Name: אנסמבל היברידי ובדיקת מולקולה בודדת כדי לדמות את התנועה של CMG משוחזר במלואו (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-26T14:55:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: חקור את דינמיקת התנועה של הליקאז CMG ברמת מולקולה בודדת באמצעות שילוב של ביוכימיה אנסמבל ומיקוד אופטי. שיטה זו מאפשרת למדענים לחקור תהליכי שכפול DNA באופן כמותי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לאן ארלי, לוסי דרורי ומקס דאגלס על אספקת זני שמרים לביטוי יתר של חלבונים לא מסומנים, כמו גם לחברי המעבדה של N.D. אנוג' קומאר, קטינקה ליגטהארט וג'וליאן גרוס על עזרתם בטיהור גורמי העמסה ו-DDK. המחברים מודים גם לקיילי מק'קלוסקי, דוריאן מיקולאיצ'אק, ג'וזף יילס, ג'ייקוב לואיס, אלסנדרו קוסטה, חסן ירדיצ'י וטאקג'יפ הא על דיונים מדעיים מועילים. ד.ר.מ. מודה במימון ממלגת Boehringer Ingelheim Fonds PhD Fellowship.  N.D. מכירה במימון מהארגון ההולנדי למחקר מדעי (NWO) באמצעות מענק עליון 714.017.002 וממועצת המחקר האירופית באמצעות מענק מתקדם (REPLICHROMA; מענק מספר 789267).

