קביעת תפקוד ריסני ואטימות הממברנה של אפיתל דרכי הנשימה הריאה הפסאודוסטרטי

המחקר שלנו נועד למדוד שתי תכונות ביופיזיקליות קריטיות של אפיתל דרכי הנשימה pseudostratified, אשר ניתן להשיג על ידי התמיינות תאי אפיתל סימפונות אנושיים נורמליים בממשק נוזלי אוויר. זיהינו מאפיינים שונים של נגיפים נשימתיים שונים באמצעות אפיתל של דרכי הנשימה. לדוגמה, דלקת ציטו-שלד המונעת על ידי וירוס סינסיטיאלי נשימתי, שהוא מנגנון לא קנוני של ברונכיוליטיס.

זיהינו גם היפרפלזיה של תאי גביע מגבירה את שכפול SARS-CoV-2 באפיתל דרכי הנשימה של מחלת ריאות חסימתית כרונית. התמקדנו בהבהרת המנגנון של אפנון נשימתי סינסיטיאלי מונע על ידי וירוסים של איתות ציטו-שלד כדי לזהות מטרות טיפוליות חדשות למאבק בזיהום RSV ובברונכיוליטיס הנגרמת על ידי הנגיף. כדי להתחיל, לקחת אפיתל סימפונות אנושי רגיל, או NHBE, השעיית התא.

עם פיפטה P200, להוסיף 50, 000 תאים מרחפים ב 200 מיקרוליטר של תא אפיתל מלא של דרכי הנשימה, או AEC, בינוני לצד האפי של החדר. לדגור על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור תרבית תאי פחמן דו-חמצני בלחות של 85% עד 95%. ברגע שהתאים נפגשים, מעבירים את התוספות לבאר ריקה באמצעות מלקחיים סטריליים.

באמצעות פיפטה P1000, שואפים את כל מדיום AEC הבסיסי. לאחר מכן, הוסף 500 מיקרוליטר של מדיום התמיינות ALI מלא טרי בתוספת 2% פניצילין-סטרפטומיצין ו 1% אמפוטריצין B לבאר הבסיסית. בעזרת מלקחיים סטריליים, מעבירים את התוספות לבאר הבסיסית עם תוספת תווך ALI שלם.

בעזרת פיפטה P200 שואפים בעדינות את מדיום AEC האפי מהבאר ודגרים עליו. לאחר 48 שעות, מעבירים את התוספות לבאר ריקה עם מלקחיים סטריליים. באמצעות פיפטה P1000, שואפים את המדיום הישן ומוסיפים 500 מיקרוליטר של מדיום ALI שלם טרי.

מחזירים את התוספות לבאר עם מדיום טרי בעזרת מלקחיים סטריליים. ביום ה-26, באמצעות פיפטה P200, מוסיפים 100 מיקרוליטר DPBS לצד האפי של התוספות. דוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור תרבית תאים לח למשך 30 דקות.

לאחר מכן, שאפו את ה-DPBS באמצעות פיפטה P200. כדי להתחיל, הפעל את המיקרוסקופ, את המחשב המחובר ואת תא הסביבה. פתחו את דלת התא והניחו את הצלחת המכילה את התוספות עם תאי NBHE על במת המיקרוסקופ.

ברגע שהצלחת נמצאת על הבמה, סגרו את החדר. לאחר מכן, השתמש בידית ההפעלה של שלב המיקרוסקופ כדי להזיז את הצלחת ולהביא את התוספות לתצוגה. במסך המחשב, לחץ על סמל מערכת SAVA כדי לפתוח את תוכנית SAVA.

בממשק התוכנה, לחץ על הגדר ניסוי. בכרטיסייה הבאה, לחץ על צור ניסוי. לאחר מכן, בכרטיסיה החדשה, הזן את הספרייה שבה יאוחסנו הנתונים בשדה הזן שם מדריך ניסוי וספק פרטים בשדה הזן תיאור ניסוי ולאחר מכן לחץ על אישור. כעת, לחץ על הניסוי שנוצר ומוצג בספרייה תחת הקטע ניסויים.

לאחר מכן, לחץ על שנה וספק פרטים לדוגמה בשדה תיאור לדוגמה. לחץ/י על ״הוסף״ ולאחר מכן לחץ/י על ״יציאה״ כדי לצאת מהכרטיסייה. בממשק התוכנה הראשי, בחר את הניסוי שנוצר מהתפריט הנפתח בחריץ הניסוי.

לאחר מכן, לחץ על הקלט וידאו כדי לפקח על תדירות הפעימה הרירית על מסך המחשב. המסך יציג תנועה ריסנית ממוקדת. עבור כל הוספה, הקלט שישה שדות אקראיים שונים למשך 2.1 שניות בקצב של 120 פריימים לשנייה.

לחץ על שמור וידאו כדי לפקח על נתוני תדירות הפעימות הריסניות. כדי לנתח נתונים, לחץ על ניתוח וידאו בממשק התוכנה. ובכרטיסייה הבאה, לחץ על אישור. לאחר מכן עבור לכרטיסייה הבאה ולחץ על נתח הכל.

הורד את הגיליון האלקטרוני שנוצר עבור כל ניסוי בתיקיית SAVA Data Acquisition של המחשב. קח את התדירות הממוצעת של גאוס להצגת נתונים. תדירות הפעימה הרירית הגיעה לפחות לשלושה הרץ הן עבור אפיתל דרכי הנשימה של מבוגרים בריאים והן עבור אלה עם COPD, מה שמראה תפקוד ריסני דומה.

כדי להתחיל, הפעל את מד המתח EVOM2 וולט באמצעות מתג ההפעלה. חבר את נגד הבדיקה ל-EVOM2 בחריץ הקלט. עקוב אחר הקריאה במסך EVOM2.

אם הקריאה היא מעל או מתחת 1, 000, הפעל את מתג ADJ על EVOM2 באמצעות מלקחיים עד שהוא יציג קריאה אחידה של 1, 000 כדי לכייל את המכשיר. עכשיו, קח תוספת ריקה לקריאת הבקרה הניסויית. באמצעות פיפטה P200, הוסף 100 מיקרוליטר של DPBS לצד האפי של התוספת הריקה.

לאחר מכן, הוסף 500 מיקרוליטר של DPBS לצד הבסיס עם פיפטה P1000. לאחר מכן, נתק את נגד הבדיקה וחבר את אלקטרודת STX2 לחריץ הקלט ב-EVOM2. לאחר מכן, נקו בעדינות את אלקטרודת STX2 עם 70% אתנול.

הכנס את אלקטרודת STX2 למתקן הריק עם DPBS, תוך שמירה על רגל האלקטרודה הקצרה יותר בחלק האפי ורגל האלקטרודה הארוכה יותר בחלק הבסיסי. כעת, הקלט את הקריאה היציבה על מסך EVOM2. לאחר מכן, באמצעות פיפטה P200, להוסיף 100 מיקרוליטר של DPBS לצד האפי של ההכנסה.

הכנס את אלקטרודת STX2 לאינסרט עם אפיתל דרכי הנשימה המובחן למשך 26 יום, כפי שהוצג קודם לכן. לאחר מכן, הקלט את הקריאה היציבה על מסך EVOM2. ערכי ההתנגדות החשמלית Transepithelial עלו במבוגרים עם COPD, מה שמצביע על אטימות קרום משופרת ב- COPD.