Name: פיתוח ויישום של טירוזין פוספטאזים מווסתים רפמיצין (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: למדו פיתוח מערכת רפמיצין מווסתת לשליטה בפעילות טירוזין פוספטאזים בתאים חיים. השיטה מאפשרת ויסות זמני וספציפי של SHIP-2 לחקר מסלולי סיגנל בתאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>ויסות זמני של פעילות פוספטאז עם מערכת מווסתת רפמיצין

<ol><li>Amin, A. R. M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHP-2+tyrosine+phosphatase+inhibits+p73-dependent+apoptosis+and+expression+of+a+subset+of+p53+target+genes+induced+by+EGCG%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">SHP-2 tyrosine phosphatase inhibits p73-dependent apoptosis and expression of a subset of p53 target genes induced by EGCG.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (13), 5419-5424 (2007).</li>
<li>Niogret, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shp-2+is+critical+for+ERK+and+metabolic+engagement+downstream+of+IL-15+receptor+in+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Shp-2 is critical for ERK and metabolic engagement downstream of IL-15 receptor in NK cells.</a> Nat Commun. 10, 1-14 (2019).</li>
<li>Wang, Y. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+infection+activates+Src+homology-2+domain-containing+phosphatase+2+to+suppress+IFN-%CE%B3+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori infection activates Src homology-2 domain-containing phosphatase 2 to suppress IFN-γ signaling.</a> J Immunol. 193 (8), 4149-4158 (2014).</li>
<li>Yu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tyrosine+phosphatase+SHP2+promotes+proliferation+and+oxaliplatin+resistance+of+colon+cancer+cells+through+AKT+and+ERK%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">The tyrosine phosphatase SHP2 promotes proliferation and oxaliplatin resistance of colon cancer cells through AKT and ERK.</a> Biochem Biophys Res Commun. 563, 1-7 (2021).</li>
<li>Lauriol, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+SHP2+dysfunction+underlies+cardiac+hypertrophy+in+Noonan+syndrome+with+multiple+lentigines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Developmental SHP2 dysfunction underlies cardiac hypertrophy in Noonan syndrome with multiple lentigines.</a> J Clin Invest. 126 (8), 2989-3005 (2016).</li>
<li>Tartaglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+PTPN11%2C+encoding+the+protein+tyrosine+phosphatase+SHP-2%2C+cause+Noonan+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in PTPN11, encoding the protein tyrosine phosphatase SHP-2, cause Noonan syndrome.</a> Nat Genet. 29, 465-468 (2001).</li>
<li>Xu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Shp2+tyrosine+phosphatase+is+implicated+in+leukemogenesis+in+adult+human+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Shp2 tyrosine phosphatase is implicated in leukemogenesis in adult human leukemia.</a> Blood. 106 (9), 3142-3149 (2005).</li>
<li>Mustelin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+tyrosine+phosphatases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Protein tyrosine phosphatases.</a> Front Biosci. 7 (4), d85-d142 (2002).</li>
<li>Stanford, S. M., Bottini, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+tyrosine+phosphatases%3A+time+to+end+the+stigma%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Targeting tyrosine phosphatases: time to end the stigma.</a> Trends Pharmacol Sci. 38 (6), 524-540 (2017).</li>
<li>Guo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+phosphatases%3A+From+molecule+design+to+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Targeting phosphatases: From molecule design to clinical trials.</a> Eur J Med Chem. 264, 116031(2024).</li>
<li>Weiser, D. C., Shenolikar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+protein+phosphatase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of protein phosphatase inhibitors.</a> Curr Protoc Mol Biol. 62, 1-18 (2003).</li>
<li>Fauser, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+protein+tyrosine+phosphatase+signaling+by+engineered+chemogenetic+control+of+its+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dissecting protein tyrosine phosphatase signaling by engineered chemogenetic control of its activity.</a> J Cell Biol. 221 (8), e202111066(2022).</li>
<li>Karginov, A. V., Hahn, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+activation+of+kinases%3A+design+and+application+of+RapR+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Allosteric activation of kinases: design and application of RapR kinases.</a> Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 14, Unit 14.13 (2011).</li>
<li>Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+allosteric+activation+of+kinases+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineered allosteric activation of kinases in living cells.</a> Nat Biotechnol. 28, 743-747 (2010).</li>
