Name: מיקרופלואידיקה בהערכת תפקוד טסיות הדם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-08T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: חקור תפקוד טסיות דם באמצעות מכשירים מיקרופלואידיים ומשטחים ביולוגיים. שיטה זו משפרת הערכה פיזיולוגית ותורמת לטיפולי עירור המוסטטי בחולי טראומה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

כל המחקרים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיים. התקבל אישור מהמשרד להגנת המחקר האנושי באוניברסיטת פיטסבורג והתקבלה הסכמה מדעת של מתנדבים אנושיים בריאים.
1. הכנת מכשיר מיקרופלואידי
<ol>
	<li>כדי לייצר את החלק PDMS של המכשיר, להכין תבנית אב באמצעות פליז באמצעות מיקרו-עיבוד שבבי של בקרה נומרית ממוחשבת (CNC). הערה: בהתאם למידות הערוץ, ניתן להשתמש בטכניקות פוטוליתוגרפיה ליצירת תבנית אב. ההתקן המשמש בפרוטוקול זה כולל שמונה תעלות מיקרו-מכונות מקבילות ברוחב של כ-480 מיקרומטר, בגובה של 140 מיקרומטר בכניסה וביציאה של המכשיר, ובגובה של 40 מיקרומטר בהיצרות המכשיר, עם אורך רמפה מ/אל האזור הסטנוטי של כ-0.3 מ"מ. אורכי התעלה הם כ-6 מ"מ.</li>
	<li>לאחר שהושגה תבנית מאסטר, יוצקים את בסיס האלסטומר סיליקון (המתקבל מערכת האלסטומר) לצלחת שקילה. הוסיפו את חומר ריפוי הסיליקון (המתקבל מערכת האלסטומרים), המאפשר קישור צולב של שרשראות פולימר הסיליקון כדי להפוך את PDMS הנוזלי למוצק עמיד וגמיש, ביחס של 10:1 (סוכן בסיס) וערבבו היטב את התערובת.</li>
	<li>מניחים את התבנית לתוך צלחת פטרי ויוצקים את PDMS uncured על התבנית. הניחו את צלחת הפטרי בתוך מייבש ואקום למשך 30 דקות כדי להסיר בועות.</li>
	<li>סיים לרפא את PDMS בתבנית האב על ידי הכנסתו לתנור להגדיר 70 ° C למשך 90 דקות.</li>
	<li>לאחר ריפוי PDMS מלא, לחתוך את הגבס microfluidic באמצעות סכין גילוח או אזמל. חורי ניקוב בשולי התעלות (קוטר 1.5 מ"מ משני הצדדים).</li>
	<li>בעזרת סרט מעבדה, נקו את פני השטח של מגלשת זכוכית ואת הצד החרוט של הגבס המיקרופלואידי. השתמש באוויר דחוס לפי הצורך כדי להסיר את הפסולת שנותרה.</li>
	<li>הניחו את מגלשת הזכוכית ואת הגבס המיקרופלואידי עם הצד החרוט כלפי מעלה לתוך מנקה פלזמה. הפעילו את משאבת הוואקום, אטמו את התא והפעילו את שואב הפלזמה למצב גבוה. השאירו את המגלשה ואת PDMS בשואב הפלזמה למשך 30 שניות, ואז כבו את שואב הפלזמה והוציאו את שואב האבק.</li>
	<li>קשרו את הגבס והזכוכית שעברו ניקוי פלזמה יחד על ידי לחיצה עדינה יחד על הצדדים שהיו עם הפנים כלפי מעלה במנקה הפלזמה. לאחר מכן, הניחו את המכשיר המיקרופלואידי בתנור/פלטה חמה בטמפרטורה של 70°C למשך 10 דקות. הערה: אין להפעיל לחץ רב מדי בעת חיבור הגבס והזכוכית יחד, מכיוון שהדבר עלול להוביל לאובדן מורפולוגיית הערוץ.</li>
	<li>יש לשטוף כל תא עם 10-30 μL של אתנול 70% כדי לעקר ולאפשר למכשיר המיקרופלואידי להתייבש על פלטה חמה של 70°C. הערה: יש להכין מכשירים לפחות 24 שעות מראש, אך ניתן להכין אותם שבועות עד חודשים מראש. יש לאחסן את המכשירים במיכל אטום או בצלחת פטרי מכוסה בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>יום לפני הניסוי עם המכשיר microfluidic, לשטוף מחדש כל תא עם 10-30 μL של אתנול 70% כדי לעקר ולאפשר את המכשיר microfluidic להתייבש על פלטה 70 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>צפו את התא בריאגנט קולגן פיברילרי מסוג 1 סוסים (1 מ"ג/מ"ל), מדולל ב-0.9% NaCl ביחס נפחי של 1:5 דרך שקע ייעודי לכניסה ייעודית. ודא שהכיווניות נשמרת במהלך ניסוי. אחסנו את המכשיר בכלי סגור חם ולח כדי למנוע אידוי של הקולגן המצופה בתוך התעלה.</li>