הדמיה של התנועה של Cdc45/MCM2-7/GINS (CMG) משוחזר במלואו

<ol><li>Bell, S. P., Labib, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+duplication+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Chromosome duplication in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 203 (3), 1027-1067 (2016).</li>
<li>Burnham, D. R., Kose, H. B., Hoyle, R. B., Yardimci, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+DNA+unwinding+by+the+eukaryotic+replicative+helicase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The mechanism of DNA unwinding by the eukaryotic replicative helicase.</a> Nat Commun. 10 (1), 1-14 (2019).</li>
<li>Ticau, S., Friedman, L. J., Ivica, N. A., Gelles, J., Bell, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+studies+of+origin+licensing+reveal+mechanisms+ensuring+bidirectional+helicase+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-molecule studies of origin licensing reveal mechanisms ensuring bidirectional helicase loading.</a> Cell. 161 (3), 513-525 (2015).</li>
<li>Ticau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+and+timing+of+Mcm2-7+ring+closure+during+DNA+replication+origin+licensing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Str+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanism and timing of Mcm2-7 ring closure during DNA replication origin licensing.</a> Nat Str Mol Biol. 24 (3), 309-315 (2017).</li>
<li>Gupta, S., Friedman, L. J., Gelles, J., Bell, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+helicase-++tethered+ORC+flip+enables+bidirectional+helicase+loading%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A helicase- tethered ORC flip enables bidirectional helicase loading.</a> eLife. 10, e74282(2021).</li>
<li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+visualization+of+Saccharomyces+cerevisiae+leading-strand+synthesis+reveals+dynamic+interaction+between+MTC+and+the+replisome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule visualization of Saccharomyces cerevisiae leading-strand synthesis reveals dynamic interaction between MTC and the replisome.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (40), 10630-10635 (2017).</li>
<li>Dulin, D., Berghuis, B. A., Depken, M., Dekker, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untangling+reaction+pathways+through+modern+approaches+to+high-throughput+single-molecule+force-spectroscopy+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opinion+Str+Biol%22%5BJournal%5D)">Untangling reaction pathways through modern approaches to high-throughput single-molecule force-spectroscopy experiments.</a> Curr Opinion Str Biol. 34, 116-122 (2015).</li>
<li>Lewis, J. S., van Oijen, A. M., Spenkelink, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embracing+heterogeneity%3A+Challenging+the+paradigm+of+replisomes+as+deterministic+machines%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Embracing heterogeneity: Challenging the paradigm of replisomes as deterministic machines.</a> Chem Rev. 123 (23), 13419-13440 (2023).</li>
<li>Abbondanzieri, E. A., Greenleaf, W. J., Shaevitz, J. W., Landick, R., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+base-pair+stepping+by+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct observation of base-pair stepping by RNA polymerase.</a> Nature. 438 (7067), 460-465 (2005).</li>
<li>Yeeles, J. T. P., Deegan, T. D., Janska, A., Early, A., Diffley, J. F. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+eukaryotic+DNA+replication+origin+firing+with+purified+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulated eukaryotic DNA replication origin firing with purified proteins.</a> Nature. 519 (7544), 431-435 (2015).</li>
<li>Douglas, M. E., Ali, F. A., Costa, A., Diffley, J. F. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+eukaryotic+CMG+helicase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The mechanism of eukaryotic CMG helicase activation.</a> Nature. 555 (7695), 265-268 (2018).</li>
<li>Remus, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concerted+loading+of+Mcm2-7+double+hexamers+around+DNA+during+DNA+replication+origin+licensing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Concerted loading of Mcm2-7 double hexamers around DNA during DNA replication origin licensing.</a> Cell. 139 (4), 719-730 (2009).</li>
<li>Frigola, J., Remus, D., Mehanna, A., Diffley, J. F. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATPase-dependent+quality+control+of+DNA+replication+origin+licensing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">ATPase-dependent quality control of DNA replication origin licensing.</a> Nature. 495 (7441), 339-343 (2013).</li>
<li>Coster, G., Frigola, J., Beuron, F., Morris, E. P., Diffley, J. F. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+licensing+requires+ATP+binding+and+hydrolysis+by+the+MCM+replicative+helicase%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Origin licensing requires ATP binding and hydrolysis by the MCM replicative helicase.</a> Mol Cell. 55 (5), 666-677 (2014).</li>
<li>Coster, G., Diffley, J. F. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+eukaryotic+DNA+replication+is+established+by+quasi-symmetrical+helicase+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bidirectional eukaryotic DNA replication is established by quasi-symmetrical helicase loading.</a> Science. 357 (6348), 314-318 (2017).</li>
<li>Miller, T. C. R., Locke, J., Greiwe, J. F., Diffley, J. F. X., Costa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+head-to-head+MCM+double-hexamer+formation+revealed+by+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of head-to-head MCM double-hexamer formation revealed by cryo-EM.</a> Nature. 575 (7784), 704-710 (2019).</li>
<li>Abid Ali, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+of+a+licensed+DNA+replication+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure of a licensed DNA replication origin.</a> Nat Commun. 8 (1), 1-10 (2017).</li>
<li>Sánchez, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+origins+retain+mobile+licensing+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">DNA replication origins retain mobile licensing proteins.</a> Nat Commun. 12 (1), 1908(2021).</li>
<li>Ilves, I., Petojevic, T., Pesavento, J. J., Botchan, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+MCM2-7+helicase+by+association+with+Cdc45+and+GINS+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Activation of the MCM2-7 helicase by association with Cdc45 and GINS proteins.</a> Mol Cell. 37 (2), 247-258 (2010).</li>
<li>Moyer, S. E., Lewis, P. W., Botchan, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+the+Cdc45%2FMcm2-7%2FGINS+%28CMG%29+complex%2C+a+candidate+for+the+eukaryotic+DNA+replication+fork+helicase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Isolation of the Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG) complex, a candidate for the eukaryotic DNA replication fork helicase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (27), 10236-10241 (2006).</li>
<li>Langston, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CMG+helicase+and+DNA+polymerase+%CE%B5+form+a+functional+15-subunit+holoenzyme+for+eukaryotic+leading-strand+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">CMG helicase and DNA polymerase ε form a functional 15-subunit holoenzyme for eukaryotic leading-strand DNA replication.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (43), 15390-15395 (2014).</li>
<li>Sheu, Y. J., Stillman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc7-Dbf4+phosphorylates+MCM+proteins+via+a+docking+site-mediated+mechanism+to+promote+S+phase+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Cdc7-Dbf4 phosphorylates MCM proteins via a docking site-mediated mechanism to promote S phase progression.</a> Mol Cell. 24 (1), 101-113 (2006).</li>
<li>Sheu, Y. J., Stillman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Dbf4-Cdc7+kinase+promotes+S+phase+by+alleviating+an+inhibitory+activity+in+Mcm4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Dbf4-Cdc7 kinase promotes S phase by alleviating an inhibitory activity in Mcm4.</a> Nature. 463 (7277), 113-117 (2010).</li>
<li>Randell, J. C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mec1+is+one+of+multiple+kinases+that+prime+the+Mcm2-7+helicase+for+phosphorylation+by+Cdc7%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Mec1 is one of multiple kinases that prime the Mcm2-7 helicase for phosphorylation by Cdc7.</a> Mol Cell. 40 (3), 353-363 (2010).</li>
<li>Greiwe, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+mechanism+for+the+selective+phosphorylation+of+DNA-loaded+MCM+double+hexamers+by+the+Dbf4-dependent+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Str+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural mechanism for the selective phosphorylation of DNA-loaded MCM double hexamers by the Dbf4-dependent kinase.</a> Nat Str Mol Biol. 29 (1), 10-20 (2021).</li>
<li>de Jesús-Kim, L., Friedman, L. J., Ramsoomair, C., Gelles, J., Bell, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DDK+regulates+replication+initiation+by+controlling+the+multiplicity+of+Cdc45-GINS+binding+to+Mcm2-7%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">DDK regulates replication initiation by controlling the multiplicity of Cdc45-GINS binding to Mcm2-7.</a> eLife. 10, 65471(2021).</li>
<li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+replication+origin+melting+nucleated+by+CMG+helicase+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of replication origin melting nucleated by CMG helicase assembly.</a> Nature. 606 (7916), 1007-1014 (2022).</li>
<li>Ramírez Montero, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+binding+halts+diffusion+of+the+eukaryotic+replicative+helicase+during+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Nucleotide binding halts diffusion of the eukaryotic replicative helicase during activation.</a> Nat Commun. 14 (1), 2082(2023).</li>
<li>Kose, H. B., Larsen, N. B., Duxin, J. P., Yardimci, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+eukaryotic+replicative+helicase+at+lagging-strand+protein+barriers+support+the+steric+exclusion+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the eukaryotic replicative helicase at lagging-strand protein barriers support the steric exclusion model.</a> Cell Rep. 26 (8), 2113-2125 (2019).</li>
<li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+visualization+of+Saccharomyces+cerevisiae+leading-strand+synthesis+reveals+dynamic+interaction+between+MTC+and+the+replisome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule visualization of Saccharomyces cerevisiae leading-strand synthesis reveals dynamic interaction between MTC and the replisome.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (40), 10630-10635 (2017).</li>
<li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunability+of+DNA+polymerase+stability+during+eukaryotic+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Tunability of DNA polymerase stability during eukaryotic DNA replication.</a> Mol Cell. 77, 1-9 (2020).</li>
<li>Schauer, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replisome+bypass+of+a+protein-based+R-loop+block+by+Pif1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Replisome bypass of a protein-based R-loop block by Pif1.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (48), 30354-30361 (2020).</li>
<li>Wasserman, M. R., Schauer, G. D., O'Donnell, M. E., Liu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+activation+is+enabled+by+a+single-stranded+DNA+gate+in+CMG+helicase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Replication fork activation is enabled by a single-stranded DNA gate in CMG helicase.</a> Cell. 178 (3), 600-611 (2019).</li>
<li>Kose, H. B., Xie, S., Cameron, G., Strycharska, M. S., Yardimci, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplex+DNA+engagement+and+RPA+oppositely+regulate+the+DNA-unwinding+rate+of+CMG+helicase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Duplex DNA engagement and RPA oppositely regulate the DNA-unwinding rate of CMG helicase.</a> Nat Commun. 11 (1), 1-15 (2020).</li>
<li>White, D. S., Smith, M. A., Chanda, B., Goldsmith, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+overcoming+the+single-molecule+concentration+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Meas+Sci+Au%22%5BJournal%5D)">Strategies for overcoming the single-molecule concentration barrier.</a> ACS Meas Sci Au. 3 (4), 239-257 (2023).</li>
<li>Liachko, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+genome-wide+map+of+autonomously+replicating+sequences+in+a+naive+genome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">A comprehensive genome-wide map of autonomously replicating sequences in a naive genome.</a> PLoS Genet. 6 (5), 22(2010).</li>
<li>Kapadia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processive+activity+of+replicative+DNA+polymerases+in+the+replisome+of+live+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Processive activity of replicative DNA polymerases in the replisome of live eukaryotic cells.</a> Mol Cell. 80 (1), 114-126 (2020).</li>
<li>Claussin, C., Vazquez, J., Whitehouse, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+mapping+of+replisome+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-molecule mapping of replisome progression.</a> Mol Cell. 82 (7), 1372-1382 (2022).</li>
<li>Polo Rivera, C., Deegan, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicon-seq%3A+seeing+is+believing%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Replicon-seq: seeing is believing.</a> Trends Genet. 38 (10), 987-988 (2022).</li>
<li>Sparks, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CMG+helicase+bypasses+DNA-protein+cross-links+to+facilitate+their+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The CMG helicase bypasses DNA-protein cross-links to facilitate their repair.</a> Cell. 176 (1-2), 167-181 (2019).</li>
<li>Vrtis, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-strand+DNA+breaks+cause+replisome+disassembly%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-strand DNA breaks cause replisome disassembly.</a> Mol Cell. 81 (6), 1309-1318 (2021).</li>
<li>Low, E., Chistol, G., Zaher, M. S., Kochenova, O. V., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+replication+fork+suppresses+CMG+unloading+from+chromatin+before+termination%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The DNA replication fork suppresses CMG unloading from chromatin before termination.</a> Genes Dev. 34 (21), 1534-1545 (2020).</li>
<li>Parker, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+class+of+disordered+elements+controls+DNA+replication+through+initiator+self-assembly%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A new class of disordered elements controls DNA replication through initiator self-assembly.</a> eLife. 8, 1-35 (2019).</li>
<li>Hirsch, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easily+reversible+desthiobiotin+binding+to+streptavidin%2C+avidin%2C+and+other+biotin-binding+proteins%3A+Uses+for+protein+labeling%2C+detection%2C+and+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: Uses for protein labeling, detection, and isolation.</a> Anal Biochem. 308 (2), 343-357 (2002).</li>
<li>Candelli, A., Wuite, G. J. L., Peterman, E. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+optical+trapping%2C+fluorescence+microscopy+and+micro-fluidics+for+single+molecule+studies+of+DNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Chem+Chem+Phys%22%5BJournal%5D)">Combining optical trapping, fluorescence microscopy and micro-fluidics for single molecule studies of DNA-protein interactions.</a> Phys Chem Chem Phys. 13 (16), 7263-7272 (2011).</li>
<li>Candelli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+quantification+of+nascent+RAD51+filament+formation+at+single-monomer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Visualization and quantification of nascent RAD51 filament formation at single-monomer resolution.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (42), 15090-15095 (2014).</li>
<li>Bustamante, C., Marko, J. F., Siggia, E. D., Smith, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entropic+elasticity+of+lambda-phage+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Entropic elasticity of lambda-phage DNA.</a> Science. 265 (5178), 1599-1600 (1994).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biophysics+toolbox+for+reliable+data+acquisition+and+processing+in+integrated+force-confocal+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Photonics%22%5BJournal%5D)">A biophysics toolbox for reliable data acquisition and processing in integrated force-confocal fluorescence microscopy.</a> ACS Photonics. 11 (4), 1592-1603 (2024).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

