פיתוח מודל ביופילם של מושבה פולימיקרוביאלית לבדיקת אנטי-מיקרוביאלים בסיסטיק פיברוזיס

המחקר שלנו התמקד בשימוש במודלים רב-מיקרוביאליים מורכבים כדי להבין את יחסי הגומלין המורכבים בין מיקרובים בסביבת סיסטיק פיברוזיס וכיצד זה גורם לסבילות אנטי-מיקרוביאלית מוגברת. אנו מקווים להשתמש בידע זה כדי לפתח התערבויות טיפוליות חדשניות. ההתקדמות בתחום הביופילם מונעת על ידי ויזואליזציה, יחד עם מתודולוגיות כימות לצד גישות ביופיזיקליות.

זה כולל טכניקות כמו 3D OrbiSIMS שנותנות רזולוציה מרחבית עד לקנה מידה מיקרו וננומטרי. מחקר זה נועד ליצור מודל פולימיקרוביאלי השומר על רמת מורכבות, המייצגת את מה שנראה בטיפולים האנטיביוטיים בחולי CF. זה גם יאפשר תפוקה מוגברת, תפוקות רלוונטיות יותר ויכולת הסתגלות לזנים ותנאים אחרים.

פרוטוקול זה מציע סביבת בדיקה רלוונטית לפתוגנים של CF. הוא חזק ובעל תפוקה גבוהה יחסית. זה גם מקובל על נקודות קצה מרובות, המאפשר מחקרים מורכבים יותר להתבצע.

מחקר זה הראה כי סביבה רלוונטית ל-CF משתנה ורגישות מיקרוביאלית. בנוסף, סוג של פטריות הנוכחי יכול גם לשנות את הרגישות של Pseudomonas aeruginosa, וזה עשוי להיות רלוונטי קליני משמעותי. כדי להתחיל, קח תרביות של Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, ו Candida albicans גדל לשלב המעריכי.

באמצעות מיקרופיפטה, מעבירים מיליליטר אחד מכל תרבית נוזלית לצינור סטרילי נפרד של 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה את הצינורות במשך שתי דקות ב 8, 000 x גרם כדי pellet את החיידקים או פטריות. לאחר מכן, באמצעות פיפטה, שואפים את supernatant מכל צינור להשעות מחדש את הכדורים במיליליטר אחד של PBS.

לדלל את Pseudomonas aeruginosa, ואת Staphylococcus aureus תאים אחד עד 10 ב PBS. לאחר מכן באמצעות ספקטרופוטומטר, למדוד את הצפיפות האופטית באורך גל של 600 ננומטר. לאחר דילול הדגימות השטופות של קנדידה אלביקנס אחד עד 100 ב- PBS, פיפטה 10 מיקרוליטר מכל דגימה לשני חדרים נפרדים של המוציטומטר.

לאחר מכן התאם את דגימת קנדידה אלביקנס ל- 1 x 10 בחזקת שמונה CFU למיליליטר ב- PBS. כדי להכין את החיסון לתוספת לביופילם, התאימו את Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans ו-Staphylococcus aureus inoculum באמצעות PBS. עבור ביופילמים חד-מינים, פיפטה 10 מיקרוליטר של המיקרואורגניזם המדולל על מרכז דיסקת פוליקרבונט מונחת על האגר SCFM2 1.5% טכני בלוחות 6 בארות.

יש לדגור על הצלחת באופן סטטי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לפני הטיפול או השיבוש. עבור ביופילמים פולימיקרוביאליים, הוסף 10 מיקרוליטר של כל סטפילוקוקוס זהוב וקנדידה אלביקנס זה על גבי זה על אותו דיסק פוליקרבונט. יש לדגור על הדיסק המחוסן באופן סטטי למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר הדגירה באמצעות מלקחיים סטריליים, מעבירים את דיסקיות הפוליקרבונט ללוחות אגר טריים SCFM2 1.5%טכניים. הוסף 10 מיקרוליטר של 1 x 10 לעוצמה של ארבעה CFU לכל דילול מיליליטר של Pseudomonas aeruginosa על גבי Staphylococcus aureus שנקבע מראש, קנדידה אלביקנס ביופילם. דוגרים עוד 24 שעות בחום של 37 מעלות.

כדי להתחיל, קח ביופילם מושבת ממשק אוויר מוצק של Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus ו- Candida albicans. מוסיפים חרוזי קרמיקה בקוטר של 2.8 מ"מ לצלחת ו- UV חוצה את הצלחת. בעזרת מלקחיים מעוקרים בלהבה, מעבירים חמישה חרוזים קרמיים לצינור הומוגנייזר סטרילי של שני מיליליטר.

פיפטה מיליליטר אחד של PBS לתוך צינור הומוגניזציה של שני מיליליטר. מערבלים את הצינורות למשך 10 שניות לפחות או עד שהביופילם הוסר מדיסק הפוליקרבונט כפי שנקבע בבדיקה חזותית. לאחר ההסרה, להוציא את דיסק פוליקרבונט, ולאחר מכן מניחים את הצינורות עם החרוזים הומוגנייזר והיכו אותם פעמיים במשך 10 שניות בשישה מטרים לשנייה עם מרווח של עשר שניות בין פעימות.

כעת שפכו את הביופילם המשובש מצינור ההומוגנייזר לביג'ו של שבעה מיליליטר המכיל ארבעה מיליליטר PBS והתוצאה היא נפח סופי של חמישה מיליליטר. צנטריפוגה צינורות homogenizer ב 8, 000 x גרם במשך שתי דקות. לאחר מכן העבירו את הנוזל הנותר לביז'ו של שבעה מיליליטר כדי להבטיח שכל הנוזלים יועברו.

הוסף 200 מיקרוליטר של הביופילם המשובש לצלחת שחורה שקופה בעלת תחתית של 96 בארות, ולאחר מכן פיפטה 10 מיקרוליטר של תמיסת רסזורין 0.02% לכל באר. דגרו על הביופילם שטופל בראזורין בקורא צלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. יש לבצע רעידות מסלוליות כל 30 דקות למשך 10 שניות ב-200 סל"ד לפני ביצוע קריאות פלואורסצנטיות כלשהן.

למדוד את הפלואורסצנטיות באמצעות אורך גל עירור של 540 ננומטר ואורך גל פליטה של 590 ננומטר. ביופילמים חד-מינים דרשו ריכוזים נמוכים משמעותית של מרופנם וטוברמיצין כדי להשיג הרג של 50% בהשוואה לביופילמים רב-מיקרוביאליים עם עלייה של שני לוגים בריכוז האנטיביוטי הדרוש לאחרון. הישרדות Pseudomonas aeruginosa עלתה בביופילמים פולימיקרוביאליים עם 64 מיקרוגרם למיליליטר של טוברמיצין, ואילו מרופנם הראה ירידה בהישרדות בתנאים דומים.

בביופילמים חד-מינים, נצפה מתאם חזק בין הישרדותו של Pseudomonas aeruginosa לבין פעילותו המטבולית כאשר טופל הן במרופנם והן בטוברמיצין.