יצירת תאי T רגולטוריים של קולטן אנטיגן כימרי אנושי

המעבדה שלנו מתכננת קולטני חיסון מלאכותיים, כמו קולטני אנטיגן כימריים, וחוקרת כיצד הם משפיעים על ביולוגיה רגולטורית של תאי T. על ידי המצאת רצפי דנ"א חדשים ושימוש במודלים אנושיים של מחלות בעכברים, אנו שואפים ליצור טיפולים מהונדסים של תאי מערכת החיסון למחלות אוטואימוניות, דחיית השתלות, סרטן והזדקנות. בעת תכנון קולטני אנטיגן כימריים עבור תאי T רגולטוריים, חיוני לקחת בחשבון את חוזקם.

CAR Tregs בעלי זיקה גבוהה מתנהגים יותר כמו תאי T משפיעים, מייצרים ציטוקינים דלקתיים מוגברים ומפגינים פעילות הרג גדולה יותר. המחקר המתמשך שלנו מצביע על כך שהפחתת הזיקה ל-CAR מובילה לשיפור פרופילי הציטוקינים והתפקוד ב-CAR Tregs. תחום CAR Treg נמצא בהתהוות וחסר סטנדרטיזציה.

הפרוטוקול שלנו מציג גישה חזקה ואוניברסלית לייצור ובדיקה של CAR Tregs. זה משפר את יכולת השחזור ומאיץ את החדשנות תוך הנחיית מעבדות חדשות במחקר CAR Treg, במיוחד בהתחשב באתגרים של מחסור Treg ודרישות מיוחדות. אנו חוקרים את המנגנונים שבהם תאי T רגולטוריים משתמשים כדי לשמור על איזון חיסוני ולקדם ריפוי רקמות.

המחקר שלנו כולל הבנת איתות ותפקוד CAR Treg, כמו גם חקר הקשרים חדשים של מחלות שבהם טיפול CAR Treg עשוי להציע יתרונות ייחודיים בהשוואה לאסטרטגיות הנוכחיות. כדי להתחיל, להעביר את התוכן של leukopak לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר. הוסיפו נפח שווה של DPBS עם 2% סרום בקר עוברי וערבבו בעדינות עם פיפטה.

סובבו את הצינורית ב-300 גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שאיפת הסופרנאטנט, הרכיבו מחדש את גלולת התא בשני מיליליטר של DPBS עם נסיוב בקר עוברי 2%. לאחר מכן, הוסף שמונה מיליליטר של תמיסת אמוניום כלוריד לתרחיף התא וערבב בהיפוך עדין.

לאחר ההפסקה, סובבו את התאים השטופים במשקל של 150 גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שאיפת הסופרנטנט, יש להשהות מחדש את גלולת התא ב-30 מיליליטר של DPBS עם 2% נסיוב בקר עוברי. לאחר מכן, סובבו מטה 10 בחזקת שמונה עד 10 בחזקת תשעה מרכזיות מרכזיות ב-500 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

והשהיה מחדש במאגר הפרדת תאים בריכוז של חמש פעמים 10 בחזקת שבעה תאים למיליליטר. למיון תאים בסיוע פלואורסצנטי של תאי T רגולטוריים, סובבו תאים חיוביים CD4 במשקל 500 גרם למשך חמש דקות. לאחר מכן, לבנות מחדש תאים ב 200 מיקרוליטר של DPBS.

עבור כל מיליון תאים, הוסף מיקרוליטר אחד של CD4 FITC אנטי-אנושי, מיקרוליטר אחד של CD25 APC אנטי-אנושי, ומיקרוליטר אחד של CD127 PE אנטי-אנושי. לאחר ערבוב עדין של הצינור, הכניסו אותו למקרר של ארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר שהתאים נשטפים עם 10 מיליליטר של DPBS עם 2% סרום בקר עוברי, סובבו אותם ב 500 גרם במשך חמש דקות והשהו מחדש בעדינות את התאים המוכתמים ב 1.5 כפול 10 בחזקת שבעה תאים למיליליטר ב DPBS עם 2% נסיוב בקר עוברי. לאחר מכן, העבירו את מתלה התאים המוכתמים דרך מכסה מסנן של 40 מיקרומטר לתוך צינורות מיון תאים בסיוע פלואורסצנטי.

הכינו צינורות איסוף של 15 מיליליטר המכילים שלושה מיליליטר של מדיום RPMI10 והניחו אותם על קרח. לבסוף, מיין CD4 חיובי, CD25 גבוה, CD127 שלילי תאי T רגולטוריים, ו CD4 חיובי, CD25 נמוך, CD127 חיובי תאי T קונבנציונליים באמצעות מיון תאים בסיוע פלואורסצנטי. כדי להתחיל, לקחת תאי T רגולטוריים שבודדו מדם אנושי 48 שעות לאחר ההפעלה ולהשעות אותם מחדש.

לאחר ספירת התאים, מסתובבים ב 500 גרם במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. השהה מחדש תאי T רגולטוריים ב- RPMI10 ב 1.25 כפול 10 בחזקת שישה תאים למיליליטר עם 1, 000 יחידות בינלאומיות למיליליטר של אינטרלוקין-2. כעת, הוסף כל aliquot lentivirus ל 2.5 כפול 10 בחזקתם של חמישה תאי T רגולטוריים ב 200 מיקרוליטר בצינור מיקרוצנטריפוגה.