שלבים קריטיים ובדיקות איכות ריאגנטים חשובות השלבים הקריטיים ובדיקות האיכות של מגיב ביולוגי בבדיקה מודגשים כאן. ראשית, טוהר החלבונים בהם נעשה שימוש חשוב מכיוון שהתפרקות הדנ"א הנגרמת אפילו על ידי מזהמי נוקלאז קטנים בדגימות החלבון תשפיע לרעה על הנתונים. הסיבה לכך היא שרק מולקולות דנ"א שלמות (או חלקיות) יכולות להילכד בפינצטה האופטית בעלת האלומה הכפולה. חשוב מכך, ניקים בדנ"א יגרמו ל-CMG לנתק41, מה שיסבך את התצפית על התנועה ארוכת הטווח של CMG. אנו ממליצים בחום לבדוק כל חלבון מטוהר לפעילות הנוקלאז, כמו גם לעקוב באופן קבוע אחר שלמות מצע הפלסמיד ההתחלתי כדי להבטיח שהניקינג מצטמצם למינימום. השלב החשוב השני הוא הסרה זהירה של החרוזים המגנטיים בעקבות ההדחה של מתחמי DNA:CMG. הסרת סופרנטנט בשלב זה צריכה להתבצע לאט כדי לא להפריע לחרוזים שנאספו. אם חרוזים מגנטיים נשארים בדגימה המוטסת לפינצטה האופטית, הם לרוב יפגעו בחרוזי הפוליסטירן הכלואים אופטית, מה שיגרום להם להימלט מהמלכודת האופטית ויסבך את איסוף הנתונים. לבסוף, יש לטפל בזהירות בקומפלקסים של DNA:CMG בפינצטה האופטית. לשם כך, אנו ממליצים לא להגדיל את המתח של הדנ"א מעל 10 pN, שכן הפעלת כוח עלולה לנתק CMG מהדנ"א. יתר על כן, המעבר בין תעלות בתא הזרימה המיקרופלואידית צריך להיעשות לאט ככל האפשר (~ 0.2 מ"מ לשנייה) כדי למנוע מכוחות הגרר המתקבלים לנתק CMG מהדנ"א.
שינויים בשיטה ישנם מספר שלבים של הבדיקה שניתן לשנות. לדוגמה, הראינו כי ניתן לקצר את זמן האלוציה מ-60 דקות ל-30 דקות מבלי להשפיע באופן משמעותי על תפוקת האלוציה. בנוסף, אנו ממליצים להשלים את מאגר האלוציה עם ריכוז נמוך (מתחת ל-1 מילימטר) של ATP או ATPγS כדי למנוע מ-CMG להתפזר מקצות הדנ"א, כמו גם לייצב באופן כללי את CMG28. יתר על כן, למרות שהרכבי החיץ וריכוזי החלבונים שאנו מדווחים עליהם כאן מבוססים על אלה ששימשו בעבודה ביוכימית וחד-מולקולה קודמת11,18, הבדיקה שאנו מתארים תואמת לחלוטין לפרוטוקולים אחרים להרכבת CMG26,27. לכן, כל התקדמות ביוכימית המדווחת כמגבירה את יעילות ההרכבה או ההפעלה של CMG יכולה וצריכה להיות מיושמת בחלק הארי של הבדיקה כדי להגדיל את התשואה. לבסוף, הגדלת הזמן בין מסגרות מגדילה את הזמן הכולל שבו CMG ניתן לצלם, להקל על התצפית של תנועת CMG לטווח ארוך לפני הלבנה פלואורופור.
מגבלות השיטה השיטה ההיברידית שאנו מתארים מוגבלת בכך שניתן לדמיין CMG רק לאחר הפעלתו בכמויות גדולות. עבודה נוספת תידרש כדי לצפות בהפעלת CMG בזמן אמת. מגבלה חשובה נוספת היא שבעוד שאנו מצפים ש-CMG יורכב בזוגות 17,26,27, המספר הכולל של קומפלקסים של CMG לכל דנ"א שאנו רואים הוא בעיקר אחד 28, מה שמרמז על כך ש-CMG, או לפחות Cdc45, מתנתק מהדנ"א במהלך הטיפול בקומפלקסים הרגישים של DNA:CMG. הפחתת מספר שלבי הטיפול לפני הדמיה של מולקולה בודדת, כמו גם פיתוח אסטרטגיות פסיבציה טובות יותר עבור צינורות הפלסטיק והזכוכית של תא הזרימה המיקרופלואידית צפויים להגדיל תפוקה זו.
משמעות השיטה מחקרי תנועה של מולקולות בודדות של CMG השתמשו עד כה ב-CMG מופעל מראש שטוהר כקומפלקס מתאים (complex from cells). למרות שהיא פשוטה יחסית, גישת CMG מופעלת מראש זו מוגבלת בכך שהיא מפספסת את כל השלבים המובילים להפעלת CMG, כמו גם את האופי הדו-כיווני של CMG ותנועה רפליזומית. מצד שני, להרכבה מחדש מלאה של הרכבה והפעלה של CMG יש פוטנציאל ללמוד כל שלבי קדם-הפעלה, כמו גם ללמוד תנועת CMG באופן דו-כיווני. עם זאת, קשה יותר לתרגם גישה זו מהרמה הביוכימית בתפזורת לרמה של מולקולה בודדת, מכיוון שהיא כוללת הרבה יותר גורמים ושלבים חלבוניים מטוהרים. הבדיקה שאנו מתארים כאן סייעה להתגבר על אתגרים אלה בכך שאפשרה לנו לדמיין את התנועה של CMG משוחזר במלואו ברמת המולקולה היחידה, ואפשרה לנו לגשת לכמה דינמיקות קדם-הפעלה שהוחמצו קודם לכן28. בנוסף, אף על פי שאנו רואים בעיקר CMG אחד לכל דנ"א, הצלחנו לצפות בכמה מקרים של שני קומפלקסים של CMG הנעים בכיוונים מנוגדים, ויכולנו אפילו ללכוד את ההפרדה הראשונית של CMG אחות זו מזו28, מה שסיפק כמה תובנות לגבי ביסוס השכפול הדו-כיווני.
יתרון נוסף של הבדיקה הזו בהשוואה לתנועת CMG קודמת טמון באופי הדו-גדילי המלא של מצע הדנ"א שאנו משתמשים בו (איור 1A). בעבודות CMG קודמות שהופעלו מראש, הדרך הנפוצה ביותר לקשור CMG למצע הדנ"א היא באמצעות דש ssDNA 3'. התוצאה היא מבנה דנ"א שלא ניתן להגביל אותו בקלות ולכן אוסר על חקר התפקיד של סליל-על בהתקדמות השחזור. לעומת זאת, הגישה החדשה שאנו מתארים כאן עשויה להיות מותאמת לחקר תפקיד המומנט בתהליך זה, שכן מצע הדנ"א המשמש הוא דו-גדילי לחלוטין.
יישומים רחבים יותר של השיטה המבחן ההיברידי המתואר יסלול את הדרך לבנייה מחדש מלאה של רפליזום אאוקריוטי שלם, ויאפשר לנו ולאחרים להתבונן ולכמת את הדינמיקה החשובה המאפשרת לרפליזום להצליח בכל משימותיו השונות. מלבד שכפול דנ"א, הבדיקה שאנו מדווחים עליה מייצגת התקדמות חשובה בתרגום תגובה ביוכימית מורכבת מרמת הביוכימיה בתפזורת לרמת המולקולה הבודדת. אנו צופים שניתן יהיה לשנות בקלות בדיקה זו כדי לחקור אינטראקציות DNA:חלבונים מורכבות דומות המעורבות במנגנוני עיבוד DNA שונים.

