Name: טכניקה אופטימלית ופשוטה לייצור ותרבות של פרוסות כבד בחיתוך מדויק (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-22T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: למדו פרוטוקול אופטימלי לייצור ותרבות פרוסות כבד בחיתוך מדויק מכבד עכברים באמצעות ויברטום. שיטה זו מאפשרת שימור הפרוסות לפחות ארבעה ימים ותומכת במחקר מטבוליזם כבדי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>פרוטוקול סטנדרטי לתרבית פרוסות כבד בתנאי מעבדה בסיסיים

<table><tbody><tr><td>צלחת פטרי 3 ס"מ</td><td>כל מתאים</td><td></td><td>לתרבית תאים</td></tr><tr><td>6, 12, 24 צלחת תרבית</td><td>באר כל מתאים</td><td></td><td>לתרבית תאים</td></tr><tr><td>ציאנואקרילט סופר דבק</td><td>כל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-גלוקוז</td><td>Gibco</td><td>A24940</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Merck</td><td>HT110316</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>כל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>ThermoFisher</td><td>26400044</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15750060</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Merck</td><td>51275</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>מוסיף 8um, עבור 12 לוחות</td><td>באר Strastedt</td><td>83.3931.800</td><td></td></tr><tr><td>מוסיף 8um, עבור 24 לוחות</td><td>באר Strastedt</td><td>83.3932.800</td><td></td></tr><tr><td>מוסיף 8um, עבור 6 לוחות</td><td>באר Strastedt</td><td>83.3930.800</td><td></td></tr><tr><td>KREBS</td><td>Merck</td><td>K3753</td><td></td></tr><tr><td>קולט אדים</td><td></td><td></td> זרימה למינרית <td>Hepa סינון אוויר</td></tr><tr><td>אגרוז נמס נמוך&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>16520050</td><td></td></tr><tr><td>מגיב טטרזוליום MTS&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab197010</td><td></td></tr><tr><td>קורא צלחות מרובות בארות&nbsp;</td><td>כל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>טבליות PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>להב אזמל</td><td>כל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים כירורגיים</td><td>כל אחד</td><td></td><td>עם קצה מרובע שטוח&nbsp;</td></tr><tr><td>מספריים כירורגיים</td><td>כל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>William' s בינוני E עם GlutaMAX (WME)</td><td>ThermoFisher</td><td>W4125</td><td></td></tr></tbody></table>

טכניקה אופטימלית ופשוטה לייצור ותרבות של פרוסות כבד בחיתוך מדויק

Optimized and Simplified Technique for the Production and Culture of Precision-Cut Liver Slices

