Name: הערכת פעילות DNase על ידי העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית רציומטרית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 55 s
Description: למדו להעריך פעילות DNase בבקרת זמן אמת באמצעות מבחן FRET רציומטרי. השיטה מאפשרת ניתוח רגיש של פעילות נוקלאז חלשה במגוון תנאים חומציים וטמפרטורה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<ol><li>A guide to ratiometric fluorescence. , AZoM. 
 <a target="_blank" href="https://www.azom.com/article.aspx?ArticleID=16081">https://www.azom.com/article.aspx?ArticleID=16081</a> (2018).</li>
<li>Müller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+F%C3%B6rster+resonance+energy+transfer+by+monitoring+sensitized+emission+in+living+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantification of Förster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells.</a> Front Plant Sci. 4, 413(2013).</li>
<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLakowicz%2C+JR+%22Principles+of+fluorescence+spectroscopy%22">Principles of fluorescence spectroscopy</a>. , Springer Science & Business Media. (2006).</li>
<li>Chai, H., Tang, Y., Guo, Z., Miao, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ratiometric+electrochemical+switch+for+circulating+tumor+DNA+through+recycling+activation+of+blocked+DNAzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Ratiometric electrochemical switch for circulating tumor DNA through recycling activation of blocked DNAzymes.</a> Anal Chem. 94 (6), 2779-2784 (2022).</li>
<li>Liu, G., Ma, X., Tang, Y., Miao, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ratiometric+fluorescence+method+for+ctDNA+analysis+based+on+the+construction+of+a+DNA+four-way+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Ratiometric fluorescence method for ctDNA analysis based on the construction of a DNA four-way junction.</a> Analyst. 145 (4), 1174-1178 (2020).</li>
<li>Minchew, C. L., Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoblinker%3A+Brownian+motion+powered+bio-nanomachine+for+FRET+detection+of+phagocytic+phase+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Nanoblinker: Brownian motion powered bio-nanomachine for FRET detection of phagocytic phase of apoptosis.</a> PLoS One. 9 (9), e108734(2014).</li>
<li>Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Express+FRET+labeling+and+analysis+of+phagocytic+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Express FRET labeling and analysis of phagocytic clearance.</a> Methods Mol Biol. 1644, 3-11 (2017).</li>
<li>Domingo, B., Sabariegos, R., Picazo, F., Llopis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+FRET+standards+by+steady-state+fluorescence+and+lifetime+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Imaging FRET standards by steady-state fluorescence and lifetime methods.</a> Microsc Res Tech. 70 (12), 1010-1021 (2007).</li>
<li>Lee, M. H., Kim, J. S., Sessler, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule-based+ratiometric+fluorescence+probes+for+cations%2C+anions%2C+and+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">Small molecule-based ratiometric fluorescence probes for cations, anions, and biomolecules.</a> Chem Soc Rev. 44 (13), 4185-4191 (2015).</li>
<li>Torriglia, A., Leprêtre, C., Padrón-Barthe, L., Chahory, S., Martin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+L-DNase+II+activation+and+function+as+a+molecular+switch+in+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of L-DNase II activation and function as a molecular switch in apoptosis.</a> Biochem Pharmacol. 76 (11), 1490-1502 (2008).</li>
<li>Padron-Barthe, L., Leprêtre, C., Martin, E., Counis, M. F., Torriglia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+modification+of+serpins+transforms+leukocyte+elastase+inhibitor+into+an+endonuclease+involved+in+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Conformational modification of serpins transforms leukocyte elastase inhibitor into an endonuclease involved in apoptosis.</a> Mol Cell Biol. 27 (11), 4028-4036 (2007).</li>
<li>Torriglia, A., Martin, E., Jaadane, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hidden+side+of+SERPINB1%2Fleukocyte+elastase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The hidden side of SERPINB1/leukocyte elastase inhibitor.</a> Semin Cell Dev Biol. 62, 178-186 (2017).</li>
<li>Torriglia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-DNase+II%2C+a+molecule+that+links+proteases+and+endonucleases+in+apoptosis%2C+derives+from+the+ubiquitous+serpin+leukocyte+elastase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">L-DNase II, a molecule that links proteases and endonucleases in apoptosis, derives from the ubiquitous serpin leukocyte elastase inhibitor.</a> Mol Cell Biol. 18 (6), 3612-3619 (1998).</li>
<li>Summer, H., Grämer, R., Dröge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Denaturing+urea+polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28Urea+PAGE%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE).</a> J Vis Exp. (32), e1485(2009).</li>
<li>Lauková, L., Konečná, B., Janovičová, Ľ, Vlková, B., Celec, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deoxyribonucleases+and+their+applications+in+biomedicine%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Deoxyribonucleases and their applications in biomedicine.</a> Biomolecules. 10 (7), 1036(2020).</li>
<li>Minchew, C. L., Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+detection+of+nucleolytic+and+proteolytic+markers+of+lysosomal+cell+death%3A+DNase+II-type+breaks+and+cathepsin+D%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Dual detection of nucleolytic and proteolytic markers of lysosomal cell death: DNase II-type breaks and cathepsin D.</a> Methods Mol Biol. 1554, 229-236 (2017).</li>
<li>Nucleases (DNases and RNases). , Sigma-Aldrich. 
 <a target="_blank" href="https://www.sigmaaldrich.com/US/en/products/protein-biology/proteins-and enzymes/nucleases">https://www.sigmaaldrich.com/US/en/products/protein-biology/proteins-and enzymes/nucleases</a> (2025).</li>
<li>Altairac, S., Zeggai, S., Perani, P., Courtois, Y., Torriglia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+induced+by+Na%2B%2FH%2B+antiport+inhibition+activates+the+LEI%2FL-DNase+II+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Apoptosis induced by Na+/H+ antiport inhibition activates the LEI/L-DNase II pathway.</a> Cell Death Differ. 10 (5), 548-557 (2003).</li>
<li>Li, J. J., Geyer, R., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+molecular+beacons+as+a+sensitive+fluorescence+assay+for+enzymatic+cleavage+of+single-stranded+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Using molecular beacons as a sensitive fluorescence assay for enzymatic cleavage of single-stranded DNA.</a> Nucleic Acids Res. 28 (11), E52(2000).</li>
<li>Ma, C., Tang, Z., Huo, X., Yang, X., Li, W., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+double-stranded+DNA+cleavage+using+molecular+beacons%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of double-stranded DNA cleavage using molecular beacons.</a> Talanta. 76 (2), 458-461 (2008).</li>
</ol>