<li>Dagliyan, O., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+proteins+for+allosteric+control+by+light+or+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Engineering proteins for allosteric control by light or ligands.</a> Nat Protoc. 14, 1863-1883 (2019).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+SHP2+phosphatase+promotes+vascular+damage+and+inhibition+of+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Targeting the SHP2 phosphatase promotes vascular damage and inhibition of tumor growth.</a> EMBO Mol Med. 13, e14089(2021).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHP2+regulates+the+development+of+intestinal+epithelium+by+modifying+OSTERIX%2B+crypt+stem+cell+self-renewal+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">SHP2 regulates the development of intestinal epithelium by modifying OSTERIX+ crypt stem cell self-renewal and proliferation.</a> FASEB J. 35, e21106(2021).</li>
<li>Zhang, E. E., Chapeau, E., Hagihara, K., Feng, G. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+Shp2+tyrosine+phosphatase+controls+energy+balance+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Neuronal Shp2 tyrosine phosphatase controls energy balance and metabolism.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 16064-16069 (2004).</li>
<li>Song, Y., Zhao, M., Zhang, H., Yu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-edged+roles+of+protein+tyrosine+phosphatase+SHP2+in+cancer+and+its+inhibitors+in+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Double-edged roles of protein tyrosine phosphatase SHP2 in cancer and its inhibitors in clinical trials.</a> Pharmacol Ther. 230, 107966(2022).</li>
<li>Hartman, Z. R., Schaller, M. D., Agazie, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tyrosine+phosphatase+SHP2+regulates+focal+adhesion+kinase+to+promote+EGF-induced+lamellipodia+persistence+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The tyrosine phosphatase SHP2 regulates focal adhesion kinase to promote EGF-induced lamellipodia persistence and cell migration.</a> Mol Cancer Res. 11 (6), 651-664 (2013).</li>
<li>Yu, D. H., Qu, C. K., Henegariu, O., Lu, X., Feng, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-tyrosine+phosphatase+Shp-2+regulates+cell+spreading%2C+migration%2C+and+focal+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein-tyrosine phosphatase Shp-2 regulates cell spreading, migration, and focal adhesion.</a> J Biol Chem. 273 (33), 21125-21131 (1998).</li>
<li>Kramer, M. F., Coen, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+amplification+of+DNA+by+PCR%3A+standard+procedures+and+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Enzymatic amplification of DNA by PCR: standard procedures and optimization.</a> Curr Protoc Cell Biol. 10, 1-14 (2001).</li>
<li>Sandhu, G. S., Precup, J. W., Kline, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+one-step+characterization+of+recombinant+vectors+by+direct+analysis+of+transformed+Escherichia+coli+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Rapid one-step characterization of recombinant vectors by direct analysis of transformed Escherichia coli colonies.</a> Biotechniques. 7, 689-690 (1989).</li>
<li>Tsygankov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellGeo%3A+A+computational+platform+for+the+analysis+of+shape+changes+in+cells+with+complex+geometries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">CellGeo: A computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries.</a> J Cell Biol. 204 (3), 443-460 (2014).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Ray, A. -M., Klomp, J. E., Collins, K. B., Karginov, A. V. Dissecting kinase effector signaling using the RapRTAP methodology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRay%2C+A-M+%22Kinase+Signaling+Networks%22">Kinase Signaling Networks</a>. Tan, A. -C., Huang, P. H. , Springer. New York, NY. 21-33 (2017).</li>
<li>Mercan, F., Bennett, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+tyrosine+phosphatases+and+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein tyrosine phosphatases and substrates.</a> Curr Protoc Mol Biol. 18, Unit 18.16 (2010).</li>
<li>Karginov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+regulation+of+protein+dimerization+and+kinase+activity+in+living+cells+using+photocaged+rapamycin+and+engineered+FKBP%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Light regulation of protein dimerization and kinase activity in living cells using photocaged rapamycin and engineered FKBP.</a> J Am Chem Soc. 133 (3), 420-423 (2011).</li>
<li>Karginov, A. V., Hahn, K. M., Deiters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optochemical+activation+of+kinase+function+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Optochemical activation of kinase function in live cells.</a> Methods Mol Biol. 1148, 31-43 (2014).</li>
</ol>