שכפול DNA באיקריוטים מתבצע על ידי קומפלקס חלבונים דינמי המכונה replisome1. מרכיב מרכזי בקומפלקס זה הוא מנחת המסוקים המשוכפל האיקריוטי Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG), המניע ומארגן באופן מרכזי את הרפליזום, ומוביל את הדרך בחזית מזלגות השכפול 1,2. השגת הבנה כמותית עמוקה של הדינמיקה של CMG היא אפוא קריטית להבנת הדינמיקה של הרפליזום. הבנה כזו יכולה להירכש באמצעות טכניקות של מולקולות בודדות, המתאימות באופן ייחודי לחקר מנועים מולקולריים, כגון CMG, בשל הרזולוציה המרחבית והרקתית שאין דומה לה, ויכולות לספק לנו הבנה כמותית שאין דומה לה של תפקודם, סטוכסטיותודינמיקה 2,3,4,5,6,7,8,9.
In vivo, CMG נטען ומופעל באופן מופרד זמנית כדי להבטיח שהשכפול יתרחש רק פעם אחת בכל מחזור תא 1,10,11. ראשית, בשלב G1 של מחזור התא, קבוצה של חלבונים הידועים כגורמי העמסה מעמיסה את המרכיב הראשון של CMG, קומפלקס הקסמרי Mcm2-7, על dsDNA 12,13,14,15,16 בצורה של הקסמרים כפולים עם תצורת ראש בראש 15,17,18 . במקרה הספציפי של שמרים, תהליך ראשוני זה מתרחש ברצפי דנ"א ספציפיים הידועים כמקורות השכפול1. למרות ש-Mcm2-7 הוא הליבה המוטורית של מנחת המסוקים המשוכפל, הוא כשלעצמו אינו מסוגל לשחרר את DNA19 ללא שני הגורמים המפעילים את הליקאז, Cdc45 ו-GINS, שיש לגייס ל-Mcm2-7 הטעון כדי ליצור CMG 11,19,20,21 פעיל במלואו. תהליך הפעלת מנחת המסוקים מתרחש בשלב S של מחזור התא ומתחיל עם זרחן סלקטיבי של Mcm2-7 hexamers כפול על ידי קינאז מווסת מחזור התא DDK 22,23,24. אירועי זרחן אלה מאפשרים גיוס של Cdc45 ו- GINS ל- Mcm2-7 Double hexamers 10,22,23,24,25,26 על ידי קבוצה שנייה של חלבונים הידועים כגורמי ירי 10,11,26. הקישור של Cdc45 ו- GINS מוליד שני מנחת מסוקים CMG אחות, אשר בתחילה תוחמים את שני גדילי ה- DNA ההורי ועדיין ממוקמים בתצורת ראש בראש11,27. בשלב ההפעלה האחרון, גורם הירי Mcm10 מזרז את האקסטרוזיה תלוית ההידרוליזה ATP של גדיל DNA אחד מכל אחות CMG11. לאחר שחול גדיל, מנחת המסוקים CMG האחות עוקפים ונפרדים זה מזה על ידי טרנסלוקציה לאורך ssDNA באופן תלוי ATP 11,20,21,28, ומשחררים DNA על ידי הרחקה סטרילית של גדיל29 שאינו טרנסלוקציה. כל התהליך הזה שוחזר במלואו במבחנה מקבוצה מינימלית של 36 פוליפפטידים מטוהרים של S. cerevisiae 10,11.
למרות הוויסות המעולה in vivo של הרכבה והפעלה של CMG שתואר לעיל, מחקרי תנועה במבחנה של מולקולה אחת של CMG 2,30,31,32,33,34 הסתמכו עד כה על CMG מופעל מראש שטוהר כקומפלקס מתאים20,21חסר את כל השלבים שקדמו להפעלתו ואת האופי הדו-כיווני של תנועתו., גישת CMG מופעלת מראש זו הייתה תקן הזהב בתחום המולקולה הבודדת, בין היתר בשל המורכבות הביוכימית של תגובת הרכבת CMG המשוחזרת במלואה10,11. תגובה ביוכימית זו הייתה מאתגרת לתרגום מהרמה הביוכימית בתפזורת לרמה של מולקולה בודדת מכמה סיבות. ראשית, כדי למקסם את יעילות התגובה, גורמי הטעינה והירי הדרושים להרכבה והפעלה של CMG נדרשים בריכוזים בטווח של 10-200 ננומטר10,11,27. טווחי ריכוז אלה תואמים את הקצה הגבוה של מה שרוב הטכניקות של מולקולה בודדת יכולות לסבול, במיוחד כאשר משתמשים ברכיבים המסומנים באופן פלואורסצנטי35. לבסוף, CMG התפתחה לשייט דרך אלפי זוגות בסיסים בתא 36,37,38,39. לכן, כדי לחקור את תנועתו בקנה מידה מרחבי רלוונטי ביולוגית, נדרשים מצעי דנ"א ארוכים (בדרך כלל באורכים בסדר גודל של עשרות קילו-בסיסים)30,31,34,40,41,42. שימוש במצעי דנ"א ארוכים כל כך מציב אתגר נוסף שככל שמצע הדנ"א ארוך יותר, כך יש לו יותר אתרי קישור פוטנציאליים לא ספציפיים לחלבונים ולאגרגטים חלבוניים. במקרה של CMG, הנקודה האחרונה חשובה במיוחד, מכיוון שכמה מגורמי הטעינה והירי המעורבים בהרכבה והפעלה של CMG מכילים אזורים לא מסודרים במהותם43 והם מועדים לצבירה.
כאן, אנו מדווחים על אנסמבל היברידי ובדיקת מולקולה בודדת שאפשרה תצפית וכימות של תנועת CMG לאחר שחזור מלא של הרכבתו והפעלתו מ-36 פוליפפטידים מטוהרים של S. cerevisiae 28. בדיקה זו מסתמכת על התפקוד הכפול של שני הקצוות של מצע דנ"א עם שני מויטי התקשרות אורתוגונליים: desthiobiotin ו-digoxigenin2 (איור 1A). המויטי הראשון, desthiobiotin, משמש לקשירה הפיכה של מצע הדנ"א לחרוזים מגנטיים מצופים סטרפטווידין44 (איור 1B). לאחר מכן, CMG המסומן באופן פלואורסצנטי מורכב ומופעל על גבי הדנ"א הקשור לחרוזים, ומתלה מגנטי משמש לטיהור ולשטיפה של קומפלקסי הדנ"א:CMG הקשורים לחרוזים מגנטיים (איור 1C). בכך, מוסר עודפי החלבון שאחרת היו מצטברים על מצע הדנ"א; זה מספק קומפלקסים כמעט ללא צבירה:CMG. קומפלקסים שלמים מדוללים מהחרוזים המגנטיים על-ידי הוספה של עודף מולארי של ביוטין חופשי, שיכול להתחרות באינטראקציה דסתיביוטין-סטרפטאבידין (איור 1D). DNA בודד: קומפלקסים CMG קשורים בין שני חרוזי פוליסטירן לכודים אופטית המצופים בנוגדן אנטי-דיגוקסיגנין (anti-Dig); עבור השלב הזה, משתמשים במויטי השני בדנ"א, דיגוקסיגנין, מאחר שהוא יכול להיקשר לאנטי-דיג אפילו בתמיסת חיץ שמכילה עודף של ביוטין חופשי (איור 1E). ברגע שקומפלקס הדנ"א:CMG מוחזק במקומו במלכודת האופטית, התנועה של CMG המסומן באופן פלואורסצנטי מצולמת באמצעות לייזר סריקה קונפוקלי (איור 1F). אנו צופים כי בדיקה זו יכולה להיות מותאמת בקלות למחקר ברמת מולקולה אחת של אינטראקציות DNA:חלבון מורכבות דומות.