גישת הקרינה היחסית היא שיטה אנליטית המשתמשת ביחסים של אותות פלואורסצנטיים במקום להסתמך אך ורק על העוצמה של אות בודד 1,2. היתרון בשימוש ביחסים הוא שהם מספקים כיול פנימי ומפצים על גורמים אקראיים רבים, כגון וריאציות בריכוזי הדגימה והבדיקה, פרמטרים של מכשירים וכו'. זה משפר את הדיוק והרגישות של בדיקות פלורסנט.
בהקשר הספציפי של בדיקות העברת אנרגיית תהודה של פורסטר (FRET), המונח "יחס מטרי" מתייחס לעובדה שהמדידה מבוססת על היחס בין שני אותות פליטה מצמד הפלואורופורים התורמים והמקבלים. כדי לכמת את הפעילות של אנליט המטרה, בדיקות FRET רציומטריות משתמשות ביחס בין עוצמות הפליטה של המקבל/תורם (או, במקרים מסוימים, יחס התורם/מקבל ההפוך). היחס קשור ישירות ליעילות ה-FRET. הוא מספק מנגנון נורמליזציה עצמית הממזער רעשי רקע ומביא בחשבון שינויים בתנאי התאורה וריכוז הבדיקה3.
היישומים המעניינים האחרונים של שיטת היחס כוללים את השימוש בה בביו-חיישנים אלקטרוכימיים רציומטריים לזיהוי DNA של גידול במחזור (ctDNA)4,5, בביו-ננו-מכונות המופעלות על ידי תנועה בראונית לזיהוי FRET של השלב הפגוציטי של אפופטוזיס6, ולתיוג וניתוח FRET אקספרס של פינוי פגוציטי7. גישת ה-FRET היחסית המתוארת בעבודה זו שימושית להערכה כמותית של פעילות DNase. מדידות הבדיקה מבוססות על היחסים בין פליטות זוג ה-FRET. בשל יכולתו לזהות אפילו מחשוף DNA קל ואיטי, הבדיקה מתאימה במיוחד לחקירת פעילות נוקלאוליטית חלשה הדורשת תקופות תצפית ארוכות יותר ולניסויים ברמות pH שונות.
כאן, כמה יתרונות ספציפיים של בדיקת FRET היחסית מומחשים על ידי היישום שלה לחקר פעילות ה-DNase של מעכב אלסטאז נוקלאז-לויקוציטים חלש (LEI). הדוח כולל פרוטוקול מפורט עם הוראות שלב אחר שלב ותיאור של ניתוח הנתונים היחסיים.
תיאור בדיקת FRET רציומטרי
בדיקת ה-FRET היחסית היא אוליגו DNA 38-mer משלים את עצמו הנושא את זוג ה-FRET התורם-מקבל של FAM-TAM (Fluorescein-Tetramethylrhodamine). הרצף שלו הוא 5'-AAGGGT(TAM) CCTGCTGCAGGACCCTTAACGCATTATGCGT(FAM)T-3'. ה-38-mer ההכלאה העצמית מניחה קונפורמציה בצורת סיכות, המורכבת משתי סיכות שיער מחוברות של 23 ו-15 נוקלאוטידים, הממקמות את שני הפלואורופורים שלו במרחק של 23.8 Å זה מזה. זה קרוב משמעותית לרדיוס פורסטר עבור זוג זה, R0 = 55 Å8. מיקום כזה מתאים ליעילות גבוהה מאוד של העברת אנרגיה מהתורם למקבל7: EFRET = 0.993477. כתוצאה מכך, כאשר הוא מואר באורך גל עירור FAM (488 ננומטר), בדיקת ה-FRET פולטת פלואורסצנטיות באורך גל הפליטה של ה-TAM המקבל (580 ננומטר), בעוד שפליטת FAM (525 ננומטר) מדוכאת.
