ניתוח ייחודי לגדיל של חלבונים בשכפול גדילי DNA באמצעות העשרה וריצוף של שיטת DNA מתהווים הקשור לחלבונים

המחקר שלנו מתמקד במנגנון התורשה האפיגנטית. באופן ספציפי, שכפול ה-DNA צירף תהליך מיחזור היסטון הורי, המייצג את השלב הפולט הראשון בתורשה אפיגנטית. תצהיר היסטון הורי מרובה המעורב בשכפול DNA זוהה כממלא תפקיד חשוב במיחזור היסטון הורי.

זה כולל קומפלקס הליקאז D, DNA פולימראז ומתחם שכפול להגנה. גישות גנטיות וביוכימיות מסורתיות שימשו בתחום מחקר זה. באופן מסורתי, נעשה שימוש בשיטות ריצוף תפוקה גבוהות כדי להבין את תהליך העברת ההיסטון ההורי.

לפני שפותחה העשרה וריצוף של DNA הקשור לחלבון, או שיטת ניסוי, היה מאתגר לחקור את תהליך העברת ההיסטון ההורי. שיטת הניסוי סיפקה כלי רב עוצמה לענות על שאלות בסיסיות אלה. כדי להתחיל, יש לתייק את כדורי תאי השמרים ולהשעות אותם מחדש על ידי מערבולת עדינה.

לאחר מכן שטפו אותו עם 0.4 מיליליטר של מאגר ליזה CHIP המכיל מעכבי פרוטאז ותערובת אנטיביוטיקה למניעת זיהום חיידקי. צנטריפוגה את התערובת בחום של 5, 000 גרם למשך דקה. לאחר מכן, הוסף 0.1 מיליליטר של מאגר ליזה CHIP עם מעכבי פרוטאז ותערובת אנטיביוטיקה לגלולה.

ואחריו כ -100 מיקרוליטר של חרוזי זכוכית 0.5 מילימטר. ליזה את התאים על ידי חרוזי חרוזים במשך שלושה מחזורים בחדר קר של ארבע מעלות צלזיוס. בעזרת מחט חמה בגודל 16, חוררים חורים בתחתית הצינור.

אסוף את הליזאט על ידי קינון הצינור המנוקב לתוך צינור קשירה נמוך של DNA ריק של 1.5 מיליליטר, וצנטריפוגה ב-1,600 גרם למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. שאפו בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לגלולה. חלק פסולת התא יכיל את הכרומטין.

השעו מחדש את כדוריות התא על ידי פיפטינג פנימה של 0.35 מיליליטר של תוספת מיקרוקוק נוקלאז, או מאגר עיכול MNase. לאחר מכן, הוסף 10 יחידות MNase למתלה. מערבבים בעדינות על ידי היפוך ארבע עד שש פעמים, ודוגרים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.

להרוות את עיכול ה-MNase על ידי הוספת חמישה מיקרוליטרים של 0.5 EDTA מולארי לריכוז סופי של 10 מילימולר. מערבבים בעדינות על ידי היפוך, ומניחים את הצינור על קרח למשך 30 דקות לפחות. באמצעות מיקרו-צינורות ביורופטור של 1.5 מיליליטר, סוניקציה של תערובת התגובה בעוצמה גבוהה למשך שלוש דקות עם מחזורי הפעלה של 30 שניות ו-30 שניות כיבוי.

לאחר מכן, צנטריפוגה בחום של 10, 000 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. העבירו את הסופרנטנט לצינורות חדשים וצנטריפוגה שוב ב -10, 000 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, אספו כ-400 מיקרוליטרים של הסופרנטנט.

שמור 30 מיקרוליטר כ-DNA קלט למיצוי DNA והקפיא במינוס 20 מעלות צלזיוס. השתמש ב-370 המיקרוליטרים הנותרים של ליזאט תאים למשקעים חיסוניים של היסטון כרומטין. כדי להתחיל, הרתיחו כ -150 מיקרוליטר מדגימות הקלט שהושגו בעבר ו- H3K4me3 CHIP על גוש חום של 100 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות, מצננים מיד את הדגימה על קרח למשך חמש דקות.

