אנסמבל היברידי ובדיקת מולקולה בודדת כדי לדמות את התנועה של CMG משוחזר במלואו
26 ביולי 2024
אנו מדווחים על אנסמבל היברידי ובדיקת מולקולה בודדת כדי לצלם ולכמת ישירות את התנועה של מנחת מסוקים Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG) המסומן באופן פלואורסצנטי ומשוחזר במלואו על מולקולות דנ"א ליניאריות המוחזקות במקומן במלכודת אופטית.
אנו חוקרים את דינמיקת התנועה של מרכיבים שונים של הרפליזום האיקריוטי ברמת המולקולה היחידה. על מנת לקבל הבנה כמותית עמוקה של האופן שבו תאים יכולים לשכפל את כל הגנום שלהם, בכל מחזור תא. בפריצת דרך בשנת 2015, שכפול DNA אאוקריוטי נבנה מחדש במלואו במבחנה מרכיבי חלבון מטוהרים.
וזה נתן לנו הרבה שליטה על המערכת. ומאז, נעשה בו שימוש נרחב כדי לענות על שאלות על שלבים שונים של שכפול דנ"א ברזולוציה זמנית ומרחבית הולכת וגוברת. וזה נעשה באמצעות גישות משלימות כגון cryo EM וביופיזיקה של מולקולה בודדת.
בתחום המולקולה הבודדת, אחד האתגרים הגדולים ביותר במערכת זו הוא מספר החלבונים המעורבים וגם הריכוזים שבהם רכיבים אלה נדרשים על מנת למקסם את יעילות התגובה הכוללת מכיוון שהדבר עלול לסבך את הדמיית המולקולה הבודדת. הפרוטוקול המתואר כאן מציג גישה היברידית שבה קומפלקס חלבונים מורכב תחילה בצורה יעילה באמצעות ביוכימיה אנסמבל לפני שהוא מוצג ונחקר בסביבה של מולקולה אחת. זה מונע הכנסה של שני ריכוזי חלבון גבוהים ברמת המולקולה הבודדת.
אנו מדגימים גישה זו לחקר ההתנהגות של מנחת המסוקים המשוכפל CMG על דנ"א ברמת המולקולה הבודדת לאחר הרכבתו דרך מסלול מבוסס מקור. אבל גישה זו יכולה לשמש גם כדי ללמוד את הדינמיקה של סוגים רבים אחרים של מתחמי חלבון קושרי DNA.
סקירה כללית
מחקר זה מציג מערך היברידי של מדידות צבר ומולקולה בודדת לבחינת דינמיקת התנועה של הליקאז CMG על DNA ליניארי. באמצעות שילוב של ביוכימיה של צבר עם דימוג של מולקולה בודדת, המחקר שואף להעמיק את ההבנה של תהליכי שכפול ה-DNA.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביוכימיה
- ביולוגיה מולקולרית
רקע
- ניתן לשחזר שחזור של שכפול DNA איקריוטי in vitro מחלבונים מופקים.
- טכניקות של מולקולה בודדת מספקות תובנות לגבי תהליכים ביולוגיים מורכבים.
- אתגרים כוללים ניהול של ריכוזי חלבונים לצורך דימוי יעיל.
- הליקאזת CMG חיונית לפתיחת הסליל של ה-DNA במהלך השכפול.
מטרת המחקר
- לכימות תנועת ההליקאזה CMG על DNA.
- לפיתוח שיטה הממזערת ריכוזי חלבון גבוהים במהלך מחקרים של מולקולות בודדות.
- לבחינת הדינמיקה של קומפלקסי חלבונים הקושרים DNA.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הרכבת קומפלקסים של חלבונים באמצעות ביוכימיה של אנסמבל.
- דימיון של מולקולה בודדת בשילוב עם טכניקות של מלכודת אופטית.
- פונקציונליזציה של תסני DNA ליניאריים עבור בדיקות קישור.
- שלבי שטיפה ואינקובציה רצופים להכנת דגימות לדימיון.
תוצאות עיקריות
- דימוי מוצלח של תנועת הליקאז CMG על גבי DNA.
- הדגמה של יעילות הגישה ההיברידית בחקר דינמיקה של חלבונים.
- נתונים כמותיים על התנהגות ההליקאז במהלך שכפול DNA.
- יישומים פוטנציאליים של השיטה לחלבונים אחרים נקשרי DNA.
מסקנות
- בדיקת ההיבריד מספקת כלי רב-עוצמה לחקר מנגנוני שכפול DNA.
- התובנות שיתקבלו עשויות להנחות מחקרים עתידיים על שכפול DNA באוקריוטים.