איור 1A מציג את המבנה המשני החזוי של UNAFold, עם לולאות קטנות בשני קודקודי סיכות הראש עקב עיכוב סטרי מעקמומיות הדוקה. הסכימה של זיהוי שבירת DNA על ידי בדיקת FRET מוצגת באיור 1B. זה מראה ששבירה של האוליגופרוב על ידי DNase מפרידה את זוג ה-FRET שלו. הפרדה זו מייצרת שינויים דרסטיים בספקטרום הפליטה של שני הפלואורופורים בבדיקה. איור 1C מציג את ספקטרום פליטת הבדיקה לפני ואחרי הפיצול שלו ומדגים כי הפיצול של זוג ה-FRET לאחר מחשוף בדיקת DNase II מגדיל את פליטת התורם ב-525 ננומטר (ID 525 ננומטר) ובמקביל מפחית את פליטת המקבל ב-580 ננומטר (IA 580 ננומטר). איור 1D מציג את יחסי הג'ל וה-FRET של PAGE המתאימים לספקטרום הפליטה. מחשוף בדיקת DNase II יצר שתי רצועות רחבות המתאימות לשברי FAM 12-16-mer (ירוק) ו-20-24-mer TAM (אדום), מה שמעיד על חתכים אקראיים של 38-mer משני צידי T23 בקרבת אזור החיבור בין סיכות השיער.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67134/67134fig1v5.jpg"> 
איור 1: מבנה ותפעול של בדיקת FRET היחסית. (A) מבנה משני חזוי של בדיקת FRET שנוצרה על ידי UNAFold. (B) ייצוג סכמטי של בדיקת ה-FRET העובדת. בדיקת ה-FRET היחסית היא אוליגונוקלאוטיד 38-mer בצורת סיכות המסומן עם תורם FRET (FAM) ומקבל (TAM) במרחק FRET אפקטיבי של 23.8 Å, מה שמבטיח יעילות FRET של &gt;99%. מחשוף של האוליגופרוב על ידי DNase מפריד בין זוג ה-FRET, ומבטל את FRET. (C) ספקטרום הפליטה של בדיקת FRET לפני ואחרי מחשוף בתיווך DNase II. לפני המחשוף, פליטת FAM מדוכאת, ופליטת TAM בולטת. מחשוף בתיווך DNase מפריד בין FAM ל-TAM, משחזר את פליטת ה-FAM (שיא של 525 ננומטר) ומבטל את פליטת ה-TAM (ירידה של 580 ננומטר). λ עירור = 488 ננומטר. (D) הערכה רציומטרית ואלקטרופורטית של בדיקת FRET לפני ואחרי מחשוף DNase II. פאנל עליון: יחסי FRET (RD / A = ID 525 ננומטר / IA 580 ננומטר), המייצגים מדד כמותי של מצב הבדיקה. אדום: ללא שבירה; ירוק: DNase II-שסוע. פאנל תחתון: דנטורציה של ג'ל PAGE המתאים לנתונים פלואורומטריים. מחשוף DNase II מניב שברים המסומנים ב-FAM (12-16 nt, ירוק) ושברים מסומנים ב-TAM (20-24 nt, אדום), המעידים על מחשוף ליד החיבור בין סיכות השיער, משני צדי T23. בקרה לא מחוספסת מראה פלואורסצנטיות צהובה. סולם: אוליגונוקלאוטידים המסומנים ב-FAM ו-TAM המתאימים למקטעים 5' ו-3' של הגשושית 38-mer, עם תוויות פלואורסצנטיות במיקומם המקורי. תנאי תגובה: מאגר נתרן אצטט 10 מ"מ (pH 5.2), בדיקה 1 pmol/μL FRET, 0.0033 U/μL DNase II, 24 שעות ב-37 מעלות צלזיוס. RD/A = ID 525 ננומטר/IA 580 ננומטר; λ עירור = 488 ננומטר. תנאים לא קיימים: בדיקה 1 מיקרומטר FRET, 10 מ"מ Na+, 0 מ"מ מ"ג2+, 37 מעלות צלזיוס. אנא <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67134/67134fig1v5large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