חלבון טירוזין פוספטאזות הם משפחה קריטית של חלבונים המעורבים בשפע של אירועי איתות תאי. הוכח כי הם ממלאים תפקיד מפתח בוויסות התפשטות תאים, נדידה ואפופטוזיס 1,2,3. כתוצאה מכך, חוסר ויסות של חלבון טירוזין פוספטאז מוביל למגוון של מחלות מתישותוהפרעות 4,5,6,7. חקר התפקוד הפיזיולוגי של פוספטזות טירוזין ותפקידן בהתפתחות פתולוגיות אלה עוכב היסטורית על ידי מחסור בכלים הדרושים לחקירת המורכבות של איתות פוספטאז8.
באופן מסורתי, פוספטזות נלמדות באמצעות שיטות שאין להן את הספציפיות הרצויה ו / או אינן מספקות שליטה זמנית על פעילותן. מגבלות קריטיות אלה של הכלים הזמינים מקשות על ניתוח תפקידים ספציפיים של פוספטזות במסלולי איתות. ביטוי יתר של מוטציות שליליות פעילות ודומיננטיות או הפחתת ויסות הביטוי של הפוספטאז מספקים ספציפיות אך חסרים שליטה זמנית ולעתים קרובות יכולים להפעיל מנגנוני פיצוי שיסתירו את הפונקציה האמיתית של האנזים.
מעכבים פרמקולוגיים מאפשרים ויסות זמני של פוספטאזות. עם זאת, מעכבי פוספטאז רבים ידועים לשמצה שאינם ספציפיים בשל ההרכב השמור היטב של האתר הפעיל בטירוזין פוספטאז9. בנוסף, בשל אילוצי תכנון, מעכבים המכוונים לאתר הקטליטי מפגינים חדירות נמוכה של קרום התא10. מגבלה נוספת של מעכבים היא שהם מאפשרים רק בדיקה של ההשפעות של הפעלת phosphatase11. לפיכך, יש צורך בכלים המאפשרים הפעלה ספציפית, מווסתת זמנית של פוספטאזות. כלים אלה יאפשרו לחוקרים לזהות את ההשפעות הישירות של הפעלת פוספטאז, ולהפריד אותם ממפל איתות מקבילי מרובים המופעלים לעתים קרובות על ידי גירויים ביולוגיים. חשוב לציין, שליטה זמנית הדוקה בפעילות מאפשרת זיהוי אירועים חולפים הנגרמים על ידי פוספטאז ומפרידה בין ההשפעות של פעילות פוספטאז חריפה וממושכת. שילוב של ויסות זמני עם ניתוח מוטציות יאפשר ניתוח מפורט של תפקידים ספציפיים של תחומים בודדים של הפוספטאז וחקירה של איתות במורד הזרםשלו 12.
כדי להתמודד עם היעדר היכולות הרצויות בכלים הקיימים, קבוצת קרגינוב פיתחה את מערכת Rapamycin Regulated (RapR) 13,14,15. מערכת RapR משתמשת בתחום מתגים מהונדס, iFKBP, המאפשר ויסות אלוסטרי של חלבון הריבית (POI). החדרת תחום iFKBP במיקום אלוסטרי צמוד לאתר הקטליטי של נקודת העניין הופכת אותו לרגיש לוויסות על ידי רפמיצין. בהיעדר רפמיצין, iFKBP משבש את האתר הקטליטי עקב הדינמיקה המבנית הגבוהה במהותה של iFKBP ובכך משבית את נקודת העניין. התוספת של רפמיצין גורמת לאינטראקציה של iFKBP עם החלבון FRB (איור 1). זה גורם לייצוב של תחום המתג, אשר כתוצאה מכך משחזר את המבנה והתפקוד של התחום הקטליטי של נקודת העניין. ככזה, הכלי מאפשר הפעלה ספציפית וניתנת לוויסות זמני של נקודת העניין.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67142/67142fig01.jpg"> איור 1: סכמטי של מערכת רפמיצין מווסתת RapR-Shp2. RapR מאפשר הפעלה אלוסטרית של החלבון המעניין בתוספת רפמיצין. נתון זה שונה מ- Fauser et al.12. קיצורים: iFKBP = FKBP12 הניתן להכנסת; FRB = תחום מחייב FKBP-רפמיצין; R = רפמיצין; Shp2 = Src homology-2 תחום המכיל חלבון טירוזין phosphatase. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67142/67142fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
הכלי RapR יכול להיות מיושם על משפחות חלבונים שונות. ניתן להשתמש בו כדי לווסת קינאזות חלבון, כמו גם פוספטאזות12,14. פרוטוקול זה יתמקד ביישום של כלי RapR כדי לשלוט Shp2 phosphatase. Shp2 הוא חלבון טירוזין פוספטאז המתבטא בכל מקום ומעורב בתהליכי איתות כגון התפשטות, הגירה, אימונומודולציה והתמיינות 1,16,17,18. דיסרגולציה של Shp2 נקשרה למספר סוגי סרטן מוצקים, לוקמיה מיאלואידית והפרעות התפתחותיות 5,7. עם זאת, Shp2 נפל קורבן לאותם חסרונות כלים כפי שתואר לעיל. כדי להילחם במגבלות אלה, RapR-Shp2, מבנה Shp2 ספציפי וזמני הניתן לווסת, פותח ואופיין12.
לפני הפיתוח של RapR-Shp2, היה ידוע כי Shp2 היה מעורב בנדידת תאים 19,20,21. עם זאת, תפקידו הספציפי באיתות המעורב בתהליך זה לא היה ידוע. כמו כן, לא היה ידוע באיזה סקאלת זמן Shp2 מווסת את נדידת התאים ואילו שינויים מורפודינמיים ספציפיים הוא גורם בנקודות זמן שונות של הפעלתו. יתר על כן, לא היה ברור אם הפעלה חריפה וממושכת של Shp2 תגרום להשפעות שונות. באמצעות RapR-Shp2 נמצא כי הפעלה חריפה של Shp2 גורמת להתפשטות תאים חולפים, עלייה בבליטות, קיטוב תאים ונדידה. מסלולים ספציפיים במורד הזרם של Shp2 המווסתים שינויים מורפודינמיים מובהקים זוהו גם הם12. פרוטוקול זה מספק פרטים לתכנון ואפיון RapR-Shp2, אשר ניתן להשתמש בהם כדי להנחות את הפיתוח והיישום של פוספטזות RapR אחרות.