- ניתן להתאים גישה זו עבור קומפלקסים שונים של חלבונים המעורבים בתהליכי DNA.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הדמיה כמותית של דינמיקה של הליקאז CMG המשוחזר באופן מלא מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית בשלבים המוקדמים ביותר של תיקוף מטרות לשכפול DNA. בדיקה היברידית זו, המשלבת מדידות של אוכלוסייה ומולקולה בודדת, מספקת רזולוציה חסרת תקדים לניתוח שלבים מורכבים של הרכבת חלבונים והפעלה, ובכך תומכת בביטחון ניבויי במטרות לשכפול DNA בשלב הגילוי. גישה זו רלוונטית ישירות לצוותים בביופארמה השואפים לבצע מיון של מטרות במכונה השכפילה ולייעל אסטרטגיות לזיהוי מולקולות מובילות (leads).
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה ישירה של מנגנוני ההרכבה וההפעלה של CMG ברזולוציה של מולקולה בודדת.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות כימות תנועת ההליקז ודיוק ההרכבה.
- מסייע בהסרת סיכונים מנגנונית של מטרות לשכפול DNA לפני ביצוע סריקה ראשונית (screening).
- מספק פלטפורמה להבהרת תלויות במסלולים במערכות מורכבות של חלבון-DNA.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק מערכות ביולוגיות שעברו וולידציה ושחזור לצורך פיתוח תבחינים (assays) חסונים בשלבים הבאים.
- מאפשר סטנדרטיזציה של תנאי דימוי של מולקולה בודדת לקבלת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור.
- תומך במוכנות לסריקה על ידי מזעור השפעות מבלבלות של ריכוזי חלבון גבוהים.
- מאפשר התאמה ניתנת להרחבה (scalable) לקומפלקסים אחרים של חלבונים המעבדים DNA.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מקשר תובנות מכניסטיות עם תהליכי שכפול DNA הרלוונטיים למחלה, במידה ורלוונטי.
- מספק רצף מגילוי מולקולרי ועד לתיקוף במודל פרה-קליני עבור יעדי שכפול.
- מאפשר קבלת החלטות לגבי המשך קידום המחקר המותאמות לסיכון, על בסיס נתונים כמותיים של מולקולה בודדת.
- תומך בהפחתת סיכונים חזויה (predictive de-risking) עבור פיתוח ביומרקרים תרגומיים במסלולי עקה של שכפול.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
בדיקה היברידית זו מגשרת בין ביוכימיה של תמצית (ensemble biochemistry) לבין דימוי של מולקולה בודדת, ובכך היא ממקמת את עצמה בממשק שבין הגילוי המוקדם לזיהוי מובילים (lead identification) עבור מטרות לשכפול DNA.
- ביולוגיה של הגילוי: מכמת את ההרכבה, ההפעלה והתנועה של CMG כדי להבהיר את מנגנוני נתיב השכפול.
- סריקה: מספק קריאות כמותיות וניתנות לשחזור להערכת מודולטורים מועמדים של מכונת השכפול.
- אנליטיקה: מאפשר מדידה ברזולוציה גבוהה של דינמיקת ההליקאז ומצבי הרכבה לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: תומך בהתאמה מנגנונית למודלים של מחלות הכוללים עקה של שכפול או אי-יציבות גנומית.
- שימוש חוזר ארגוני: ניתן להתאמה לקומפלקסים אחרים של עיבוד DNA המורכבים ממספר חלבונים לשימוש רחב במחקר ופיתוח (R&D).
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של מטרות לשכפול.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של תהליכי עבודה מורכבים להרכבת חלבונים והדמיה לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מספק מידע לקבלת החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) ומשפר את יעילות ההון על ידי הפחתת סיכונים במטרות בשלבים מוקדמים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון של מטרות לשכפול DNA לצורך קידומן.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בביוכימיה של תמצירים (ensemble biochemistry) ובטכניקות של דימיג ברזולוציית מולקולה בודדת.
- נדרשת גישה לתשתית של מלקחיים אופטיים בעלי קרן כפולה (dual-beam optical tweezers) ומיקרוסקופיה קונפוקלית.
- נחוץ סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים של פרוטוקולי ניקוי חלבונים ופונקציונליזציה של DNA.
- התאמה לקומפלקסים של חלבונים אחרים עשויה לדרוש אופטימיזציה של תנאי ההרכבה והדימיג.
- טוהר החלבון ובקרת אגרגציה הם קריטיים לקבלת תוצאות כמותיות אמינות.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:41
Binding of Doubly Functionalized Linear DNA Substrate to Streptavidin‐Coated Magnetic Beads
3:59
Ensemble Assembly and Activation of Fluorescently Labeled CMG onto Magnetic Bead‐Bound DNA for Single Molecule Imaging
7:16
Single‐Molecule Imaging of Fully Reconstituted CMG with Correlative Dual‐Beam Optical Tweezers and Confocal Microscopy