לאחר מכן, הוסף את הכמות הנדרשת של הרכיבים שהוזכרו לדגימה. מוטציה של הדגימה למשך שעתיים על רוטור בארבע מעלות צלזיוס ו-10 סל"ד. מעבירים את התערובת לצינור של 1.5 מיליליטר המכיל 20 מיקרוליטר חרוזי חלבון שטופים G.

מוטציה של התערובת למשך שעה בארבע מעלות צלזיוס על הרוטור ב-10 סל"ד. סובב את הצינורות בטמפרטורת החדר ב 800 גרם למשך דקה. שטפו את החרוזים שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של Bromo-deoxyuridine קר, או BrdU immunoprecipitation buffer מסתובב במשך שלוש דקות לכל שטיפה.

צנטריפוגה שוב את הצינור ושטפו עם מיליליטר אחד של מאגר TE למשך שלוש דקות. סובב את הצינורות שוב בחום של 800 גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר, ושאף את הסופרנטנט בזהירות. הוסף לחרוזים 100 מיקרוליטר של מאגר TE עם 1% SDS.

דגרו על התערובת בחום של 65 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות, ואז סובבו בחום של 800 גרם למשך דקה בטמפרטורת החדר. טהר את הסופרנטנט ל-18 מיקרוליטר של מאגר פליטה באמצעות עמודות טיהור DNA כדי להשיג את דגימות BrdU immunoprecipitation ו-H3K4me3 eSPAN. הכן את ספריית ה-DNA החד-גדילית עם הדגימות שהוזכרו בעקבות המדריך לערכת הכנת ספריית ה-DNA ssDNA וקלט נמוך.

טהר את מוצר הקשירה ל-20 מיקרוליטר של מאגר EDTA Elution נמוך. הגבירו את ספריית ה-DNA באמצעות 50 מיקרוליטר של תערובת תגובה מתוך ערכת הכנת ספריית ה-DNA החד-גדילית. לאחר המחזור המוצג, הגבירו את תערובת ה-PCR.

טהר את מוצרי ה- PCR על ידי ערבובם עם 60 מיקרוליטר חרוזים, שחוממו מראש ל -30 מעלות צלזיוס. מערבבים היטב את מוצרי ה-PCR והחרוזים. תנו לתערובת לעמוד בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות.

קושרים את החרוזים על מעמד מגנטי למשך שלוש דקות ושוטפים אותם פעמיים עם 200 מיקרוליטר אתנול 80% טרי. יבש את החרוזים באוויר במשך שתי דקות, ודלל את ה-DNA ל-20 מיקרוליטר של מאגר EDTA נמוך המסופק בערכת ההכנה של ספריית ה-DNA. מדוד את ריכוז הספרייה ואת התפלגות גודל השבר באמצעות מערכות אלקטרופורזה ברזולוציה גבוהה.

אסוף כמויות שוות של ספריות בודדות, כולל קלט H3K4me3 כרומטין immunoprecipitation, BrdU immunoprecipitation, דגימות eSPAN לביצוע ריצוף קצה זוגי מקביל. ניתוח ג'ל טיפוסי של ספריית ריצוף ה-DNA של H3K4me3 eSPAN חשף דפוס סולם נוקלאוזום כרומטין. רצועת המונונוקלאוזום העיקרית הופיעה ב -270 זוגות בסיסים שבהם המתאמים נוספו למקטע ה- DNA שהתקבל מהעיכול.

מיפוי הדגימות השונות חשף שיאים בנוקלאוזומים בודדים המקיפים את המקור המשכפל באופן אוטונומי את רצף 607 בתאים מסוג בר ו-mcm2-3A. הטיית הגדיל הממוצעת גילתה כי בתאי שמרים מסוג בר, שקיעת היסטון הורית הראתה הטיה קלה לכיוון הגדיל המפגר. עם זאת, בהיסטון ההורי המוטנטי הועבר H3H4 לגדיל המוביל.