<table><tbody><tr><td>#1.5 כיסויי זכוכית 25 מ"מ עגולים</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0715</td><td></td></tr><tr><td>צינורות 1.5 מ"ל</td><td>ארה"ב Scientific</td><td>cc7682-3394</td><td></td></tr><tr><td>2x Laemmli Buffer</td><td></td><td></td><td>עבור 500 מ"ל: 5.18 גרם Tris-HCL, 131.5 מ"ל גליצרול, 52.5 מ"ל 20% SDS, 0.5 גרם כחול ברומופנול, pH סופי 6.8</td></tr><tr><td>4-20% Mini-PROTEAN TGX ג'ל טרומי</td><td>Biorad</td><td>4561096</td><td></td></tr><tr><td>5x Phusion Plus Buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>F538L</td><td></td></tr><tr><td>A431 תאים</td><td>ATCC</td><td>CRL-1555</td><td></td></tr><tr><td>Agarsose</td><td>GoldBiotech</td><td>A-201</td><td></td></tr><tr><td>Attofluor תא</td><td>תאים invitrogen</td><td>A7816</td><td></td></tr><tr><td>Benchmark סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Gemini Bio-products</td><td>100-106</td><td>משולש 0.1 ומיקרו; m בריג מסונן סטרילי</td></tr><tr><td>35,30 w/v %</td> <td>Acros</td><td>329581000</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>GoldBiotech</td><td>A-420</td><td></td></tr><tr><td>CellGeo</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>פורסם ב 10.1083/jcb.201306067</td></tr><tr><td>CellMask צבע ממברנת פלזמה אדום עמוק</td><td>invitrogen</td><td>c10046</td><td></td></tr><tr><td>Colony Screen MasterMix</td><td>Genesee</td><td>42-138</td><td></td></tr><tr><td>DH5a מוכשר תאים</td><td>NEB</td><td>C2987H</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>קורנינג</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Thermo Scientific</td><td>F-515</td><td></td></tr><tr><td>סולם DNA</td><td>GoldBio</td><td>D010-500</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>NEB</td><td>N04475</td><td></td></tr><tr><td>DpnI אנזים</td><td>NEB</td><td>R01765</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>GoldBio</td><td>DTT10</td><td>DL-Dithiothreitol, ריאגנטים של קלילנד</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Acros</td><td>409910250</td><td></td></tr><tr><td>פיברונקטין מפלזמת בקר</td><td>סיגמא</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE(R) 6 מגיב טרנספקציה</td><td>Promega</td><td>E2692</td> ערכת <td>מיצוי ג'ל מגיב טרנספקציה</td></tr><tr><td>Thermo</td><td>Scientific</td><td>K0692</td><td>ערכת מיצוי ג'ל GeneJET</td></tr><tr><td>ג'ל כתם חומצת גרעין ירוקה</td><td>GoldBio</td><td>G-740-500</td><td></td></tr><tr><td>ג'ל טעינת צבע סגול 6x</td><td>NEB</td><td>B7024A</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>GlutaMAX-l (100x) 100 מ"ל</td></tr><tr><td>תאי HEK 293T ATCC</td><td></td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>תאי HeLa</td><td>ATCC</td><td>CRM-CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fischer</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ תוכנה לעיבוד</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Igepal CA-630 (NP40)</td><td>Sigma</td><td>I3021</td><td></td></tr><tr><td>מאגר</td><td></td><td></td> מידזול <td>25 מ"מ אימידזול pH 7.2, 2.5 מ"מ EDTA, 50 מ"מ NaCl, 5 מ"מ DTT</td></tr><tr><td>KCl</td><td>סיגמא</td><td>P-4504</td><td></td></tr><tr><td>L-15 1x</td><td>קורנינג</td><td>10-045-CV</td><td></td></tr><tr><td>LB אגר</td><td>פישר</td><td>BP1425-2</td><td></td></tr><tr><td>מאגר</td><td></td><td></td> <td>ליזה20 