צינור מקיף להערכת היעילות של אריתרופואיזיס אנושי במבחנה ובחוץ גופית

המחקר שלנו מתמקד בלוקמיה, במיוחד תסמונות מיאלודיספלסטיות או ניאופלזיה מיאלודיספלסטית. זוהי מחלת תאי גזע שמקורה בתאי גזע המטופויאטיים. זה משפיע על שושלות שונות של תאי דם, במיוחד על שושלת אריתרואידים, האחראית על ייצור תאי הדם של הלב.

שיבוש של שושלת זו יכול להוביל לאנמיה, הנפוצה בחולי MDS. הצינור שאנו מספקים במאמר זה מאפשר שיטה חזקה ופשוטה להערכת יעילות אריתרובלסטים אנושיים במבחנה בעת שינוי גנים או טיפול תרופתי. תאי גזע המטופויאטיים נוכחים מלידה ועד לרגע האחרון של חיינו.

אין יותר רקמה מתפשטת באורגניזם שלנו עם טריליוני תאים המיוצרים מדי יום. יש עדיין כל כך הרבה דברים להבין, ולכן נמשיך לחקור את התאים המדהימים האלה ברקמות אמינו בריאות עם דגש חזק על פרוטאוסטזיס וביולוגיה של רנ"א. כדי להתחיל, הפשירו 100,000 תאי CD34+UCB על ידי טבילת הבקבוקון למשך 30 שניות באמבט מים המוגדר ל-37 מעלות צלזיוס.

הוסף מיליליטר אחד של חומר הפשרה טיפתי לבקבוקון, ולאחר מכן השהה בעדינות את התאים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. העבירו את מתלה התאים המושעה טיפה אחר טיפה לחמישה מיליליטר של מדיום הפשרה. לאחר מכן צנטריפוגה את תרחיף התא למשך שמונה דקות ב -320 גרם בטמפרטורת החדר.

שטפו את התאים ב-10 מיליליטר של מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטי או מאגר FACS עם DNAse. לאחר צנטריפוגה נוספת של התאים, השעו מחדש את הגלולה בשני מיליליטר של אמצעי גירוי. העבירו שני מיליליטר של תרחיף תאים לצלחת של 24 בארות ודגרו את הצלחת למשך ארבע עד שש שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן אספו את התאים בצינורות מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות ומלאו אותם במיליליטר אחד של מדיום תאי גזע. לאחר הפשרת הנגיף, הוסף את הנפח הנדרש לאמצעי הגירוי כדי להשיג ריבוי זיהום של 30. השעו מחדש את התאים הגלולים במדיה המכילה נגיף בצפיפות של 100,000 תאים לכל 100 מיקרוליטר של נגיף והעבירו אותם לבאר אחת של צלחת של 96 בארות.

מוסיפים PBS לבארות הריקות ודוגרים למשך הלילה בחום של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן העבירו את הנפח המלא של תרחיף התאים מהבאר של צלחת 96 הבארות לצינורות FACS עם מיליליטר אחד של מדיום תאי גזע. שטפו את הבאר ואת קצה הפיפטה במדיום תאי גזע כדי להוסיף שני מיליליטר של מדיום תאי גזע לצינור ה-FACS.

לאחר צנטריפוגה של צינור ה-FACS, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את גלולת התא בשני מיליליטר של אמצעי התפשטות. העבירו את המתלה לבאר של צלחת 24 באר ודגרו על התאים. כדי להתחיל, העבר את הנפח המלא של תאי CD34+ שהומרו עם מדווח EGFP לצינור FACS נפרד.

צנטריפוגה בחום של 320 גרם למשך שמונה דקות בטמפרטורת החדר. השעו מחדש את התאים הגלולים ב-100 מיקרוליטר של מאגר FACS. הוסיפו חמישה מיקרוליטרים של נוגדן CD34 לכל שפופרת ודגרו את הצינורות בחושך בארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.