	<li>לאחר שעה, יש לשטוף במי מלח חוצצים פוספט (PBS) כדי לשטוף את תמיסת הקולגן. סומקים בכיוון ההפוך לציפוי. כאשר המכשיר אינו בשימוש, יש לאחסן אותו שוב במיכל חם, לח וסגור.</li>
</ol>
2. הכנת דגימת דם
<ol>
	<li>קבל דגימת דם ציטרציה מלאה באמצעות venipuncture. לדגור על דם שלם ציטראטי עם תמיסת חסימת קולטן FC (1:600). הערה: דגימות דם מאוחסנות בטמפרטורת החדר לפני ובמהלך הניסוי.</li>
	<li>לדגור דם שלם ציטרציה עם פלואורסצנטיות מצומדת (באמצעות פלואורופור לבחירה) נוגדן CD41 (1:600). כתם במשך 30 דקות על נדנדה אגוזית.</li>
	<li>כבקרה חיובית לעיכוב טסיות, הוסף Ticagrelor, אנטגוניסט קולטן P2Y12 שנוצר מחדש בתמיסה של 30% w/v 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HP-β-CD) ב- PBS. הערה: יש להכין מלאי של Ticagrelor עד 6.4 mM ודילול נוסף של מלאי Ticagrelor בתמיסת HP-β-CD (30% HP-β-CD מומס ב-PBS) לפני הניסויים (מומלץ ריכוז מלאי של פי 1,000).</li>
	<li>דגרו על הדגימה הציטרטית עם טיקרלור (ריכוז סופי עד 6.4 מיקרומטר) למשך 30 דקות כדי לצפות בעיכוב טסיות.</li>
	<li>אם מערבבים את מוצר הדם עם דגימת הציטרציה, יש להכתים את מוצר הדם בתמיסת חסימת קולטן FC (1:600) ובנוגדן CD41 מצומד פלואורסצנטי (באמצעות פלואורופור נפרד ומובהק לדגימה המצטרת) CD41 (1:600).<ol>
		<li>מערבבים מקבילה נפחית של יחידות המוצר transfused עם הדגימה ציטרציה. לדוגמה, כדי לדמות 2 יחידות של מוצרי טסיות דם שהועתקו לאדם מדמם (כ-250 מ"ל למוצר לנפח דם כולל של 5,000 מ"ל), ערבבו 100 מיקרוליטר של מוצר דם לתוך 1,000 מיקרוליטר של דגימת דם ציטרת.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>מיד לפני הניסוי, סננו את דגימת הדם דרך מסנן 40 מיקרומטר לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי של 1.5 מ"ל.</li>
</ol>
3. בדיקת תפקוד טסיות תחת זרימה (שיטה 1)
<ol>
	<li>הפעל את המיקרוסקופ ואת התוכנה המשויכת.</li>
	<li>הגדר רמת משאבת מזרק נסיגה עם שלב המיקרוסקופ. התאם את ההגדרות במשאבת המזרק.<ol>
		<li>חשב קצב זרימה נפחי (Q) עבור קצב גזירה ממוצע רצוי (γ) של 3,500 s-1 באזור הסטנוטי של התעלה באמצעות משוואות (1) ו- (2)21. 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67214/67214eq01.jpg" style="margin: auto;">(1) 
		<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67214/67214eq02v2.jpg" style="margin: auto;">(2) כאשר A הוא שטח החתך של התעלה, P הוא ההיקף הרטוב, λ הוא גורם הצורה, b הוא הצד הקצר של המלבן (גובה), ו-a הוא הצד הארוך של המלבן (רוחב). הערה: הערך של 3,500 s-1 נבחר עקב גזירה קריטית של VWF ונמצא במשטר העורקים 7,22,23.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>הניחו את המכשיר המיקרופלואידי על במת המיקרוסקופ. הדביקו את קצוות המכשיר המיקרופלואידי לבמה כדי למנוע תנועה. ודא שהשקע פונה לחלק האחורי של המיקרוסקופ.</li>
	<li>חבר קצה אחד של צינור זיהוי בגודל 1/16 אינץ' (באורך של כ-30 ס"מ) למחבר מרפק ואת הקצה השני למזרק בנפח 10 מ"ל עם מחבר מזהה בגודל 1/16 אינץ'.</li>
	<li>ממלאים את המזרק ב-PBS סטרילי ומחברים אותו למשאבת המזרק.</li>
	<li>הכנס את מחבר המרפק לשקע המכשיר.</li>
	<li>הכינו קווי כניסה באורך של כ-10 ס"מ כאשר מחבר המרפק בקצה אחד והחתך הזוויתי בקצה השני.</li>
	<li>חבר את מחבר מרפק הכניסה לכניסת ההתקן.</li>
	<li>מקם את קו הכניסה לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה פסולת על מחזיק זוויתי.</li>