מ"מ Hepes-KOH, pH 7.8, 50 מ"מ KCl, 1 מ"מ EGTA, 1% NP40</td></tr><tr><td></td><td>עדכון MATLAB MathWorks</td><td>N/A</td><td>R 2022b שימש להפעלת פונקציות CellGeo</td></tr> תוכנת <tr><td>אוטומציה וניתוח תמונות Metamorph Microscopy</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Chemical</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>שמן מינרלי</td><td>Sigma</td><td>M5310</td><td></td></tr><tr><td>MiniPrep Kit</td><td>Gene בחירה</td><td>96-308</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX ג'לים טרומיים 12 באר</td><td>Bio-Rad</td><td>4561085</td><td></td></tr><tr><td>ביולוגיה מולקולרית כיתה</td><td>קורנינג</td> מים <td>46-000-CV</td><td></td></tr><tr><td>Multiband Polychroic Mirror</td><td>Chroma Technology</td><td>89903BS</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Olympus UPlanSAPO 40x אובייקטיבי</td><td>אולימפוס</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>PBS w/o Ca ו- Mg</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>צינורות PCR labForce</td><td></td><td>1149Z65</td><td>0.2 מ"ל 8 רצועות צינורות וכובעים, רצועה קשיחה מחוברת בנפרד מכסי כיפה</td></tr><tr><td>Phusion בתוספת DNA פולימראז</td><td>תרמו מדעי</td><td>F630S</td><td></td></tr><tr><td>פריימרים</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חלבון-G Sepharose</td><td>Millipore</td><td>16-266</td><td></td></tr><tr><td>PVDF ממברנות</td><td>BioRad</td><td>1620219</td><td>Immun-Blot כריכי נייר PVDF/פילטר</td></tr><tr><td>רפמיצין</td><td>פישר</td><td>AAJ62473MF</td><td></td></tr><tr><td>0.25% טריפסין, 2.21 מ"מ EDTA, 1x [-] נתרן</td><td>קורנינג</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Tris-אצטט-EDTA (TAE) 50x</td><td>פישר</td><td>BP1332-1</td><td>לאלקטרופורזה</td></tr><tr><td>מאגר</td><td></td><td></td> כביסה <td>20 מ"מ Hepes-KOH, pH 7.8, 50 מ"מ KCl, 100 מ"מ NaCl, 1 מ"מ EGTA, 1% NP40</td></tr><tr><td>&beta;-מרקפטואתנול</td><td>פישר כימיקל</td><td>O3446I-100</td><td></td></tr><tr><td><נוגדנים חזקים></חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אנטי EGFR</td><td>איתות תאי</td> נוגדנים <td>2232</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-ERK 1/2 איתות</td><td>תאי</td> נוגדן <td>9102</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד דגל</td><td>Millipore-Sigma</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד GAPDH</td><td>invitrogen</td><td>AM4300</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד GFP</td><td>Clontech</td><td>632380</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד mCherry</td><td>invitrogen</td><td>M11217</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד פקסילין</td><td>תרמו פישר</td><td>BDB612405</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-פוספו-EGFR Y992 איתות תא נוגדן</td><td></td><td>2235</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-פוספו-ERK 1/2 T202/Y204 איתות</td><td>תאי</td> נוגדנים <td>9101</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-פוספו-פקסילין Y31 נוגדן</td><td>Millipore-Sigma</td><td>05-1143</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-פוספו-PLC וגמא; Y783 איתות</td><td>תאי</td> נוגדנים <td>14008</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-PLC וגמא; </td><td>איתות תאי נוגדנים</td><td>5690</td><td></td></tr></tbody></table>