לאחר מכן השעו מחדש את התאים במיליליטר אחד של מאגר FACS המכיל DAPI וצנטריפוגה למשך שמונה דקות ב-320 גרם בטמפרטורת החדר. לאחר השעיית התאים ב-200 מיקרוליטר של מאגר FACS המכיל DAPI, סנן את תרחיף התאים דרך מסננת של 40 מיקרומטר לפני המיון. לאחר מכן, הוסף 0.5 מיקרוליטר של נוגדן CD34 לטיפה אחת של חרוזים ב-100 מיקרוליטר PBS.

דוגרים את התערובת בחושך בחום של ארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר מכן הוסף מיליליטר PBS לתערובת. צנטריפוגה למשך שמונה דקות בחום של 320 גרם בטמפרטורת החדר.

השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר PBS. לאחר מכן, הוסיפו תאים לוקמיים שליליים ל-GFP וחיוביים ל-GFP לשפופרת FACS. שטפו את התאים במיליליטר אחד של מאגר FACS.

לאחר צנטריפוגה של התאים, השעו מחדש 100,000 תאים שליליים ל-GFP ו-100,000 תאים חיוביים ל-GFP, כל אחד ב-500 מיקרוליטר של מאגר FACS. סנן את מתלה התא דרך מסננת של 40 מיקרומטר לפני המיון. לאחר מכן אסוף את התאים הממוינים במדיום תאי גזע.

צנטריפוגה את התאים למשך שמונה דקות בחום של 320 גרם בטמפרטורת החדר. לאחר מכן השעו מחדש את התאים בשלושה מיליליטר של אמצעי התמיינות אריתרואידים. כעת חלקו מיליליטר אחד מהתאים המרחפים לשלוש בארות של צלחת של 24 בארות.

מלאו את כל הבארות החיצוניות ב- PBS. כדי לרענן את המדיה, ודא שהתאים התיישבו בתחתית הצלחת. נשען בעדינות על הצלחת והסר 500 מיקרוליטר מדיה.

לאחר מכן הוסף 500 מיקרוליטר של מדיית התמיינות אריתרואידים ציטוקינים 2X כדי לרענן את הצלחת. ביום השישי, העבירו את התאים לצלחת של 12 בארות והוסיפו מיליליטר אחד של מדיה לכל באר כדי להגיע לנפח סופי של שני מיליליטר. אוספים 200 מיקרוליטר תאים מכל באר של צלחת 12 הבארות.

החלף את הנפח שהוסר ב-250 מיקרוליטר של מדיית התמיינות אריתרואידית 2X. הוסף מיליליטר אחד של מאגר FACS לכל צינור איסוף. לאחר צנטריפוגה של הצינורות, השעו מחדש את התאים הגלולים ב-100 מיקרוליטר של מאגר FACS.

הוסף מיקרוליטר אחד לכל אחד מנוגדנים CD71, CD34 ו-CD235a לשינורות. לאחר מכן השעו מחדש את התאים במיליליטר אחד של מאגר FACS המכיל DAPI. צנטריפוגה את הצינורות למשך שמונה דקות בחום של 320 גרם בטמפרטורת החדר.

השעו מחדש את התאים ב-200 מיקרוליטר של מאגר FACS עם DAPI. הגדר DAPI לעומת פיזור צדדי או SSC כדי לא לכלול תאים מתים. הגדר את גובה SSC לעומת שטח SSC כדי לא לכלול צבירות ובחר תאים בודדים.

הגדר את אזור הפיזור קדימה לעומת SSCA כדי להסיר פסולת על סמך גודל. הגדר CD235a לעומת CD71. הגדר CD34 לעומת SSCA.

הפעל חרוזים תאים חיוביים ל- GFP ותאים מוכתמים ב- DAPI. פצה את הקריאות והחל את הפיצוי על הגדרות הציטומטר. תאים חיוביים ל-CD34 מדם טבורי הראו עלייה בתאים אפופטוטיים חיוביים ל-Annexin V מ-14.4% ביום הרביעי ל-34.2% ביום ה-17.

גרף העמודות מראה עלייה משמעותית באחוז התאים החיוביים ל-Annexin V עד היום ה-17, ומגיע לכ-40%