Name: הבנת התפתחותם של מסלולי פיצוי בטפיל מלריה מוטנטי בעל אלל היפומורפי של קינאזות דמויות צמחים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-22T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: חקור מסלולי פיצוי בטפילי מלריה בעלי אלל היפומורפי של קינאזות חיוניות באמצעות CRISPR-Cas9. המחקר מציע כי עיכוב כפול של קינאזות עשוי למנוע התפתחות עמידות לתרופות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>זיהוי חיווט מחדש של קינאזות בטפיל מלריה: גישה גנטית כימית

<table><tbody><tr><td>קוקטייל מעכב פוספט 1x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>04906 845001</td><td></td></tr><tr><td>AflII</td><td>NEB</td><td>R0520S</td><td></td></tr><tr><td>Albumax II&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11021-037</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד GST</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>G7781</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר HRP</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A4416</td><td></td></tr><tr><td>נגד ארנב HRP</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A6154</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>R3136S</td><td></td></tr><tr><td>BtgZ1</td><td>NEB</td><td>R0703S</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>ThermoFisher </td> צנטריפוגה <td>מדעית Sorvall legend micro 17R</td><td></td></tr><tr><td>( לכדורי תא חיידקים)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Sorvall ST 8R</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה (לטפיל כדורים/עיבוד)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Sorvall ST 8R (רוטור TX-400)</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>NEB</td><td>RO1765</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbitol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876</td><td></td></tr><tr><td>E. coli BLR(DE3) pLysS תאים מוכשרים</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69956</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DH5a תאים מוכשרים</td><td>Takara Bio</td><td>9057</td><td></td></tr><tr><td>קוביות אלקטרופורציה, פער של 0.2 ס"מ</td><td>BioRad</td><td>1652086</td><td></td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>BioRad</td><td>GenePulser Xcell</td><td></td></tr><tr><td>femtoLUCENTTM PLUS HRP מגיב כימילומינסנט</td><td>G-Bioscience</td><td>7860-003</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15750078</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa Stain</td><td>Himedia</td><td>S011-100ML</td><td></td></tr><tr><td>גלוטתיון Sepharose 4B</td><td>GE Healthcare</td><td>17075601</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, חומצה חופשית</td><td>Merck</td><td>391338</td><td></td></tr><tr><td>היפוקסנטין</td><td>Merck</td><td>4010CBC</td><td></td></tr><tr><td>ערכת שיבוט In-fusion HD</td><td>Takara Bio</td><td>1711641A</td><td></td></tr><tr><td>iQ SYBR Green Supermix</td><td>BioRad</td><td>1708880EDU</td><td></td></tr><tr><td>MBP, זרחן</td><td>&nbsp; Merck</td><td>13-110</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>NEB</td><td>R3189S</td><td></td></tr><tr><td>נוקלאובונד Xtra Maxi EF&nbsp; &nbsp;</td><td>Takara Bio 740424</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin ג'ל וניקוי PCR מיני ערכה</td><td>Takara Bio</td><td>740609</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>p-nitrobenzyl mesylate (PNBM)</td> <td>Abcam</td><td>Ab138910</td><td></td></tr><tr><td>Primestar Max DNA פולימראז</td><td>Takara Bio</td><td>R045A</td><td></td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז</td><td>רוש</td><td></td><td></td>11836170001</tr><tr><td>Qiaprep Spin Miniprep Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QuikChange II XL ערכת מוטגנזה מכוונת אתר</td><td>Agilent</td><td>200521</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31800-105</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>SpeI-HF</td><td>NEB</td><td>R3133S</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III ערכת סינתזה של גדיל ראשון</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080-051</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15224017</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן אסתר תיופוספט</td><td>Abcam</td><td>Ab92570</td><td></td></tr></tbody></table>

הבנת התפתחותם של מסלולי פיצוי בטפיל מלריה מוטנטי בעל אלל היפומורפי של קינאזות דמויות צמחים

Understanding the Development of Compensatory Pathways in a Mutant Malaria Parasite Harbouring Hypomorphic Allele of Plant-Like Kinases