<table><tbody><tr><td>AflII&nbsp;</td><td>NEB</td><td>R0520L</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי פוליסטירן מצופים אנטי דיגוקסיגנין&nbsp;</td><td>Spheroteck</td><td>DIGP-20-2</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת ATP</td><td>תרמו פישר</td><td>R0441</td><td></td></tr><tr><td>ATP&gamma; S</td><td>Roche</td><td>11162306001</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>NEB</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>C-Trap</td><td>Lumicks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CutSmart Buffer</td><td>NEB</td><td>B6004S</td><td>מסופק עם AflII</td></tr><tr><td>dCTP</td><td>Promega</td><td>U122B</td><td></td></tr><tr><td>D-Desthiobiotin-7-dATP</td><td>Jena Bioscience&nbsp;</td><td>NU-835-Desthiobio</td><td></td></tr><tr><td>dGTP</td><td>Thermo Fisher</td><td>10218014</td><td></td></tr><tr><td>Digoxigenin-11-dUTP</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-803-DIGXL</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 Streptavidin חרוזים מגנטיים</td><td>Invitrogen</td><td>11205D</td><td></td></tr><tr><td>Klenow Fragment (3'&rarr; 5' exo-)&nbsp;</td><td>NEB</td><td>M0212L</td><td></td></tr><tr><td>Microspin S-400 עמודות סחיטה HR&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>GE27-5140-01</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer2</td><td>NEB</td><td>B7002S</td><td>מסופק עם Klenow Fragment</td></tr><tr><td>Nonidet&nbsp; P 40 תחליף</td><td>סיגמא</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>פלורוניק F-127&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>P2443</td><td></td></tr></tbody></table>