פיתוח ויישום של טירוזין פוספטאזים מווסתים רפמיצין

Development and Application of Rapamycin-regulated Tyrosine Phosphatases

איור 4 מדגים תוצאות שניתן לצפות להן מבדיקת פעילות פוספטאז המבוססת על פקסילין. בניסוי זה, פעילות פוספטאז שלילית פעילה ודומיננטית של Shp2 הושוותה לזו של RapR-Shp2 פעיל ולא פעיל באמצעות פוספו-פקסילין כקריאה. מבני Shp2 עברו זירוז חיסוני ונתונים לבדיקת הפעילות כמתואר בפרוטוקול. קריאות הפוספו-פקסילין עבור Shp2 פעיל ו-RapR-Shp2 פעיל היו דומות, מה שמצביע על כך שה-RapR-Shp2 הפעיל לא הושפע לרעה מהכנסת תחום RapR והוא שמר על פעילות מלאה לאחר הפעלתו. Shp2 שלילי דומיננטי ו-RapR-Shp2 לא פעיל היו דומים גם הם, מה שמצביע על כך שלמבנה RapR-Shp2 אין פעילות כאשר אינו פעיל. זה מצביע על העיצוב המוצלח של RapR-phosphatase. מצע הפוספו המשמש לבדיקה זו עשוי להשתנות בהתאם לפוספטאז המעניין.
איור 5, בדומה לאיור 4, משווה בין שלילי פעיל ודומיננטי לבין RapR-Shp2 פעיל ולא פעיל. ניסוי זה נערך ללא משקעים חיסוניים של המבנים. במקום זאת, הוא תוכנן לאפיין את השפעות האיתות במורד הזרם של מבנה RapR-Shp2 בתוך תאים. כאן, מבני Shp2 באו לידי ביטוי בתאי HEK293T. אפקט במורד הזרם ERK1/2 הוכח כמגביר את הזרחן בתגובה להפעלת RapR-Shp2, בדיוק כמו במדגם הפעיל באופן מכונן. RapR-Shp2 הלא פעיל לא גרם לשינוי זה. זה מצביע על כך שהאיתות במורד הזרם של Shp2 נשמר עם שילוב תחום RapR. באופן דומה, מצעי פוספו ידועים EGFR ו-PLCγ עברו דה-פוספורילציה בתגובה להפעלת RapR-Shp2 בתאי A431.
לבסוף, איור 6 מציג את התוצאות של הפעלת RapR-Shp2 במורפודינמיקה של תאי HeLa. ברגע ש-RapR-Shp2 הופעל, התאים הראו עלייה בפעילות הבולטת כמו גם בשטח התא. זה מצביע על כך שהפעלת RapR-Shp2 מספיקה כדי לגרום לשינויים מורפודינמיים בתאי HeLa ועשויה לאפשר לחוקרים לחקור מסלולי איתות ספציפיים במורד הזרם האחראים להשפעה זו.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67142/67142fig04.jpg"> איור 4: תוצאות מבדיקת הפעילות המבוססת על פקסילין: פעילות קונסטיטוטיבית, שלילית דומיננטית ו-RapR-Shp2 עברו זירוז חיסוני והיו כפופות לבדיקת הפעילות באמצעות הפרוטוקול המתואר. רמות pY31 paxillin הן ב-CA והן ב-RapR-Shp2 היו דומות, מה שמצביע על כך שלמבנה RapR-Shp2 הייתה פעילות דומה בהשוואה ל-CA Shp2 לאחר שהופעל. לדגימת RapR-Shp2 שלא הופעלה לא הייתה פעילות, בדומה לדגימת ה-DN, מה שמעיד על כך שהיא לא הייתה "דולפת". נתון זה שונה מ- Fauser et al.12. קיצורים: RapR = רפמיצין-מוסדר; Shp2 = Src homology-2 תחום המכיל חלבון טירוזין phosphatase; DN = שלילי דומיננטי; CA = פעיל באופן מכונן; FRB = תחום מחייב FKBP-רפמיצין. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67142/67142fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67142/67142fig05.jpg"> איור 5: תוצאות מבדיקת ליזט של כל התא: פעיל באופן קונסטיטוטיבי, שלילי דומיננטי ו-RapR-Shp2 באו לידי ביטוי בתאי HEK293T ופרוטוקול הליזט של כל התא הושלם. כאשר RapR-Shp2 לא היה פעיל, הוא לא הפעיל את ERK1/2 באמצעות זרחון, בדומה לדגימת DN Shp2. הדבר מצביע על כך של- RapR-Shp2 אין פעילות כאשר אינו פעיל. לאחר ההפעלה, רמת הזרחן ERK1/2 הייתה דומה לזו של דגימת CA Shp2, מה שמצביע על הפעלה מוצלחת ואיתות במורד הזרם של Shp2. באופן דומה, תאי A431 המבטאים RapR-Shp2 הראו ירידה בזרחון הן של EGFR והן של PLCγ, שניהם מצעים ידועים של Shp2. נתון זה שונה מ- Fauser et al.12. קיצורים: RapR = רפמיצין-מוסדר; Shp2 = Src homology-2 תחום המכיל חלבון טירוזין phosphatase; DN = שלילי דומיננטי; CA = פעיל באופן מכונן; ERK = קינאז מווסת אות חוץ-תאי; GAPDH = גליצראלדהיד 3-פוספט דהידרוגנאז; EGFR = קולטן גורם גדילה אפידרמלי; PLCγ = פוספוליפאז C גמא; FRB = תחום מחייב FKBP-רפמיצין. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67142/67142fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67142/67142fig06.jpg"> איור 6: ניתוח נתוני שטח התא והפעילות הבולטת בהתבסס על הדמיה חיה: תאי HeLa הודבקו ב-RapR-Shp2 ועברו את פרוטוקול ההדמיה החיה המתואר. הנתונים נותחו כמתואר בפרוטוקול ניתוח הנתונים. לאחר שהופעלו (מסומן על ידי הקו האפור האנכי), תאי HeLa הראו עלייה הן בפעילות הבולטת של התא והן בשטח התא. בדגימות השליליות שביטאו רק FRB, פעילות זו לא הייתה נוכחת. זה מצביע על כך שהפעלת RapR-Shp2 גורמת לשינויים מורפודינמיים מהירים בתוך תאי HeLa ומעודדת התפשטות תאים ובליטתם. נתון זה שונה מ- Fauser et al.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67142/67142fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Tyrosine phosphatases are an important family of enzymes that regulate critical physiological functions. They are often dysregulated in human diseases, ...

development-application-rapamycin-regulated-tyrosine

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שיטה לשליטה במרחב ובזמן פעילות GTPase קטן לאור המתואר. שיטה זו מבוססת על heterodimerization FKBP-FRB rapamycin הנגרמת צילום-caging מערכות. אופטימיזציה של הקרנת אור מאפשר הפעלה מבוקרת spatio-temporally של GTPases קטנים ברמה subcellular.