בעוד שהשינויים בספקטרום פליטת הבדיקה הבודדת ברורים, השוואות כמותיות בין מספר רב של ספקטרום פליטה דורשות פרמטר כמותי ידידותי וקומפקטי יותר למשתמש. תפקיד זה ממלא יחס FRET. שיטת הקרינה המוצגת שייכת לקבוצה של גישות רציומטריות המסתמכות על היחסים הישירים (דו-ערוציים) של פליטות הקרינה של חברי זוג FRET לצורך ההערכות הכמותיות שלהם 2,9.
הגישה משתמשת ביחס בין פליטות תורם/מקבל (RD/A = ID 525 ננומטר / IA 580 ננומטר), הקשור ליעילות ה-FRET ומאפיין כמותית את מצבו של ה-38-mer (שבור או שלם). יחס ID / IA מספק מנגנון נורמליזציה עצמית המסביר מטבעו שינויים בגורמים כגון ריכוז בדיקה, עוצמת עירור והלבנת פוטו3. הגישה מתאימה רק לבדיקות FRET שיש לתורם ומקבל מקושרים בתוך אותה בדיקה, כאשר היחס ביניהם ידוע וקבוע. מסיבה זו, הגישה אינה צריכה לקחת בחשבון את העירור הישיר של המקבל או התורם2. הסטוכיומטריה הקבועה של תורם-מקבל של הגשושית מבטיחה שיחסי הפליטה של התורם/מקבל אינם מושפעים משינויים אלה ומשקפים ישירות את מצב הבדיקה. כתוצאה מכך, היחס בין פליטות תורם-מקבל מספק פרמטר מחשוף DNA כמותי עם נורמליזציה מובנית של אותות 2,3.
הבדיקה משתמשת ביחס ID / IA ( ולא ביחס IA / ID הפוך) מכיוון שיחס זה מתאר הפסקת FRET לאחר מחשוף בדיקה ובכך משתנה באותו כיוון כמו פעילות DNase - הגדלת עם מחשוף מוגבר. זה מומחש על ידי איור 1D, המציג את יחס ה-FRET של הגשושית היחסית והאלקטרופורזה של PAGE שלה לפני ואחרי הפיצול שלה על ידי DNase II, שניהם תואמים לספקטרום באיור 1C. כדי להדגים את הנוחות, החיסכון בזמן וקלות השימוש של בדיקת ה-FRET היחסית, היא יושמה כדי לחשוף ולחקור את פעילות ה-DNase של מעכב אלסטאז נוקלאז-לויקוציטים חלש (LEI).
נוקלאז LEI חלש
מעכב פרוטאז LEI הוא מטה-יציב באופן טבעי, כלומר לא מאוזן טופולוגית. תכונה זו חיונית למנגנון המעכב שלה. כאשר פרוטאז המטרה שלו מבקע את לולאת האתר התגובתי של LEI (RSL), מולקולת מעכב הפרוטאז עוברת שינוי קונפורמציה דרסטי, ומותחת מכנית את הפרוטאז לצורה לא פעילה10,11. למרבה הפלא, זה גם שובר ומרחיב את מולקולת ה-LEI עצמה וחושף אתר DNase קריפטי המכוסה בקפל המקורי שלו, ובכך ממיר LEI לאנדונוקלאז פעיל L-DNase II (DNase II שמקורו ב-LEI)11,12. אתר ה-DNase הקריפטי יכול להיחשף גם על ידי דנטורציה ושבירה של LEI הנגרמים על ידי הדגירה הלילית שלו ב-pH 2 בחומצה גופרתית10,13. השימוש במבחן FRET זה לחקר LEI הראה כי טיפולי דנטורציה כימיים קשים ומחשוף אנזימטי ממוקד אינם נדרשים בקפדנות כדי לחשוף את הפעילות הנוקליאוליטית הסמויה של LEI.
היישום והפרוטוקול המוצגים של גישת ה-FRET היחסי מתארים את חשיפת פעילות ה-DNase החלשה הקיימת מטבעה ב-LEI רגיל ולא מפורק. גילוי היכולת הנוקלאוליטית הפנימית של LEI ללא פיצול וניתוחו התאפשרו בשל התאמת הבדיקה לתקופות ממושכות של תצפית ברמות pH חומציות שונות.