בעת הקציר, הזלוף של החיה מושמט בכוונה כדי להבטיח עיבוד מהיר של האיבר ולמנוע נזק לאיברים. הכבד נשאב במהירות לאחר החתך ומונח מיד במאגר מגן איברים קר כקרח, למשל, בופר קרבס24,29. למרות שחיתוך רקמת כבד טרייה ללא הטבעה תואר בעבר1, הטמעת הכבד באגרוז30 נמס נמוך (איור 1) בשילוב עם מאגר מגן איברים יאפשרו תנאי חיתוך אופטימליים על הוויברטום, יפחיתו נזק לרקמות ויגדילו את יכולת השחזור בעובי החתך. עובי הרקמה הוא קריטי מכיוון שחלקים דקים מאפשרים ליותר שכבות תאים לגשת לחומרים מזינים וחמצן31 ולהפחית את מוות התאים. עם זאת, קטעים דקים מדי הופכים קשים לחיתוך הומוגני. לעומת זאת, פרוסות עבות מ -400 מיקרומטר יראו קצב חדירה נמוך יותר של חומרים מזינים. החלקים הודגרו בממשק נוזל-אוויר באמצעות תוספת (איור 1) והודגרו עם 5% CO2 ו-21% O2 ב-37 מעלות צלזיוס על שייקר. יש לדגור את החלקים במדיום תרבית תוך 3 שעות לאחר הקטיף, ולאחר מכן מוות תאים מתרחש במהירות32.
כדי לקבוע את הכדאיות של PCLS, כדאיות התאים הוערכה על ידי בדיקת 4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS), הדורשת דהידרוגנאזות תלויות NAD(P)H, כלומר תאים פעילים מטבולית, כדי להפחית MTS. ערכי MTS נורמלו למשקל הפרוסה המתאים. כדי לייעל את כדאיות ה-PCLS, נפח מינימלי של מדיום תרבית היה חיוני לשמירה על הכדאיות לאחר 24 שעות של דגירה. נפח של 0.7 מ"ל ב-24 לוחות בארות הראה ירידה משמעותית בכדאיות על ידי בדיקת TMS (p = 0.02) בהשוואה ל-1.5 מ"ל ב-12 לוחות בארות ו-2.6 מ"ל ב-6 לוחות בארות (איור 2A). נפחים אלה נבחרו כדי לאפשר כיסוי קל של החלקים, אך ייתכן שיהיה צורך להתאים אותם בהתאם לסוג התוספות והצלחות בהן נעשה שימוש. כמו אחרים33, 12 צלחות באר משמשות כפשרה הטובה ביותר להישרדות אופטימלית בנפח קטן יותר של מדיום תרבית.
טלטול הוא חיוני ומגדיל את כדאיות ה-PCLS ב-50% ב-24 שעות לאחר הדגירה בהשוואה לתרבית סטטית (איור 2B). טלטול יוצר ממשק אוויר-נוזל קריטי, המותאם לשימוש במעברים, ומאפשר גישה לחומרים מזינים וחמצן לשני הצדדים של הקטע. ספיגת החמצן והחומרים המזינים מוגברת גם על ידי הזרימה המתמדת שנוצרת על ידי תנועת הרעידה, העוברת גם דרך קרום הטרנסוול.
בדיקת MTS הוערכה משעה אחת של דגירה עד ליום 6 של הדגירה. כדאיות התא נותרה קבועה מהיום ה-0 עד היום הרביעי לאחר הדגירה לפני שנצפתה ירידה משמעותית (p = 0.05) ביום השישי (איור 2C). מורפולוגיה של PCLS שהוערכה על ידי צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&amp;E) לא הראתה שינוי בדרכי המרה ובארכיטקטורה עד 5 ימים לאחר הדגירה (איור 3A-D). בהשוואה ליום 0 (איור 3A), PCLS לא הראה הבדל היסטולוגי ביום 1 (איור 3B) וביום 2 (איור 3C) לאחר הדגירה, עם היפרכרומזיה גרעינית, חדירה דלקתית קלה, ואקואוליזציה לטובת תהליך מוות תאים מתון ביום 5 לאחר הדגירה (איור 3D). יחד, פרוטוקול תרבית PCLS זה מאפשר כדאיות למשך 4 ימים לפחות, בהתאם למחקרים המשתמשים בפרוסות בתנאים דומים31.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67202/67202fig01.jpg"> 
איור 1: סיכום סכמטי של הפרוטוקול ליצירת PCLS. נתון זה שונהמ-34. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67202/67202fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67202/67202fig02.jpg"> 
איור 2: פרוטוקול אופטימלי של תרבית PCLS מראה כדאיות משביעת רצון למשך 5 ימים. (A) השפעת גודל הבאר על התפשטות התאים (n=3). (B) השפעת טלטול על התפשטות תאים (n=6 לכל מצב). (C) בדיקת התפשטות תאי MTS מקטעי כבד מ-d0 עד d6 ימי דגירה (n=5 לנקודת זמן). יחידה שרירותית OD, מנורמלת לפרוס משקל טרי. הגרף מציג ממוצע ± SD. מבחן t של סטודנט דו-זנבי לא מזווג, ns=לא מובהק, *p&lt;0.05, **p&lt;0.01. נתון זה שונהמ-34. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67202/67202fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67202/67202fig03.jpg"> 
איור 3: תוצאות היסטולוגיה. (א-ד) תמונות מייצגות של היסטולוגיה של PCLS בכבד לאחר צביעת H&amp;E. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. נתון זה שונהמ-34. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67202/67202fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

This protocol presents a simple system for the creation and culture of Precision-cut Liver Slices (PCLS). PCLS contains all cells in an intact environment ...

optimized-simplified-technique-for-production-culture-precision-cut

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

תרביות צמחי רקמה ראשוניים אורגנוטיפיים, הכוללות פרוסות חתוכות במדויק, מייצגות את ארכיטקטורת הרקמה התלת-ממדית (תלת-ממדית), כמו גם את האינטראקציות הרב-תאיות של רקמה טבעית. סרטון זה מתאר גידול של פרוסות רקמה שמקורן בגידול ריאות באמצעות יחידת דגירה מסתובבת, מערכת המאפשרת חשיפה לסירוגין של רקמות לחמצן ולחומרים מזינים. הפרוטוקול מתאר את המתודולוגיה ליצירת ותרבית חיתוך מדויק של פרוסות גידולי ריאה לצורך מחקרי תגובה תרופתית.