Spinoculate ב 1, 000 גרם במשך שעה אחת ב 32 מעלות צלזיוס. העבר כל תגובה של 200 מיקרוליטר לצלחת של 24 בארות. לדגור על הצלחת עם תאי T רגולטוריים מומרים באינקובטור תרבית רקמה למשך הלילה.

ממלאים כל באר לשני מיליליטר עם מדיום RPMI10 כאשר ריכוז אינטרלוקין-2 הסופי הוא 1, 000 יחידות בינלאומיות למיליליטר. הערך את יעילות שינוי הגנים באמצעות ציטומטריית זרימה, כפי שמוצג כאן. כדי להתחיל, קח תאי T רגולטוריים מושעה מחדש עם חרוזי CD28 נגד CD3, CD28 בצינור חרוטי של 15 מיליליטר 48 שעות לאחר ההפעלה.

לדגור על תרחיף התא במגנט במשך שלוש דקות. בעודם במגנט, מעבירים את התאים בתווך באמצעות פיפטה לצינור חדש. לאחר הסרת החרוזים, יש לאפשר לתאי ה-T הרגולטוריים לנוח בסל"ד 10 למשך שעתיים.

לאחר מכן, סובבו תאי T רגולטוריים במשקל 500 גרם למשך חמש דקות. לאחר פירוק הסופרנאטנט, יש להשהות מחדש את התאים בתווך סרום מופחת שחומם מראש בארבע כפול 10 בחזקת שישה תאים למיליליטר. תאי Aliquot ב 100 מיקרוליטר בצינורות צנטריפוגות 1.5 מיליליטר קישור חלבון נמוך.

הוסף קולטן אנטיגן כימרי אדנו הקשורים וירוס בריבוי של זיהום של 20, 000 לכל דגימה resuspend. לאחר מכן, לדגור על צינורות התגובה באינקובטור תרבית הרקמה למשך שעה. במהלך הדגירה, הכינו קומפלקסים של ריבונוקלאו פרוטאין CRISPR-Cas9 על ידי הוספת 8.3 מיקרוליטר של חלבון Cas9 ל-2.5 מיקרוליטר של RNA מנחה יחיד, המכוון למוקד גן המסלול.

לאחר ערבוב יסודי של הרכיבים, דוגרים על תערובת ריבונוקלאו פרוטאין במשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור תרביות הרקמה. לאחר מכן, מלא צינור אלקטרופורציה טרי עם שלושה מיליליטר של חיץ אלקטרופורציה אוסמולריות גבוהה. הכנס את צינור האלקטרופורציה המלא לתחנת פיפטה של מערכת האלקטרופורציה עד לשמיעת קליק.

הגדר תנאי אלקטרופורציה ל -2, 200 וולט, 20 אלפיות השנייה, פעימה אחת במערכת האלקטרופורציה. כאשר הדגירה בת השעה עם הנגיף הקשור באדנו הושלמה, סובבו את התאים עם הנגיף ב -300 גרם במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שאיפת הסופרנאטנט, יש להשהות מחדש את כדורית התא ב-100 מיקרוליטר של חיץ תרחיף התא המסופק על ידי מערכת האלקטרופורציה לכל דגימה.

לאחר מכן, מוסיפים 10.8 מיקרוליטר של קומפלקס ריבונוקלאו פרוטאין לדגימה ומערבבים היטב עם פיפטה מבלי ליצור בועות. כעת, הכניסו קצה אלקטרופורציה של 100 מיקרוליטר על ידי דחיפת הפיפטה לתחנה השנייה שלה כדי לפתוח את המהדק. מקמו את הראש העליון של הפיפט בתוך קצה האלקטרופורציה עד שהמהדק יתחבר היטב עם גזע ההרכבה של הבוכנה.

שחררו את הכפתור בהדרגה תוך שמירה על לחץ כלפי מטה על פיפטה כדי להבטיח שהקצה יתאים היטב ללא רווחים. לאחר מכן, לחץ על פיפטה לתחנה הראשונה וטבול את קצה האלקטרופורציה לתוך תערובת ריבונוקלאו פרוטאין התא. משכו בעדינות את הדגימה לתוך פיפטה ללא בועות.

הכנס את הפיפטה עם קצה האלקטרופורציה המותקן המכיל את הדגימה במאונך לתוך צינור E עד שיישמע צליל קליק. לאחר אישור ההגדרות האופטימליות עבור תאי T רגולטוריים אנושיים, לחץ על התחל במסך המגע כדי לחשמל את התאים. המתן עד שמסך המגע יוצג במלואו.

מוציאים בעדינות את פיפטה ומעבירים מיד את הדגימה לצלחת שש בארות מוכנה המכילה 2.5 מיליליטר של מדיום RPMI10 מחומם מראש ללא אנטיביוטיקה עם אינטרלוקין-2 לכל באר. לאחר נדנוד עדין של הצלחת בתנועות ליניאריות, הניחו אותה באינקובטור תרבית הרקמות. למחרת, 16 עד 18 שעות מאוחר יותר, להחליף את התקשורת עם מדיה המכילה אנטיביוטיקה.

ספרו את תאי T רגולטוריים מחושמלים ואת התרבית ב -10 בחזקת שישה תאים למיליליטר עם 1, 000 יחידות בינלאומיות למיליליטר של אינטרלוקין-2.