<table><tbody><tr><td>צלחת 96 באר</td><td>בז</td><td>353219</td><td></td></tr><tr><td>בדיקת DNA FRET</td><td>דנ"א IDT</td><td></td><td>5'-AAG GGT(TAM)CCT GCT GCA GGA CCC TTA ACG CAT TAT GCG T(FAM)T- 3'; FAM &ndash; פלואורסצאין-dT; &nbsp; TAM &ndash; טטרמתילרודמין-dT.&nbsp;</td></tr><tr><td>דנאס II</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>D8764</td><td></td></tr><tr><td>מצלמת SLR דיגיטלית EVOLT</td><td>אולימפוס</td><td>E500</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר אלקטרופורזה ג'ל עם ספק כוח</td><td>ביו-ראד</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ליי</td><td>נובופרוטאין</td><td>CJ01</td><td></td></tr><tr><td>מערכת הדמיית ג'ל LiCOR</td><td>LiCOR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מים ללא נוקלאז</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>ג'ל PAGE יצוק מראש</td><td>Invitrogen</td><td>EC68852</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת חיץ נתרן אצטט pH 5.2</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S2899-100 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופלואורומטר</td><td>טקאן</td><td></td><td>ספייר 2</td></tr></tbody></table>

הערכת פעילות dnase על ידי העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית רציומטרית

