא שיש לו איש קשר לחרוזים. יש לאשר את המידע על-ידי בחירה באפשרות הוסף חרוז. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67075/67075fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

הדמיה ראשונית של מיקרודומיינים Ca2+ בתאי T ראשוניים

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and ...

imaging-initial-ca2-microdomains-in-primary-t-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

המידור של חלבונים גם בתוך קרום פלזמה או אל מקומות תאיים הוא אחד מנגנון רגולטורי כי יכול מאוד להשפיע על התוצאות איתות, ולכן, כדי להבין איתות חשוב ללמוד את התנהגות במרחב ובזמן של חלבונים המעורבים. המתואר כאן מערכת מבוססת מיקרוסקופיה TIRF ללמוד התמרה האות בתאי T, אבל הוא החלים רחב.

טכניקה מיקרוסקופית TIRF הדמיה בזמן אמת סימולטני של TCR וחלבונים הקשורים אליו לשידור אותות

כאן אנו מציגים טכניקות להדמיית אירועי Ca2+ מקומיים בתיווך IP3 באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בתאי יונקים שלמים הטעונים באינדיקטורים Ca2+ יחד עם אלגוריתם שהופך את הזיהוי והניתוח של אירועים אלה לאוטומטיים.

ההדמיה המקומית Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות בתאי יונקים בתרבית

חסינות אדפטיבית נשלטת על ידי 'סינפסות אימונולוגיות' דינמיות הנוצרות בין תאי T לתאים המציגים אנטיגן. פרוטוקול זה מתאר שיטות לחקירת תאי אנדותל הן כ-APCs פיזיולוגיים לא נחקרים והן כסוג חדש של 'מודל APC תאי מישורי'.

דגם תא האנדותל מישורי הדמיה החיסוני סינפסה Dynamics

המנגנונים ששולטים תנועתיות ביניים של תאי T מסוג CD4 מפעיל באתרים של דלקת הם יחסית לא ידועים. אנו מציגים גישה לא פולשנית לדמיין ולטפל בתאים במבחנה -primed CD4 T בדרמיס האוזן הדלקתית, המאפשר חקר את ההתנהגות הדינמית של תאים אלה באתרו.

הדמית תא CD4 T גירת ביניים בדרמיס המוסת

כדי לחקור מהירויות זרימה וכיווניות של אקטין חוטי בסינפסה האימונולוגית של תאי T, הדמיה ברזולוציה גבוהה של תאים חיים משולבת עם פלואורסצנציה של השתקפות פנימית כוללת ומכומתת עם ספקטרוסקופיה של מתאם תמונה מרחבית-זמנית.

קליפת המוח אקטין זרימה בתאי T לכמת ידי מתאם תמונת ספקטרוסקופיה מרחב ובזמן של תאורה מיקרוסקופית נתונים מובנים

מאמר זה מתאר פרוטוקול איתור של אחד או יותר פלזמה ו/או חלבונים תאיים ממברנה בעזרת מיקרוסקופ סופר-ברזולוציה המחסור בקרקע (GSD) בתאי יונקים. כאן, אנו נדון את היתרונות ואת השיקולים של שימוש בגישות כאלה עבור ויזואליזציה של כימות של החלבונים.

הדמיה סופר-ברזולוציה המחסור בקרקע בתאים בתרבית

פרוטוקול זה מתאר שיטה מבוססת הדמיה כדי להפעיל באמצעות photoactivatable פפטיד MHC, המאפשר שליטה מדויקת ייתכן של הפעלת תא T לימפוציטים מסוג T.

יכולות בקרה של תא T הפעלה באמצעות אגוניסט Photoactivatable

הפרוטוקול מתאר טכניקה ללמוד את היכולת של ראשי תאי T polyclonal האנושי כדי ליצור ממשקים סינפטית באמצעות השומנים מישורי bilayers. אנו משתמשים בטכניקה זו כדי להראות את היכולת היווצרות סינפסה דיפרנציאלית של האדם בתאי T העיקרי נגזר לימפה ודם היקפי.

הערכה של הממשק סינפטית של תאי T האנושי העיקרי של דם היקפיים ורקמות הלימפה

המטרה של פרוטוקול זה היא להראות כיצד להשתמש במיקרוסקופיה של יריעות האור כדי להמחיש באופן זמני את הדינמיקה של קולטן פני השטח בתאים חיים. כאן קולטני תא T על CD4+ תאי t הראשי מוצגים.

דמיין את הדינמיקה של משטח הפני-תא באמצעות מיקרוסקופ גיליון אור של סריג

בפרוטוקול זה מתמונות הן את המערך האימונוולוגי והן את תנועת הפרשה המקוטב הבאה לעבר הסינפולוגית החיסונית. שערי מעלה הסלולר נוצרו בין תא הסופר-אנטיגן פעמו של ראג'י (מתנהג כמו תא אנטיגן המציג) ו שיבוט ג'ורקאט (מתנהג כמו מסייע לימפוציטים T לימפופן).

הדמיה של הסינפסה החיסונית של האדם

זרם סידן, מדד לאיתות תאי T, הוא דרך יעילה לנתח תגובות לגירוי קולטן תאי T. פרוטוקול זה לריבוב Indo-1 עם לוחות נוגדנים המכוונים למולקולות פני התא מנצל את היכולות הגמישות ביותר של ציטומטריית זרימה בספקטרום מלא.

ניתוח של זרימת סידן המושרה על ידי קולטן תאי T בתאי T מורין ראשוניים על ידי ציטומטריית זרימה ספקטרום מלא

חקור הדמיה של מיקרודומייני סידן בתאי T ראשוניים באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה. שיטה זו מאפשרת לחקור מסלולי אותות סידן בתאי חיסון ולהבין את תפקודם.

הדמיה ראשונית של מיקרודומיינים Ca²⁺ בתאי T ראשוניים

גלה סרטונים נוספים