	<li>השתמש במטרה 10x עבור מידות ערוץ ברוחב של כ- 500 מיקרומטר והתמקד בקצוות הערוץ של ההתקן המיקרופלואידי.</li>
	<li>מקדמים את הקווים עם PBS ומנקים את התעלה מכל PDMS/פסולת על ידי קידום משאבת המזרק באופן ידני. הקפד לבדוק ליד הכניסה והשקע של הערוץ.</li>
	<li>פתח את הגדרות לכידת התמונה שנשמרו או צור הליך לכידת תמונה עבור תמונות מסדרות זמן שצולמו כל 1-2 שניות עם ערוץ שדה בהיר ותעלות פלואורסצנטיות המתאימות לנוגדנים הפלואורסצנטיים CD41 המשמשים בדגימת הדם.</li>
	<li>קבל את דגימת הדם הציטר המסונן וערבב על ידי pipeting למעלה ולמטה ממש לפני הניסוי. מניחים את הדגימה על מחזיק מיקרוצנטריפוגה זוויתית.</li>
	<li>מקם את קו הכניסה בדגימה.</li>
	<li>התחל להקליט את לכידת התמונה.</li>
	<li>לאט, למשוך את המזרק כדי למלא את נפח מת בצינורית. ברגע שהדם מגיע לערוץ, לחץ מיד על הפעל על משאבת המזרק כדי לחדש את הזרימה בקצב הגזירה הרצוי.</li>
	<li>התאם את המיקוד במידת הצורך.</li>
	<li>הפעל את הניסוי עד שהטסיות הסתירו לחלוטין את האזור הסטנוטי של המכשיר המיקרופלואידי או עד לנקודת סיום ניסיונית (כלומר, 10 דקות).</li>
	<li>ודא שצינורית הכניסה שקועה בדגימת הדם למשך הניסוי.</li>
	<li>לאחר השלמת הניסוי, עצור את לכידת התמונה ועצור את משאבת המזרק. שמור את לכידת התמונה.</li>
	<li>הסר את מחבר מרפק הכניסה ורוקן את תכולת הצינור לחרוט פסולת. רוקנו גם את תכולת המזרקים וקווי היציאה לחרוטיות פסולת.</li>
	<li>החלף את מחברי הכניסה והיציאה ואת הצינורות לפי הצורך עבור הדגימות הבאות.</li>
</ol>
4. בדיקת תפקוד טסיות בזרימה עם דגימות בנפח נמוך (מתחת ל-1 מ"ל) (שיטה 2)
<ol>
	<li>חזור על שלבים 1.1 עד 1.4 כמפורט לעיל.</li>
	<li>ניקבו פתח בקוטר 1.5 מ"מ ובכניסה בקוטר 3 מ"מ בשולי התעלות.</li>
	<li>חזור על שלבים 1.6 עד 3.6 כמפורט לעיל.</li>
	<li>השתמש במטרה 10x עבור מידות ערוץ ברוחב של כ- 500 מיקרומטר והתמקד בקצוות הערוץ של ההתקן המיקרופלואידי.</li>
	<li>נקו את התעלה מכל PDMS/פסולת על ידי הקדמת משאבת המזרק באופן ידני וניקוי נוזל גישה באמצעות מגבון מעבדה. הסר את כל הלכלוך עם סרט מעבדה בחלק העליון של המכשיר microfluidic.</li>
	<li>קדם ידנית את המשאבה כדי למלא את מאגר הכניסה 3 מ"מ עם PBS.</li>
	<li>פתח את הגדרות לכידת התמונה שנשמרו או צור הליך לכידת תמונה עבור תמונות מסדרות זמן שצולמו כל 1-2 שניות עם ערוץ שדה בהיר ותעלות פלואורסצנטיות המתאימות לנוגדנים הפלואורסצנטיים CD41 המשמשים בדגימת הדם.</li>
	<li>התחל את המשיכה במשאבת המזרק (ידנית או במהירות מוגדרת) וברגע ש- PBS מתקדם לתוך התעלה וקו המילוי במאגר יורד, השהה את המשיכה במשאבה.</li>
	<li>הסר עודף PBS מהמאגר עם פיפטה.</li>
	<li>התחל את לכידת התמונה.</li>
	<li>פיפטה את דגימת הדם לתוך המאגר (כ 40 μL) ומיד להתחיל מזרק נסיגה. ודא שהזרימה מתחילה. הערה: אם מנוע משאבת המזרק לנסיגה לא היה דרוך בשלב 4.8, הזרימה לא תתחיל מיד, ויש לחזור על הניסוי.</li>
	<li>מלאו מחדש את מאגר הדם למשך הניסוי, כדי לוודא שלא נכנסים כיסי אוויר לתעלה.</li>
	<li>הפעל את הניסוי עד שהטסיות הסתירו לחלוטין את האזור הסטנוטי של המכשיר המיקרופלואידי או עד לנקודת סיום ניסיונית (כלומר, 10 דקות).</li>
	<li>לאחר השלמת הניסוי, הפסק את לכידת התמונה ועצור את משאבת המזרק. שמור את לכידת התמונה.</li>
	<li>הסר עודפי דם במאגר על ידי pipetting. רוקנו את תכולת צינור הגמילה לתוך צינור חרוטי פסולת.</li>
	<li>החלף את המחברים והצנרת לפי הצורך עבור הדגימות הבאות.</li>