Assessment of DNase Activity by Ratiometric Fluorescence Resonance Energy Transfer

מחקר מייצג זה מדגיש יתרונות ספציפיים של גישת FRET רציומטרית לחקירת תגובות אנזימטיות איטיות הדורשות תקופות תצפית ממושכות. בפרט, האפליקציה מדגימה את הזיהוי והניתוח של פעילות ה-DNase הטבועה ב-LEI באמצעות מערכת FRET רציומטרית. תוצאות המחקר הזה מוצגות באיור 2.
באמצעות גישה זו, הראינו כי LEI מפגין פעילות DNase בתנאים חומציים קלים מבלי לדרוש הפעלה אנזימטית באמצעות מחשוף או חשיפה לטיפולים כימיים קש...

הערכת פעילות DNase על ידי העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית רציומטרית

The present protocol describes a simple and sensitive ratiometric F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) assay for the detection and quantitative ...

assessment-dnase-activity-ratiometric-fluorescence-resonance-energy

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

ערכת פלורסנט פרוטאז איתור מיועד למדידת פעילות הפרוטאז באמצעות fluorometry. זה מתאים גם זיהוי של כמויות זעירות של זיהום פרוטאז. השיטה מבוססת על hydroysis פרוטאוליטי של ניסוח קניינית של מצע קזאין FITC שכותרתו.

שימוש בערכת איתור פלורסנט פרוטאז לקבוע פעילות פרוטאז

שיטה חדשה כרוכה בניתוח כמותי של סריג (העברת אנרגית פורסטר תהודה) אותות מתוארת ללימוד קינטיקה אנזים.

כמותית סריג ניתוח (תהודת העברת אנרגית פורסטר) לקביעת SENP1 פרוטאז קינטיקס

סרטון זה מדגים בדיקת מבחנה לכימות פעילות פרוטאז סרין נויטרופילים בדגימות כיח. הדגימה המכילה פרוטאז מופרש מודגרת בכתב פלורסנט הנושא מוטיב זיהוי. פיצול המוטיב על ידי הפרוטאז מאפשר פליטת פלואורסצנטיות אינדיבידואלית על ידי התורם והמקבל פלואורופור של המדווח, דבר המעיד על פעילות פרוטאז בדגימה.

בדיקת מבחנה למדידת פעילות פרוטאז סרין נויטרופיל באמצעות כתב פלואורסצנטי

חבילה של מבחני colorimetric מתוארת לחלבון במהירות הבחנה, רנ"א, דנ"א, וסוכרים מחדש ducing בדגימות biomolecular פוטנציאלי הטרוגניות.

מבחני colorimetric מהירים לאופן איכותי להבחין RNA ו-DNA בדגימות biomolecular

Exonucleases ממלאים תפקידים קריטיים בהבטחת יציבות הגנום. אובדן תפקוד האקסונוקלאז של WRN גורם להזדקנות מוקדמת. חקר מצעים ודרישות אחרות של הנוקלאז במבחנה יכול לעזור להבהיר את תפקידו in vivo. כאן אנו מדגימים בדיקה מבוססת פלואורסצנטית מהירה וניתנת לשחזור כדי למדוד את פעילות הנוקלאז שלו.