אנסמבל היברידי ובדיקת מולקולה בודדת כדי לדמות את התנועה של cmg משוחזר במלואו

Hybrid Ensemble and Single-molecule Assay to Image the Motion of Fully Reconstituted CMG

לאוקריוטים יש מנחת מסוקים משוכפל אחד המכונה CMG, אשר מארגן ומניע באופן מרכזי את הרפליזום, ומוביל את הדרך בחזית מזלגות השכפול. השגת הבנה מכניסטית עמוקה של הדינמיקה של CMG היא קריטית כדי להבהיר כיצד תאים משיגים את המשימה העצומה של שכפול יעיל ומדויק של כל הגנום שלהם פעם אחת בכל מחזור תא. טכניקות של מולקולות בודדות מתאימות באופן ייחודי לכימות הדינמיקה של CMG בשל הרזולוציה הטמפורלית והמרחבית שאין דומה לה. אף על פי כן, מחקרים על מולקולות בודדות של תנועת CMG הסתמכו עד כה על CMG שנוצר מראש מטוהר מתאים כמכלול, מה שמונע את חקר השלבים המובילים להפעלתו. כאן, אנו מתארים אנסמבל היברידי ובדיקת מולקולה בודדת שאפשרה הדמיה ברמת המולקולה הבודדת של התנועה של CMG המסומן באופן פלואורסצנטי לאחר שחזור מלא של הרכבתו והפעלתו מ-36 פוליפפטידים מטוהרים שונים של S. cerevisiae . בדיקה זו מסתמכת על הפונקציונליות הכפולה של הקצוות של מצע דנ"א ליניארי עם שני מויטי התקשרות אורתוגונליים, וניתן להתאים אותה לחקר מנגנוני עיבוד דנ"א מורכבים דומים ברמת המולקולה היחידה.