WT CDPK1 רקומביננטי מבוטא כחלבון היתוך עם תג N-terminal Glutathione S-transferase (GST) ומטוהר באמצעות כרומטוגרפיית זיקה GST. חלבון CDPK1 המטוהר זוהה באמצעות כתם מערבי באמצעות נוגדנים נגד CDPK1 ונוגדנים נגד GST (איור 1). שאריות שומר הסף של תראונין (T145) ב-WT CDPK1 הוחלפו ב-Met וב-Ser תוך שימוש במוטגנזה מכוונת אתר כדי ליצור חלבונים רקומביננטיים CDPK1T145M ו-CDPK1T145S מוטנטיים, בהתאמה (איור 2). בדיקת קינאז במבחנה נעשתה כדי להעריך את פעילות הקינאז של כל חלבוני CDPK1 רקומביננטיים. פעילות הקינאז נבדקה באמצעות גישת תיוג אפיטופים חצי סינתטית34 על-ידי זיהוי קבוצת אסטר תיו-פוספט באמצעות נוגדן ספציפי בפורמט כתם מערבי (איור 3). ההשפעה של החלפת שומרי סף על פעילות האוטופוספורילציה של CDPK1 והטרנספוספורילציה של MBP המשמש כמצע אקסוגני של CDPK1 הוערכה על ידי כימות העוצמה של רצועות האוטופוספורילציה והטרנספוספורילציה בהתאמה. CDPK1 מוטנטי עם שומר סף מתיונין שמר על ~ 53% פעילות טרנספוספורילציה, בעוד שנוכחות של סרין בעמדת שומר הסף הובילה לביטול מוחלט של טרנספוספורילציה של המצע (איור 3). SNPs המובילים להחלפת שוער מ-Thr ל-Met (T145M) הונדסו בלוקוס cdpk1 אנדוגני באמצעות CRISPR-Cas9 באמצעות מערכת דו-פלסמידית (איור 4 ואיור 5). לא ניתן היה ליצור טפילים מוטנטיים עם תחליפי T145S, אולי בשל ההשפעה הקטלנית של שומר הסף Ser על פעילות CDPK1. CDPK1T145M הטפילים המוטנטיים שובטו בשיטת הדילול המגביל, והחלפת שומר הסף אושרה באמצעות ריצוף סנגר כדי לאמת את היווצרות הטפיל המוטנטי CDPK1T145M. רמות תעתיק של 11 קינאזות שונות, כולל 7 בני משפחת CDPK ו-4 קינאזות אחרות שהיו מעורבות בהתפתחות סכיזוגונית מאוחרת של הטפיל, נבדקו באמצעות PCR בזמן אמת (איור 6). רמות הביטוי של 11 קינאזות שונות הושוו בין CDPK1T145M הטפילים המוטנטיים והטפילים מסוג בר (WT), שנורמלו לגנים של משק הבית. ביטוי התעתיק של בני משפחת CDPK השתנה במוטציה CDPK1T145M בהשוואה לטפיל WT (איור 6). תמלילים המראים ביטוי גבוה יותר במוטנט CDPK1T145M עשויים לפצות על תפקודו של CDPK1 בטפיל המוטנטי CDPK1T145M.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig01.jpg"> איור 1: אפיון של סוג בר רקומביננטי באורך מלא (WT) PfCDPK1. חלבון WT CDPK1 באורך מלא שהתמזג עם תג N-terminal Glutathione S transferase (GST) טוהר על ידי כרומטוגרפיית זיקה והופרד ב-10% SDS-PAGE. CDPK1 נדד למסה המולקולרית החזויה של ~ 87 kDa, כפי שמוצג בג'ל הפוליאקרילאמיד המוכתם Coomassie Brilliant Blue R-250. חלבון רקומביננטי שהופרד ב-SDS-PAGE הועבר לקרום PVDF ועובד לניתוח כתמים מערביים עם נוגדנים נגד CDPK1 ו-anti-GST. פס המתאים ל-CDPK1 רקומביננטי באורך מלא ב-SDS-PAGE זוהה עם שני הנוגדנים, מה שאישר את זהות החלבון. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig02.jpg"> איור 2: אפיון חלבונים מוטנטיים רקומביננטיים מטוהרים של CDPK1. (A) יישור רצף חומצות האמינו הראשוניות של TgCDPK1 ו-PfCDPK1 (Plasmodb accession no. PF3D7_0217500). תראונין במיקום 145 של PfCDPK1 מתאים לגליצין 128, עמדת שומר הסף ב-TgCDPK1 (מסומן באדום). (B) ייצוג קריקטוריסטי של שאריות שומר הסף Thr (מסומנות באדום) המקודדות על ידי קודון משולש ACC (עיגול שחור) ב-WT CDPK1. החלפת שאריות שומר הסף במוטגנזה מכוונת אתר ליצירת