טכניקה אופטימלית ופשוטה לייצור ותרבות של פרוסות כבד בחיתוך מדויק

פרוטוקולים לייצור ותרבית פרוסות כבד חתוכות במדויק, או PCLS, יכולים להשתנות באופן דרסטי. החיסרון העיקרי של PCLS הוא זמן מחצית החיים הקצר שלהם, אך כאן, אנו מדגימים כי ניתן להשיג ייצור וטיפוח PCLS בתנאי מעבדה סטנדרטיים עם גישה ל-Vibratome תוך הבטחת זמן מחצית חיים של ארבעה ימים לפחות. PCLS, מודל מושך שממלא את הפערים בין דגמי in vitro ו-in vivo, אך לעתים קרובות הם מוזנחים בגלל זמן מחצית החיים הקצר יחסית שלהם. עם זאת, הם מכילים את כל סוגי התאים וארכיטקטורה משומרת, החיונית לסיכום מטבולי, ולכן דומים למודל מיני של האיבר כולו, המאפשר מחקר וטיפול ברקמות חיות תוך שכפול הפנוטיפים המורכבים שלהן. פרוסות רציפות הן תהליך פשוט מאוד אך מאתגר מבחינה טכנית. כדי להקל על כך, הפרוטוקול שלנו מתמקד בשלבים מרכזיים, כגון כיוון החיתוך והטמעת הרקמה, אך גם ברלוונטיות של נפח דגם מיני לתרבית ומערכת דינמית להגדלת זמן מחצית החיים שלהם.

[קריין] לפני הקציר הכינו ליטר אחד של מאגר קרבס-הנסלייט, מגש ויברטום מחוטא ומקורר, להבי ויברטום חיטוי ואגרוז נמס נמוך של 4%. ביום הקציר יש לשמור את האגרוז המומס באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד לשימוש. לאחר מכן, הכינו את צלחות התרבות על ידי הוספת 2.6, 1.5 ו-0.7 מיליליטר של מדיה שלמה לבאר לצלחות של שש, 12 ו-24 בארות בהתאמה. הכנס תוספות נקבוביות של שמונה מיקרומטר לכל באר. מניחים את הצלחות באינקובטור לח המוגדר ל -37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני ו -21% חמצן. עקר את כל המכשירים הנדרשים לקציר בשיטות עיקור מתאימות. יש לרסס את בטנו של העכבר המורדם באתנול 70% כדי לחטא את האזור. בעזרת מלקחיים ומספריים סטריליים, חותכים את העור והצפק מאמצע הבטן כדי לפתוח את חלל הבטן. נתח בעדינות את הכבד מהאיברים או כלי הדם הסובבים תוך הימנעות מנזק לאונות. לאחר מכן, אחסן את כל הכבד מיד במאגר קרבס קר כקרח. בעזרת מלקחיים קהים וסכין או מספריים חדים וסטריליים, הפרד כל אונה בנפרד כדי למנוע פגיעה באונות במהלך ההפרדה. בעזרת סכין חדה וסטרילית, חתוך את כל קצוות האונה שנבחרה כדי ליצור קצוות ישרים וניתנים לניהול להטמעה. לאחר מכן, שפכו את האגרוז בעל ההמסה הנמוכה של 4% לצלחת פטרי באורך שלושה סנטימטרים המונחת על קרח רטוב כדי להתקרר באופן אחיד ולמנוע מהאונה לשקוע. השאירו את האגרוז להתקרר עוד 30 שניות, והניחו את האונה הגזומה במרכז האגרוז, ואפשרו לה להתיישב באמצע הגוש. לאחר מכן, חתכו את הקצוות החיצוניים של גוש האגרוז והסירו את גוש האגרוז מהצלחת. ודא שהצד העליון והצד המודבק לפלטפורמת הוויברטום מקבילים לקצה העליון של האונה. התחל בהגדרת הוויברטום לחיתוך בעובי של 250 מיקרומטר במהירות של חמש ותדירות של שבעה הרץ. לאחר עיקור הוויברטום והנחת המגש על הוויברטום, הקיפו אותו בקרח כדי לשמור על הסביבה קרה. הגדר את הלהבים בזווית של 10 מעלות כלפי מטה מהמישור האופקי. לאחר מכן, מלאו את מיכל הוויברטום במאגר קרבס קר כקרח. מרחו שכבה דקה של דבק ציאנואקרילט על הפלטפורמה כדי להכין אותה להרכבת גוש האגרוז. לאחר מכן, יבש את קצה גוש האגרוז שיודבק על הפלטפורמה באמצעות רקמה סופגת סטרילית. כעת, הנח את בלוק האגרוז על הפלטפורמה הנשלפת של הוויברטום. מקם את אונת הכבד זקופה כדי לאפשר חתכים רוחביים, מה שמפחית את הלחץ על האונה ומאפשר חיתוך חלק יותר. המתן דקה אחת עד שהדבק יתייצב והטביע את הפלטפורמה במיכל הוויברטום, וודא שבלוק האגרוז מכוסה לחלוטין במאגר קרבס. כדי לתכנת את הוויברטום לחיתוך, הגדר את מצבי ההתחלה והעצירה. לאחר מכן, התחל לחתוך את הפרוסות עד שמגיעים לאונה הכבד. השתמש במרית כדי לאסוף את פרוסות הכבד, מכיוון שהדבר מונע נזק, בניגוד למלקחיים או מברשות. אוספים את הפרוסות במאגר קרבס קר כקרח עד שהן מוכנות לתרבית. בעזרת מרית מעבירים את פרוסות הכבד לבארות המוכנות המכילות מדיה ותוספות. לאחר מכן, הנח את הלוחות על שייקר מסלולי המוגדר ל-130 סל"ד ודגר אותם בחממת תרבית תאים קונבנציונלית ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני ו-21% חמצן.