כאשר הוא מבוצע כראוי, הפרוטוקול המתואר כאן אמור להניב קומפלקסים כמעט נטולי צבירה של DNA:CMG. תגובה נטולת צבירה לא אמורה לסתום אף אחת מהתעלות בתא הזרימה המיקרופלואידית, ואמורה להיות אפשרות למתוח את מולקולות הדנ"א הכלואות להארכה מקצה לקצה בתוך 10% מאורך קווי המתאר שלה מבלי לשבור את הדנ"א. לעומת זאת, אם יש צבירה בתגובה, מולקולות דנ"א עשויות לפעמים להידחס על ידי הצברים, ולעתים קרובות לגרום לשבירת דנ"א אם הן נמתחות. דרך טובה לזהות צברי חלבונים היא על ידי התבוננות בסריקות הדו-ממדיות של הדנ"א. בתגובה נטולת צבירה, CMG מופיע כנקודות בדידות וסימטריות מוגבלות בעקיפה שגודשות בדלילות את הדנ"א, כמו אלה שבסריקות שמוצגות באיור 2A. להיפך, הצברים הם פחות בדידים, לפעמים כתמים א-סימטריים שמצטופפים לאורך גדול יותר של הדנ"א, כמו אלה שבסריקות שמוצגות באיור 2B. יתר על כן, אם הבדיקה מבוצעת בהצלחה, וטוהר גבוה של החלבונים המטוהרים מושג, תנועה ארוכת טווח של CMG בנוכחות ATP תיראה, כפי שנצפה בקימוגרף המוצג באיור 2C.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67076/67076fig01v2.jpg"> איור 1: תיאור ציורי של אנסמבל היברידי ובדיקת מולקולה בודדת כדי לדמות ולכמת את התנועה של CMG משוחזר במלואו. (A) דנ"א ליניארי של 23.6 קילו-בתים המכיל מקור ARS1 טבעי של שכפול מתפקד באופן כפול בשני הקצוות עם מואיטים של דסתיוביוטין ודיגוקסיגנין. (B) דנ"א מתפקד כפליים קשור לחרוזים מגנטיים מצופים סטרפטווידין דרך ה-desthiobiotin moieties שלו. (C) CMG מורכב ומופעל בהדרגה על הדנ"א הקשור לחרוזים מגנטיים עם שלבי שטיפה שונים הכלולים כדי להסיר עודפי חלבון וצברי חלבונים לא קשורים. (D) דנ"א שלם: קומפלקסים של CMG מדוללים אז מהחרוזים המגנטיים על ידי תוספת של עודף ביוטין חופשי, אשר מתחרה באינטראקציה desthiobiotin-streptavidin. (E) קומפלקסים בודדים של דנ"א:CMG קשורים בין שני חרוזי פוליסטירן מצופים אופטית נגד דיגוקסיגנין בעזרת תא זרימה מיקרופלואידי. שימו לב שהאינטראקציה Dig-anti-Dig היא אורתוגונלית לאינטראקציות ביוטין-אבידין, ולכן היא אינה מושפעת מנוכחות ביוטין חופשי. (F) לאחר שהוחזקו במקומם על ידי הפינצטה האופטית, קומפלקסים של DNA:CMG מועברים לתנאי חיץ שונים, שבהם מישור הדנ"א נסרק באמצעות לייזר סורק קונפוקלי כדי לצלם את תנועת CMG לאורך הדנ"א לאורך זמן. (G) הלוח העליון מציג דיאגרמה של קומפלקס DNA:CMG המוחזק במקומו בין שני חרוזי פוליסטירן מצופים אנטי-דיג לכודים אופטית שנסרקים על ידי לייזר סריקה קונפוקלי. הלוח התחתון מציג סריקה דו-ממדית לדוגמה של CMG הקשור לדנ"א המוחזק במקום באמצעות מלכודת אופטית. הדנ"א אינו מסומן בניסויים אלה, אך ניתן לחשוב עליו כעל קו אופקי העובר במרכז התמונה. נתון זה שונהמ-28. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67076/67076fig01largev2.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67076/67076fig02.jpg"> איור 2: דוגמאות לנתונים מניסוי מוצלח ומניסוי כושל. (A) סריקות דו-ממדיות לדוגמה של דנ"א המכיל CMG בדגימה נטולת צבירה. בשתי הסריקות, CMG מראה כתמים סימטריים ובדידים מוגבלי עקיפה המפוזרים בדלילות לאורך הדנ"א. (B) סריקות דו-ממדיות לדוגמה של דנ"א המכיל CMG בדגימה המכילה אגרגטים. בשתי הסריקות, CMG יוצר כתמים פחות סימטריים המצטופפים בדנ"א. (C) קימוגרף המראה את המיקום על הדנ"א של נקודות מוגבלות עקיפה CMG לאורך זמן בנוכחות ATP, מראה את התנועה ארוכת הטווח של קומפלקסים CMG. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67076/67076fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

אנו מדווחים על אנסמבל היברידי ובדיקת מולקולה בודדת כדי לצלם ולכמת ישירות את התנועה של מנחת מסוקים Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG) המסומן באופן פלואורסצנטי ומשוחזר במלואו על מולקולות דנ"א ליניאריות המוחזקות במקומן במלכודת אופטית.

אנסמבל היברידי ובדיקת מולקולה בודדת כדי לדמות את התנועה של CMG משוחזר במלואו

Eukaryotes have one replicative helicase known as CMG, which centrally organizes and drives the replisome, and leads the way at the front of replication ...

hybrid-ensemble-single-molecule-assay-to-image-motion-fully

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

סרטון וידאו זה מתאר שיטה להמחשת הרכבה של חלבון היתוך מעובה על מולקולות DNA באתרים ספציפיים באמצעות הדמיה של מולקולה יחידה. עיבויים אלה נוצרים כתוצאה מאינטראקציות LCD-LCD ו-LCD-DBD, המאפשרות גיוס של RNA פולימראז II ושעתוק גנים משופר.