חלבוני CDPK1 מוטנטיים רקומביננטיים עם Met (מודגש בצהוב) ב-CDPKT145M ו-Ser (מודגש בכחול) ב-CDPKT145S. (C) פרופיל SDS-PAGE של WT רקומביננטי וחלבונים מוטנטיים של CDPK1. החלבונים המוטנטיים הרקומביננטיים WT ושומר הסף טוהרו על ידי כרומטוגרפיית זיקה GST והופרדו ב-SDS-PAGE. כל החלבונים הרקומביננטיים מתאימים למשקל המולקולרי הצפוי של ~87 kDa. M- סולם משקל מולקולרי. (D) אפיון של CDPK1 WT רקומביננטי וחלבונים מוטנטיים באמצעות כתם מערבי. החלבונים המוטנטיים הרקומביננטיים WT ושומר הסף של CDPK1 הופרדו ב-SDS-PAGE והועברו לקרום PVDF לצורך כתישה מערבית. רצועות המתאימות לחלבוני WT רקומביננטי באורך מלא וחלבוני CDPK1 מוטנטיים ב- SDS-PAGE זוהו עם נוגדנים נגד CDPK1 ו- anti-GST, המאשרים את זהותם של כל החלבונים הרקומביננטיים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig03.jpg"> איור 3: החלפת שומרי סף ב-CDPK1 מובילה לירידה בפעילות הקינאז של אנזימים מוטנטיים. (A) ייצוג קריקטוריסטי של גישת תיוג אפיטופים סינתטית למחצה לזיהוי פעילות קינאז של חלבון CDPK1. רק פעילות טרנספוספורילציה מתוארת כאן. חלבון CDPK1 thiophosphorylates מצע אקסוגני (S, ריבוע ירוק מוצק) בנוכחות ATPγS (משולש צהוב מוצק), מקור לקבוצת תיופוספט טרמינלית ניתנת להעברה). השארית thiophosphorylated הוא alkylated על ידי טיפול עם p-nitrobenzyl mesylate (PNBM), יצירת אסטר thiophosphate כי הוא מזוהה לאחר מכן עם נוגדן המזהה באופן ספציפי alkylated thiophosphate adduct. (B) בדיקת פעילות קינאז במבחנה באמצעות גישת תיוג אפיטופ סינתטי למחצה שימשה לבדיקת ההשפעה של החלפת שומר סף על פוטנציאל האוטופוספורילציה והטרנספוספורילציה של חלבונים מוטנטיים רקומביננטיים CDPK1. כל החלבונים הרקומביננטיים מפגינים פעילות קינאז תלוית סידן. זרחן אוטומטי של CDPK1 וטרנס-פוספורילציה של חלבון בסיסי מיאלין (MBP), מצע אקסוגני, ניכר רק בנוכחות סידן כלורי (Ca2+), בעוד שלא זוהה זרחן בנוכחות EGTA, כלטור ספציפי של יוני Ca2+ . מוטציות שומרי הסף מראות פעילות אוטופוספורילציה מופחתת, בעוד שהטרנספוספורילציה של MBP בוטלה לחלוטין בשנת CDPK1T145S. CDPK1T145M שומר על פוטנציאל טרנספוספורילציה (~ 53%) כפי שדווח קודם לכן32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig04.jpg"> איור 4: בניית פלסמידים להחדרת SNPs בעמדת שומר סף בלוקוס cdpk1 באמצעות CRISPR-Cas9. רצף מנחה של 20 נוקלאוטידים המתאימים ל-432 עד 451 bp שובט באתר ההגבלה BtgZI בפלסמיד pL6eGFP כדי ליצור pL6CK1G. זרוע הומולוגיה (421 bp) המשלבת את SNPs הרצויים (T145M או T145S, קודון תואם מוצג בירוק) יחד עם מוטציות מגן (מוצג באדום) שובטה ב-pL6CK1G בתוך אתרי אנזימי הגבלה AflII ו-SpeI כדי ליצור pL6CK1GT145M ו-pL6CK1GT145M, בהתאמה. מוטציות מגן מונעות חיתוך מחדש של הלוקוס שהשתנה לאחר העריכה הרצויה. Cas9 endonuclease מקודד בפלסמיד שני, pUF1 מופנה לאתר המטרה בתוך מוקד cdpk1 בעזרת RNA מנחה מבוטא מפלסמיד pL6CK1GT145M/S . Cas9 מציג שבירת גדיל כפול באתר המטרה לכיוון צד 5' של רצף PAM. ה- DSB מתוקן באמצעות זרוע הומולוגיה בפלסמיד pL6CK1GT145M/S . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig05.jpg"> איור 5: ייצוג סכמטי של P. transfection falciparum עם פלסמידים CRISPR להכנסת מוטציית שומר הסף (T145M) בלוקוס cdpk1 . i) אסינכרוני P. תרבית פלציפרום מטופלת בסורביטול כדי להשיג טפילים מסונכרנים בשלב הטבעת. ii) טפילים מסונכרנים בשלב הטבעתי נלקחים בקובט אלקטרופורציה יחד עם פלסמידים pL6CK1GT145M/S ו- pUF1 המרחפים מחדש בתמיסת חיץ. 3) הטפילים מחושמלים במתח של 310 וולט, 950 מיקרו-פרנהייט ועמידות אינסופית. ד) לאחר הטרנספקציה, הטפילים מועברים לבקבוק T25 המכיל תווך RPMI שלם טרי (cRPMI) ומתורבתים במשך 48 שעות. לאחר 48 שעות, הטפילים הנגועים עוברים ל- cRPMI בתוספת התרופות WR99210 ו- DSM267 ומורחבים בבקבוק T75. v) ביום ה-14 מכינים מגלשות ומוכתמות באמצעות כתם Giemsa. vi) לאחר מכן, כתם הדם הוא דמיינו תחת מיקרוסקופ אור כדי להעריך את נוכחותם של RBCs טפילים. vii) עם הדמיה, הטפילים מורשים לגדול בנוכחות סמים. לאחר מכן, הטפילים מעובדים כדי לקבל את התבנית עבור PCR וריצוף DNA לאימות השינוי הרצוי של מוקד היעד cdpk1 . viii) לאחר האימות, טפילים טרנסגניים שבטיים מתקבלים על ידי הגדרת דילול מגביל בצלחת 96 בארות. ix) טפילים טרנסגניים משובטים מבארות חיוביות מועברים לצלוחיות T25 ומורשים לגדול. x) טפילים טרנסגניים שבטיים מאומתים עוד יותר באמצעות PCR ונוכחות SNPs רצויים בעמדת שומר הסף באמצעות ריצוף DNA וניתוח הכרומטוגרמה. הנתון שונהמ-32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig06.jpg"> איור 6: ייצוג סכמטי של השלבים המשמשים לניתוח תעתיק של גני מטרה באמצעות PCR (RT-PCR בזמן אמת). ט) פ. תרבית פלציפרום עם טפילי שלב סכיזונט בוגרים בעיקר מתקבלת באמצעות טיפול סורביטול באותו מחזור. ii) הטפילים מוכנסים בעדינות בשכבות על שיפוע של 70/40 פרקול/סורביטול בצינור חרוטי של 15 מ"ל להעשרת טפילי שלב סכיזונט בוגרים. iii) הטבעת השחורה בשלב הביניים של 40% ו-70% אישי/סורביטול מועברת לצינור טרי של 50 מ"ל, מעובדת ומושעה מחדש ב-cRPMI. הטפילים המועשרים בשלב סכיזונט מודגרים עם RBCs טריים מודגרים מראש ב 37 מעלות צלזיוס לפלישה. iv) הטפילים מתורבתים במשך 4 שעות ולאחר מכן מטופלים עם 5% סורביטול כדי לקבל טפילים מסונכרנים מאוד 0-4 שעות שלב הטבעת. v) הטפילים עוברים תרבית נוספת לטיפול נוסף של 44 שעות לאחר סורביטול כדי לקבל טפילי שלב סכיזונט מסונכרנים מאוד של 44-48 שעות. vi) הטפילים המסונכרנים מטופלים בסאפונין כדי לשחרר אותם מה-RBCs ומאוחסנים בריאגנט מיצוי RNA. סך כל הרנ"א מבודד מטפילי מיצוי הרנ"א. vii) cDNA מוכן מהרנ"א המבודד. viii) ניסוי PCR בזמן אמת מוגדר עם תבנית cDNA כדי להגביר את גני המטרה באמצעות פריימרים ספציפיים לגנים. הצלחת מופעלת על מערכת PCR בזמן אמת. ix) נתוני ביטוי התמליל מנותחים באמצעות תוכנת ניתוח. הגרף מייצג רמות ביטוי תעתיק דיפרנציאלי של 11 קינאזות בטפילי CDPK1 T145M בהשוואה לסוג הבר (WT). נתון זה שונה מ32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>שם גן</td>
			<td colspan="4">רצף פריימר</td>
		</tr><tr><td>Pk1fpgex</td>
			<td colspan="4">ATGCGCGGATCCATGGGGTGTTCACAAAGTTCAAACG</td>
		</tr><tr><td>Pk1rpgex</td>
			<td colspan="4">ATGCGCGCGCGGCCGCTTATGAAGATTTATTATCAAATTTTGTGCATC</td>
		</tr><tr><td>Ck1T145S</td>
			<td colspan="4">GTTTGATGTTTTTGAAGATAAGAAATATTTTTATTTAAGCGAATTATTATGAAGGTGGGGAA</td>
		</tr><tr><td>Ck1T145S_antisense</td>
			<td colspan="4">TTCCCCACCTTCATAAAATTCGCTTACTAAATAAAATATTTCTTATCTTCAAAAACATCAAAC</td>
