בידוד כונדרוציטים וכונדרופרוגניטורים באמצעות הידבקות פיברונקטין ובדיקת נדידה

בתחום הנדסת רקמות הסחוס והרפואה הרגנרטיבית, עדיין קיימת דרישה לשיפור התוצאות הביולוגיות והתפקודיות במונחים של שיפור הטיפול המתמשך ופיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות. המחקר הפרה-קליני הנוכחי מצביע על שימוש פוטנציאלי בכונדרופרוגניטורים שמקורם בסחוס כאופציה בת קיימא לריפוי סחוס. המחקר הנוכחי כולל אסטרטגיות לשיפור נוסף של הפוטנציאל הכונדרוגני תוך שמירה על עוצמה היפרטרופית נמוכה יותר באמצעות שימוש בגורמי גדילה נוספים וטכניקות רקומביננטיות של גנים.

כונדרופרוגנטורים מתמודדים עם אתגרים ניסיוניים, כולל חוסר הסכמה על מינוח, טכניקות בידוד מגוונות, קשיי אפיון, שונות בתנאי התרבות והבנה מוגבלת של המנגנונים הבסיסיים. הוכחה קלינית כי כונדרופרוגניטורים מניבים תוצאות חיוביות בהשוואה לתאים נפוצים יכולה להפחית משמעותית את העומס העולמי הקשור לפתולוגיות הקשורות לסחוס. אבולוציה של טיפולים משופרים באמצעות חלופות נטולות תאים, כגון שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן באבות, ושימוש באסטרטגיות רקומביננטיות להתחדשות סחוס אמיתי דמוי היאלין.

כדי להתחיל, השג מפרקי טיביו-פמורל או ברכיים מתורמים אנושיים ב-1X PBS בתנאים סטריליים, ולאחר מכן העביר את המפרקים שנקטפו על המשטח התחתון הסטרילי במכסה המנוע. כדי לייצב את המפרקים, החזק את העצם התת-כונדרלית כשהסחוס פונה כלפי מעלה. בעזרת להב אזמל מספר 22, קצרו שבבי סחוס בצורת מלבני מהאזורים שאינם נושאי משקל.

חותכים את הסחוס לחלקים בגודל שמונה מילימטרים על 10 מילימטרים מהשכבה השטחית לשכבה העמוקה יותר. לאחר שטיפת הפרוסות עם PBS, מניחים אותן בכלי פטרי המכיל מיליליטר עד שניים של מדיום הנשר הרגיל של דולבקו, או DMEM. לאחר מכן, בעזרת להב אזמל מספר 22, טוחנים את פרוסות הסחוס לגודל קטן ממילימטר אחד בקוביות.

כדי להתחיל, השג סחוס טחון ממפרקי ברכיים אנושיים שחולצו. הכניסו את הסחוס הטחון לבקבוק T25 זקוף המכיל 10 מיליליטר DMEM/F-12 ללא סרום עם 0.15% קולגנאז סוג II לעיכול אנזימטי. השאירו את הבקבוק ללא הפרעה בחממת פחמן דו חמצני למשך 12 עד 14 שעות.

לאחר עיכול לילה, העבירו את המדיום המכיל את הכונדרוציטים המשוחררים לצינור צנטריפוגה סטרילי טרי. השתמש במסננת תאים כדי להפריד את התאים מהפסולת. הוסף נפח שווה של DMEM/F-12 עם סרום בקר עוברי של 10%, או FBS.

צנטריפוגה את התאים המסוננים ב -1, 200 גרם למשך חמש דקות ב -37 מעלות צלזיוס. לאחר השלכת הסופרנטנט, הרכיבו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של מדיום. ספור את התאים הקיימים באמצעות בדיקת אי הכללה כחולה של טריפאן.

לאחר מכן, טען את הכונדרוציטים לבקבוק T25 בריכוז של 10,000 תאים לסנטימטר מרובע. הרחב את התאים למספר המעבר הנדרש באמצעות DMEM/F-12 המכיל 10% FBS. רענן את המדיום כל שלושה ימים לפני קצירת התאים בתת-מפגש באמצעות 0.125% טריפסין המכיל EDTA.

כונדרוציטים נדבקו מיד לאחר ההעמסה ועברו מצורת אבן מעוגלת למראה פיברובלסטי כשהם מתרחבים. כדי להתחיל, השג שבבי סחוס ממפרקי הטיביו-פמורל או הברך האנושיים שחולצו. חשפו את שבבי הסחוס לעיכול אנזימטי רציף למשך הלילה, תחילה השתמשו ב-0.2% פרונאז במשך שלוש שעות, ולאחר מכן 0.04% קולגנאז מסוג II למשך 12 שעות באמבט מים רועדים שנשמר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, מצפים את המספר הנדרש של בארות של צלחת שש בארות ב -1.5 מיליליטר של תמיסת הפיברונקטין PBS. אוטמים היטב את הצלחת ומכניסים למקרר למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, הוציאו את צלחת שש הבארות המצופה פיברונקטין מהמקרר.

לאחר הסרת עודפי פיברונקטין יש להוסיף שניים עד שלושה מיליליטר של מדיום DMEM/F-12 רגיל לבארות המצופות. זרעו את הכונדרוציטים המשוחררים על הבארות המצופות בצפיפות של 4,000 תאים לבאר והשאירו את הצלחת ללא הפרעה למשך 20 דקות. לאחר הדגירה יש לשאוב את עודפי המדיה והתאים שאינם נדבקים.

הוסף שניים עד שלושה מיליליטר של DMEM/F-12 עם סרום בקר עוברי של 10% לבארות. שמור על התאים הדבקים בתנאי תרבית סטנדרטיים למשך 10 עד 12 ימים כדי להשיג שיבוטים של תאי אב כונדרוגניים, או CPC, ולאחר מכן בודד את שיבוטי ה-CPC באמצעות 0.125% טריפסין EDTA למשך 180 שניות, ולאחר מכן הפעל שוב ביחס של שיבוט אחד לחמישה סנטימטרים רבועים. הרחב את ה-CPC הפוליקלונלי המועשר למפגש הנדרש.

כונדרוציטים שעברו בדיקת הידבקות פיברונקטין מציגים צמיחה משובטת, ומגיעים להכפלת האוכלוסייה לחמישה ביום העשירי. כדי להתחיל, השג את צמחי הסחוס המגולחים מהמפרק המפרקי שנקטף בתוספת מדיום DMEM/F-12. הנח את הצלחת עם צמחים בתוך חממת פחמן דו חמצני המכוונת ל -37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.

לאחר יומיים, העבירו את האקספלנטים לצינור צנטריפוגה המכיל 10 מיליליטר של תמיסת קולגנאז 0.1% לעיכול אנזימטי. דגרו את הצינור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר העיכול, שטפו את הצמחים עם 1X PBS והחזירו אותם לאותן בארות בצלחת המכילה מדיום DMEM/F-12 טרי בתוספת מדיום.

שמור על הצלחת בחממה בתנאי תרבות סטנדרטיים ופקח על נדידת כונדרופרוגניטורים בימים שלאחר מכן. לאחר שהאקספלנטים מגיעים לתת-מפגש, קצרו את תאי הכונדרופרוגניטורים המזנכימליים, או MCPs, באמצעות תמיסת EDTA של 0.125% טריפסין. הרחב את ה-MCPs באמצעות מדיום DMEM/F-12 בתוסף.

כונדרופרוגניטורים מתחילים לנדוד מקצה האקספלנט ביום העשירי של התרבית, ומציגים דפוס צמיחה בצורת ציר עם התרחבות נוספת.