תרבית צמחי רקמת גידול ריאה: הליך ליצירה ותרבית של פרוסות גידול ריאה חתוכות במדויק

בסרטון זה אנו מתארים הליך לניפוח ריאות אנושיות מבודדות באגרוז והכנת פרוסות ריאה אנושיות חתוכות במדויק. פרוסות הריאות המוכנות ex vivo יכולות לשמש לניסויים אימונולוגיים נוספים.

הכנה מבוססת אגרוז של פרוסות ריאה חתוכות בדייקנות אנושית

מתוארת טכניקה לבידוד הפטוציטים אנושיים ותאי כבד לא פרנכימליים מאותו תורם. סוגי תאי הכבד השונים בונים את הבסיס למודלים תפקודיים של כבד והנדסת רקמות. שיטה חדשה זו שואפת לבודד תאי כבד בתפוקה גבוהה ובכדאיות.

פרוטוקול הבידוד של hepatocytes האדם הראשי הקביל סרן אוכלוסיות של תאים בכבד ללא parenchymal

פציעות כבדות מלוות הרחבת תא ובתאים מייצגים אוכלוסייה הטרוגנית תא. סיווג רומן של תא הסלולר זה מאפשר הבחנה של תת מרובים. השיטה המתוארת כאן ממחישה את הזרימה cytometry ניתוח ובידוד טוהר גבוה של תת שונים שיכול לשמש מבחנים נוספים.

בידוד והעשרה של קבוצות משנה כבדים ובתאים המזוהים על ידי שילוב מרקר Surface Novel

פרוטוקול זה מספק שיטה פשוטה ואמינה לייצור פרוסות כבד בר קיימא לחתוך מפני עכברים. Vivo דגימות רקמות לשעבר יכול להישמר תחת רקמת המעבדה התנאים התרבות במשך ימים מרובים, מתן מודל גמיש לבחון פתוביולוגיה בכבד.

מורנה דיוק-גזור פרוסות הכבד כמודל Vivo Ex של ביולוגיה של הכבד

מוצג כאן פרוטוקול לשימור התכווצות כלי הדם של רקמת הריאה המורינית PCLS, וכתוצאה מכך תמונה תלת ממדית מתוחכמת של כלי הדם הריאתי ודרכי הנשימה, אשר ניתן לשמר עד 10 ימים כי הוא רגיש הליכים רבים.

פרוסות ריאות חתוכות מדויקות ככלי יעיל למבנה כלי הריאות Ex vivo ולמחקרי התכווצות

פרוטוקול זה מציג טכניקת זילוח כבד אופטימלית של collagenase בשני שלבים במודל חולדה ומראה את השימוש בהפטוציטים מבודדים עבור תרבית ארוכת טווח במבחנה של אורגנואידים תלת-ממדיים.

זילוח כבד חולדה ובידוד הפטוציטים ראשוני: הליך ישן חיוני לתרבית אורגנואידים תלת-ממדית חדשנית

וידאו זה מדגים את פרוטוקול ב assay אנגיוגנזה במבחנה כי משחזר שלבים שונים של אנגיוגנזה. זמן לשגות תמונות של הנבטה, היווצרות לומן, הסתעפות ו השקה - התכונות העיקריות של אנגיוגנזה - מוצגים.

אופטימליים הפיברין ג&#39;ל ביד Assay לחקר אנגיוגנזה

פרוטוקול זה מתאר את ייצור KLRG1 tetramer, אשר הוא כלי רב עוצמה לניתוח KLRG1 ligands.

פרוטוקול לייצור KLRG1 Tetramer

טכניקה שלמים תרבות העובר מאפשר לנו עכבר התרבות עוברי...

שיטת התרבות העובר שלמים מכרסמים באמצעות Rotator מסוג התרבות מערכת בקבוק

למדו פרוטוקול אופטימלי לייצור ותרבות פרוסות כבד בחיתוך מדויק מכבד עכברים באמצעות ויברטום. שיטה זו מאפשרת שימור הפרוסות לפחות ארבעה ימים ותומכת במחקר מטבוליזם כבדי.

טכניקה אופטימלית ופשוטה לייצור ותרבות של פרוסות כבד בחיתוך מדויק

גלה סרטונים נוספים