במרחב ובזמן מניפולציה של פעילות GTPase קטן ברמת subcellular ועל לוח זמנים של שניות בתאים חיים

כאן, אנו מציגים עבור בידודו של העכבר הראשי בריא ופונקציונליים hepatocytes פרוטוקול. הוראות לגילוי סינתזה של חלבון nascent הכבד על ידי המצע תיוג לא רדיואקטיבי נמסרו כדי לעזור להבין את המנגנונים שבבסיס סינתזת החלבון בהקשר של הומאוסטזיס אנרגיה-מטבוליזם בכבד.

בידוד של העכבר הראשי Hepatocytes לניתוח סינתזת חלבון Nascent בשיטה תיוג L שאינו רדיואקטיבי-azidohomoalanine

כאן, אנו מציגים עבור co-immunoprecipitation ואת וזמינותו של פעילות אנזימטי על חרוזי ללמוד בו זמנית את התרומה של חלבון ספציפי דומיינים של קולטני ממברנה פלזמה אנזים הגיוס והן פעילות אנזים פרוטוקול.

Co-immunoprecipitation Assay ללמוד אינטראקציות פונקציונלי בין קולטנים ואנזימים

במחקר זה, הצלחנו לשפר את יכולות ניתוח הנתונים של הניסוי חצים על ידי ניטור השינויים ביציבות החלבונים והערכת האהדה של ליגוניות חלבונים ואינטראקציות. ניתן להתוות את האינטראקציות לשתי עקומות: עקומת פרוטחרדה ועקומת תלות במינון. השתמשנו באינטראקציה של mTOR-rapamycin כמקרה מופתי.

יחסי למחצה כמותית של התרופה מגיב יציבות היעד (חצים) שיטת לימוד האינטראקציה Rapamycin/mTOR

במחקר זה, אנו מתארים הליך מפורט של פיברוזיס בתיווך מעיים של TNBS, אשר מציג הפתופסולוגיה המקבילה ל-פיברוזיס של קרוהן. אנו גם דנים גישה זו לאור של rapamycin הקלה השפעות מעכבות על סיסטיק מעיים.

תובנה מכניסטית לתוך פיתוח של מעיים TNBS-תיווך פיברוזיס והערכת השפעות העכבות של Rapamycin

היכולת להעריך מעורבות היעד על ידי מעכבי מועמד בתאים שלמים היא קריטית לגילוי סמים. פרוטוקול זה מתאר 384 גם פורמט התא סלולרי תרמי shift assay כי אמין מזהה מעורבות היעד הסלולרי של מעכבים מיקוד SHP2 מסוג פראי או גרסאות oncogenic שלה.

הערכת מעורבות יעד סלולרי על ידי SHP2 (PTPN11) מעכבי פוספטאז

ג'פרי ד 'רוטשטיין מדבר על פתולוגיה המנגנונים טרשת לרוחב amyotrophic ALS, התקדמות במחקר ה-ALS, אסטרטגיות הנוכחית לקראת פיתוח של טיפולים.

ALS - מחלת Motor Neuron: מנגנון ולפיתוח טיפולים חדשים

מאמר זה מתאר פרוטוקול מגיב רומן ולהגדיר מיועד מדידה רגישה של ההשפעות הנוירו של תרכובות וטיפולים על שיתוף תרבויות של נוירונים האסטרוציטים באמצעות ניתוח תוכן גבוהה. תוצאות מראים כי ניתוח תוכן גבוהה מהווה טכנולוגיה חדשנית מרגש להערכה neurotoxicity.

עצב Astrocyte שותף תרבות Assay לניתוח תכולה גבוהה של neurotoxicity

תאים סרטניים החלב להביע בלוציפראז מושתלים תת עורי בעכברים דמיינו באמצעות דימות אופטי כדי לפקח על גדילה והתפתחות הגידול הלא פולשני במחקר האורך.

בשנת vivo Bioluminescent הדמיה של גידולים החלב באמצעות ספקטרום IVIS

פרוטוקול זה מדגים כיצד לשמור על בריאות, מובחן האדם גזע עובריים (ES) התאים.

תרבות ותחזוקה של בתאי גזע עובריים אנושיים

למדו פיתוח מערכת רפמיצין מווסתת לשליטה בפעילות טירוזין פוספטאזים בתאים חיים. השיטה מאפשרת ויסות זמני וספציפי של SHIP-2 לחקר מסלולי סיגנל בתאים.

פיתוח ויישום של טירוזין פוספטאזים מווסתים רפמיצין

גלה סרטונים נוספים