Assay exonuclease הקרינה מבוסס לאפיין DmWRNexo, Orthologue של האדם Progeroid WRN exonuclease, ויישומו nucleases אחר

אנו מתארים בדיקה דיגיטלית של נקודת קצה לכימות חומצות גרעין עם קריאה פשוטה (אנלוגית). אנו מודדים פלואורסצנטיות בתפזורת של בדיקות דיגיטליות מבוססות טיפות באמצעות מכונת qPCR סטנדרטית במקום מכשור מיוחד ומאשרים את התוצאות שלנו במיקרוסקופיה.

Readout גורף פשוט של דיגיטלי מבחני כימות חומצות גרעין

אנחנו מדווחים הפרוטוקולים לסינתזה ולשנות טיהור של פפטיד חומצת גרעין (הרשות) oligomers שילוב משקעים. שיטות אפיון ההכרה של RNA דופלקסים מאת Pna ששונה הביוכימי, biophysical מתוארים.

זיהוי רצף ספציפי, סלקטיבי של גדילי כפול RNAs מעל חד גדילי RNAs על ידי שינוי כימי חומצות גרעין פפטיד

פרוטוקול זה מתאר את האפיון של ה-DNA פולימראז סינתזה של דנ א שונה דרך התבוננות שינויים-סגול fluorescently שכותרתו הדנ א באמצעות אלקטרופורזה בג'ל ג'ל הדמיה. ג'לים אקרילאמיד משמשים עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה של ההפרדה של חומצות גרעין קצר, אשר נודדים בקצב שונה בהתאם לגודל.

DNA פולימראז פעילות Assay באמצעות DNA שכותרתו פלורסנט-סגול, דמיינו ידי אקרילאמיד אלקטרופורזה בג'ל

מתיל-טרנספראזות דנ"א הן מטרות פוטנציאליות לתרופות לסרטן. כאן מוצג פרוטוקול להערכת מולקולות קטנות לעיכוב מתיל-טרנספראז של DNA. בדיקה זו משתמשת באנדונוקלאז למתילציה זוגית של דנ"א ליצירת פלואורסצנציה ומאפשרת לנטר את פעילות האנזים בזמן אמת.

בדיקת מתילציה רציפה של דנ"א מצומד אנדונוקלאז מבוססת פלואורסצנציה לסינון מעכבי מתיל-טרנספראז של DNA

ננו-מכונות מבוססות DNAzyme יכולות לשמש לזיהוי סלקטיבי ורגיש ביותר של חומצות גרעין. מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט לתכנון ננו-מכונות מבוססות DNAzyme עם ליבה של 10-23 המשתמשות בתוכנה חופשית ויישומן בזיהוי מקטע וירוס אפשטיין-בר כדוגמה.

DNAzyme 10-23 - ננו-מכונות מבוססות לזיהוי חומצות גרעין

כאן מוצג פרוטוקול לבדיקת אנזימים לחילוף חומרים של חומצות גרעין, תוך שימוש בדוגמאות של אנזימי ליגאז, נוקלאז ופולימראז. הבדיקה משתמשת באוליגונוקלאוטידים מסומנים פלואורסצנטית ולא מסומנים שניתן לשלב ליצירת דופלקסים המחקים נזקי RNA ו/או DNA או מתווכי מסלול, ומאפשרים אפיון התנהגות אנזימים.

שימוש באוליגונוקלאוטידים סינתטיים שעברו שינוי כדי להעריך אנזימים לחילוף חומרים של חומצות גרעין

למדו להעריך פעילות DNase בבקרת זמן אמת באמצעות מבחן FRET רציומטרי. השיטה מאפשרת ניתוח רגיש של פעילות נוקלאז חלשה במגוון תנאים חומציים וטמפרטורה.

הערכת פעילות DNase על ידי העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית רציומטרית

גלה סרטונים נוספים