הדמיה של מולקולה בודדת להדמיית חלבון היתוך מעבה הרכבה על וילונות DNA

כאן אנו מתארים את המכשור ושיטות לגילוי מולקולות חלבון בודד fluorescently שכותרתו אינטראקציה עם מולקולת DNA חד התלויה בין שני microspheres הלכוד אופטי.

שילוב מניפולציה מולקולה בודדת והדמיה לחקר אינטראקציות החלבון-DNA

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לקבל נתונים smFRET תלת-צבעי וניתוח שלה עם אנסמבל תלת-ממד מודל מרקוב חבוי. מתוך תפיסה זו, מדענים יכולים לחלץ מידע קינטי מערכות חלבונים מורכבים, כולל cooperativity או אינטראקציות מתואם.

באמצעות תלת-צבעי קשת/קשתית מולקולה בודדת ללמוד הקורלציה של אינטראקציות חלבון

3D מיקרוסקופ לוקליזציה יחיד מולקולה מנוצל כדי לחקור את המיקומים מרחבי ומסלולי תנועה של חלבונים המסומנים באנרגיה בתאי בקטריאלי חיים. פרוטוקול ניתוח הנתונים הניסיוני והמידע המתואר להלן קובע את ההתנהגויות התפוצזות הנפוצות של חלבונים ציטוסולמים בהתבסס על מסלולים בעלי מולקולה בודדת.

מיקרוסקופ מעקב חד-מולקולה-כלי לקביעת המדינות התפוצבניות של מולקולות ציטוסולג

מוצג כאן הוא פרוטוקול לביצוע מולקולה בודדת Förster העברת אנרגיה ללמוד החלטה ג'ונסון. עירור שני הצבעים משמש לקביעת קבועי הדיסוציאציה. הזמן חד צבע לשגות smfret הוא לאחר מכן בזמן אמת מחשוף בחני להשיג את התפלגות זמן לשכון לפני הרזולוציה ג'ונסון.

מולקולה בודדת Förster שיטות העברת אנרגיה בזמן אמת על החלטה של צומת הולידיי-GEN1

מעקב אחר אירועי תרגום בודדים מאפשר מחקרים קינטיים ברזולוציה גבוהה של מנגנוני תרגום תלויי כובע. כאן אנו מדגימים מבחנה במבחנה של מולקולה אחת המבוססת על אינטראקציות הדמיה בין נוגדנים בעלי תווית פלואורסצנטית לפפטידים המתהווים המתויגים באפיטופ. שיטה זו מאפשרת אפיון מולקולה אחת של קינטיקה של חניכה והתארכות פפטיד במהלך תרגום פעיל תלוי כובע במבחנה.

מבחני הדמיה של מולקולות בודדות במבחנה לניתוח קינטיקה של תרגום תלוי-כובע

מוצג כאן הליך לבטא ולטהר מיוסין 5a ואחריו דיון על אפיון שלה, באמצעות הרכב ומולקולה אחת במבחנה מיקרואורסצנטיות מבוססות בדיקות, וכיצד שיטות אלה ניתן לשנות עבור אפיון של מיוסין nonmuscle 2b.

התאמות ספציפיות מיוסין של במבחנה פלואורסצנטית מיקרוסקופיה מבוססות ישבן

כאן, תיאור מפורט של הפרוטוקול מיושם במעבדה לרכישה וניתוח של 15N פרופילי פיזור הרפיה על ידי פתרון ספקטרוסקופיה NMR מסופק.

15 (15) N פיזור הרפיה CPMG לחקירת דינמיקה קונפורמטיבית חלבון על ציר הזמן μs-ms

קינסין-5 Cin8 המיטוטי הדו-כיווני מצטבר באשכולות המתפצלים ומתמזגים במהלך תנועתיותם. הצטברות באשכולות משנה גם את המהירות והכיווניות של Cin8. כאן מתואר פרוטוקול לבדיקות תנועתיות עם Cin8-GFP מטוהר וניתוח תכונות תנועתיות של מולקולות בודדות ואשכולות של Cin8.

תנועתיות של מולקולות בודדות ואשכולות של קינסין-5 Cin8 דו-כיווני מטוהרים מתאי S. cerevisiae

חלבונים רבים בעלי הפרעה פנימית הוכחו כמשתתפים בהיווצרות של עיבוי ביומולקולרי דינמי מאוד, התנהגות חשובה לתהליכים תאיים רבים. במאמר זה אנו מציגים שיטה מבוססת הדמיה של מולקולה בודדת לכימות הדינמיקה שבאמצעותה חלבונים מתקשרים זה עם זה בעיבויים ביומולקולריים בתאים חיים.

מדידה של מולקולה בודדת של דינמיקת אינטראקציה של חלבונים בתוך עיבויים ביומולקולריים

פרוטוקול זה מדגים ביצוע בדיקת מולקולה בודדת להדמיה חיה של שחרור DNA על ידי מנחת מסוקים CMG. הוא מתאר (1) הכנת מצע דנ"א, (2) טיהור פלואורסצנטי המסומן כמנחת מסוקים Drosophila melanogaster CMG, (3) הכנת תא זרימה מיקרופלואידי למיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת (TIRF), ו-(4) בדיקת שחרור DNA של מולקולה יחידה.

הדמיה בזמן אמת של מולקולה בודדת של שחרור DNA על ידי מנחת מסוקים CMG

חקור את דינמיקת התנועה של הליקאז CMG ברמת מולקולה בודדת באמצעות שילוב של ביוכימיה אנסמבל ומיקוד אופטי. שיטה זו מאפשרת למדענים לחקור תהליכי שכפול DNA באופן כמותי.

אנסמבל היברידי ובדיקת מולקולה בודדת כדי לדמות את התנועה של CMG משוחזר במלואו

גלה סרטונים נוספים