		</tr><tr><td>CK1T145M</td>
			<td colspan="4">GTTTGATGTTTTTGAAGATAAGAAATATTTTTATTTAGTAATGATTATTATGAAGGTGGGGAA</td>
		</tr><tr><td>Ck1T145M_antisense</td>
			<td colspan="4">TTCCCCACCTTCATAAAATTCCATTACTAAAAAAATATTTCTTATCTTCAAAAACATCAAAC</td>
		</tr><tr><td>Ck1GUIDEFWD</td>
			<td colspan="4">TAAGTATATAATATTATTAACCGAATTTTATGAAGGTGGTTTTAGAGCTAGAA</td>
		</tr><tr><td>Ck1GUIDEREV</td>
			<td colspan="4">TTCTAGCTCTAAAACCACCTTCATAAAATTCGGTTAATATTATATACTTA</td>
		</tr><tr><td>ck1f1 </td>
			<td colspan="4">ATTTTCTTTTCTGAACGTGTAACATG</td>
		</tr><tr><td>ck1r3wt</td>
			<td colspan="4">TGCATCTCTTAATCTCTCCTCACTG</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: רשימת פריימרים ששימשו במחקר.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>שם הגן</td>
			<td colspan="2">פריימר קדמי</td>
			<td colspan="2">פריימר הפוך</td>
		</tr><tr><td>CDPK1 (PF3D7_0217500)</td>
			<td colspan="2">GGAAGAATTAGCAAATTTATTTGGTTTGACATC</td>
			<td colspan="2">ATGTTAACGAATTCATCAAAGTCAATCATGT</td>
		</tr><tr><td>CDPK2 (PF3D7_0610600)</td>
			<td colspan="2">GGAACAGGAGAATTTACAACGAC</td>
			<td colspan="2">TGTATACATAATAACACCACTAGACCAG</td>
		</tr><tr><td>CDPK3 (PF3D7_0310100)</td>
			<td colspan="2">CACGAAATATTGAGCATGGTAAAGAAGG</td>
			<td colspan="2">CAGCGTCCATTGTAAG ACATCTTTTTATTAAATC</td>
		</tr><tr><td>CDPK4 (PF3D7_0717500)</td>
			<td colspan="2">ATACTTCTCTCAGGGTGCCC</td>
			<td colspan="2">CTTATCACTAATTTTTTT GAATTGTGGTAAATCG</td>
		</tr><tr><td>CDPK5 (PF3D7_1337800)</td>
			<td colspan="2">GGAGGTCGAGATGGATACGAATAG</td>
			<td colspan="2">TATCGGCTAACGTACTCTTTGTCG</td>
		</tr><tr><td>CDPK6 (PF3D7_1122800)</td>
			<td colspan="2">CCTCCCGTAGATAATATATTATTATCTAG</td>
			<td colspan="2">ATCTGCTTCAATAAATCCCAATACATTTGC</td>
		</tr><tr><td>CDPK7 (PF3D7_1123100)</td>
			<td colspan="2">AGTCCTAAAAAAGATATA TAAAGAACTAGGTAGTAG</td>
			<td colspan="2">TTTAAAAATAATCTCTCCCCACAACCC</td>
		</tr><tr><td>PKA (PF3D7_0934800)</td>
			<td colspan="2">AATCATCCATTTTGTGTAAATTTACATGG</td>
			<td colspan="2">CTTTTGTTTCTTCTTAAA AATGTAAAAAATTCTCC</td>
		</tr><tr><td>PKG (PF3D7_1436600)</td>
			<td colspan="2">א</td>
			<td colspan="2">CATATCAATATCTTCTGAAAGCTTTTCCC</td>
		</tr><tr><td>PKB (PF3D7_1246900)</td>
			<td colspan="2">CACAATAGAAGAAATGATGTTCTTTTTTACG</td>
			<td colspan="2">GAGAGCGCAATTAGCCATATTG</td>
		</tr><tr><td>PI3K (PF3D7_0515300)</td>
			<td colspan="2">CCCCTTCAATTTGTGTGTGAAACAG</td>
			<td colspan="2">ATCACATTTGTTATACTT ATTATCATCACATTTGTT</td>
		</tr><tr><td>GAPDH (PF3D7_1462800)</td>
			<td colspan="2">GGAAGGAAAGATATCGAAGTAG</td>
			<td colspan="2">GGGTTACCTCACATGG</td>
		</tr><tr><td>ThrRS (PF3D7_1126000)</td>
			<td colspan="2">CTTGGGAACTGCAGAGTAGAATTT</td>
			<td colspan="2">TAAAAATCCTCCGAACAATTTTTCTAAACTAC</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 2: רשימת גני המטרה (מספר זיהוי PlasmoDB) יחד עם רצף הפריימרים המשמשים לניתוח PCR בזמן אמת.

One of the mechanisms for subverting the effect of drugs by&#160;the malaria parasite is through rewiring of its transcriptome. The effect is more ...

understanding-development-compensatory-pathways-mutant-malaria

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בראיון זה, ג'ורג' Dimopoulos מתמקד מנגנונים פיזיולוגיים בשימוש על ידי יתושים להילחם Plasmodium falciparum וזיהומים וירוס דנגה. הסבר ניתנת כמה גנים עקשן מפתח, אותם גנים המקנה עמידות פתוגנים וקטור, מזוהות היתוש ועד כמה הידע הזה יכול לשמש כדי ליצור יתושים מהונדס כי אינם יכולים לשאת את טפיל המלריה או וירוס דנגה.

בניית יתוש עדיף: זיהוי הגנים הפעלת מלריה קדחת דנגי ההתנגדות ב א gambiae וא aegypti יתושים

חוצה גנטי של טפילי מלריה מכרסם מבוצעות על ידי האכלה two טפילים שונים גנטית יתושים. הצאצאים רקומביננטי הם משובטים מהדם לאחר עכבר המאפשר יתושים לנשוך עכברים נגועים. סרט הווידאו הזה מראה איך לייצר צלבי הגנטי...

פרוטוקול עבור הפקה של הצלב גנטית של טפילי מלריה מכרסמים

כאן, אנו מציגים גישה שיטתית לפיתוח רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, רגיש...

בדוגמנות Vivo של הגנום האנושי החולנית באמצעות Danio rerio

מיקרו-רנ"א אנושי עובר מאריתרוציטים מאריח לטפילי פלסמודיום פלציפרום. כאן מתוארות הטכניקות המשמשות להעברת מיקרו-רנ"א סינתטיים לאריתרוציטים מארחים ולבידוד כל ה-RNA מ-P. falciparum.  בנוסף, מאמר זה יפרט שיטה לבידוד פוליזומים ב-P. falciparum כדי לקבוע את התפוסה הריבוזומלית ואת פוטנציאל התרגום של תעתיקי טפילים.

שיטות כדי לחקור את תפקיד הרגולציה של RNA הקטן וריבוזומלי תפוסה של<em&gt; Falciparum Plasmodium</em

ברמה התת-תאית, אירועי איתות מווסתים באופן דינמי על ידי רמזים התפתחותיים וסביבתיים. כאן אנו מתארים פרוטוקול המשתמש במערכת הביטוי החולפת של הטבק כדי לנטר אינטראקציה דינמית של חלבון-חלבון ולחשוף ארגון מרחבי של העברת אותות בתאי צמחים.

הדמית ארגון מחדש מרחבית של מסלול איתות MAPK שימוש במערכת הביטוי החולפת הטבק

בשל הדמיון הבולט של מחזור החיים ביולוגיה של טפילים מלריה מכרסמים לטפילים מלריה אדם, מודלים מלריה מכרסם הפכו חיוניים למחקר מלריה. בזאת, אנו מתוקננת כמה מן הטכניקות החשובות ביותר בשימוש בניתוח פנוטיפ של פראי סוג ומלריה מכרסם הטרנסגניים.

ניתוח פנוטימית של מלריה מכרסם טפיל מינית ושלבי דם מיניים ושלבי יתוש

פרוטוקול זה מתאר אסטרטגיה optogenetic כדי לווסת מיטוגן המופעל חלבון קינאז (MAPK) פעילות במהלך התמיינות תאים והתפתחות עובריים Xenopus . שיטה זו מאפשרת הפעלה הפיכה של המסלול איתות MAPK בתרבית תאים יונקים ועל אורגניזמים חיים תאיים, כמו עוברי Xenopus , עם רזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה.

אור בתיווך אפנון הפוך של מיטוגן המופעל חלבון קינאז נתיב במהלך הבחנה Cell ו<em&gt; קסנופוס</em&gt; התפתחות עובריים

אנו מתארים שיטה ליצירת glmS-המבוסס על מוטציות תמונות ציפורים מותנה ב- falciparum הפלזמודיום באמצעות עריכת הגנום CRISPR/Cas9.

CRISPR/Cas9 ג'ין עריכה כדי להפוך מותנה מוטציות של בני אדם טפיל המלריה falciparum פ

במאמר זה, הצגנו מערכת של שיטות מעשיות ושימושיות לאפיון מוטציות הקשורות למחלות של משפחת חיל-החוץ, הכוללים בתוך שיטת ההפעלה המבחנה, שיתוף הפעולה של החיל המלכותי הבריטי, ובחינה משלימה של פיצול לוציפראז.

אפיון מוטציות הקשורות למחלות של חיל המשפחה באמצעות קבוצה של שיטות מעשיות ושימושיות

מוצג כאן פרוטוקול המשתמש בפרומסטיגוטים גדולים של לישמניה כדי לקבוע את הקשירה, הציטוטוקסיות והאיתות המושרים על ידי רעלנים היוצרים נקבוביות. הוכחת היתכנות עם סטרפטוליזין O מסופקת. רעלנים אחרים יכולים לשמש גם כדי למנף את המוטציות הגנטיות הזמינות בל' מז'ור כדי להגדיר מנגנונים חדשים של עמידות לרעלנים.

פענוח המנגנון המולקולרי והתפקוד של רעלנים יוצרי נקבוביות באמצעות לישמניה מז'ור

חקור מסלולי פיצוי בטפילי מלריה בעלי אלל היפומורפי של קינאזות חיוניות באמצעות CRISPR-Cas9. המחקר מציע כי עיכוב כפול של קינאזות עשוי למנוע התפתחות עמידות לתרופות.

הבנת התפתחותם של מסלולי פיצוי בטפיל מלריה מוטנטי בעל אלל היפומורפי של קינאזות דמויות צמחים

גלה סרטונים נוספים