</ol>
5. טיהור
<ol>
	<li>נקו את קווי הכניסה והיציאה של הדם על ידי שטיפה לתמיסת אקונומיקה 10%.</li>
	<li>אם נעשה שימוש בכל התעלות במכשיר המיקרופלואידי, השליכו את המכשיר במיכל הפסולת הביולוגית המסוכנת של שארפ. הערה: יש להשליך את כל הפסולת הביולוגית לפסולת מסוכנת ביולוגית כראוי.</li>
</ol>
6. ניתוח תמונות
<ol>
	<li>ייצא את התמונות מניסויים קינטיים באמצעות תוכנה על ידי לחיצה על קובץ | ייצוא/ייבוא | ייצוא.</li>
	<li>בחר את הפרמטרים הבאים: סוג קובץ: Tagged Image File Format (TIFF); דחיסה: LZW; סמן את הנתונים המקוריים ואת Shift Pixel; בטל את הסימון של האפשרות החל עקומת תצוגה וצבע ערוץ; סמן ' הגדר תת-ערכה (אזור, אזור מלבן', ובחר באזור הערוץ עם מדידת רוחב וגובה לשימור בין תנאים). ייצא לתיקיה הרצויה וסמן את צור תיקיה.</li>
	<li>שים לב לערכי הניסוי הבאים בתוכנה: התחל מסגרת כאשר הדם נכנס לערוץ; קצב פריימים (מידע, סדרת זמן).</li>
	<li>למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת המנורמלת של כל מסגרת בניסוי באמצעות קוד Matlab שסופק כקובץ משלים 1, תוך שינוי הקלטים הבאים עבור כל ניסוי: מסגרת התחלה/מסגרת סיום בהתבסס על אורך הניסוי (ודא שאורך הניסוי נשמר בין התנאים); שם הניסוי/שם התיקייה; חיתוך פרמטרים X, Y, H ו- W. הפעל את הקוד פעם אחת עבור ערוץ הפלואורסצנטי של טסיות הנמען ופעם אחת עבור ערוץ הפלואורסצנטי של טסיות המוצר. דווח על ערכי MFI מנורמלים (עמודה 2) וערכי AUC מנורמלים (מנורמלים למסגרת התחלה). הפחת את ערך אורך הניסוי מערך AUC המנורמל.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>פלטפורמה להערכת תפקוד טסיות בטראומה ובעירוי

<ol><li>Moore, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trauma-induced+coagulopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Dis+Primers%22%5BJournal%5D)">Trauma-induced coagulopathy.</a> Nat Rev Dis Primers. 7 (1), 1-23 (2021).</li>
<li>Vulliamy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+platelet+behavior+after+major+trauma%3A+adaptive+or+maladaptive%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Alterations in platelet behavior after major trauma: adaptive or maladaptive.</a> Platelets. 32 (3), 295-304 (2021).</li>
<li>Starr, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+injury+and+shock+driven+effects+on+ex+vivo+platelet+aggregometry%3A+A+cautionary+tale+of+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22J+Trauma+Acute+Care+Surg%22%5BJournal%5D)">Identification of injury and shock driven effects on ex vivo platelet aggregometry: A cautionary tale of phenotyping.</a> J Trauma Acute Care Surg. 89 (1), 20-28 (2020).</li>
<li>Kutcher, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+platelet+dysfunction+after+trauma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Trauma+Acute+Care+Surg%22%5BJournal%5D)">Characterization of platelet dysfunction after trauma.</a> J Trauma Acute Care Surg. 73 (1), 13-19 (2012).</li>
<li>Yakusheva, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traumatic+vessel+injuries+initiating+hemostasis+generate+high+shear+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Adv%22%5BJournal%5D)">Traumatic vessel injuries initiating hemostasis generate high shear conditions.</a> Blood Adv. 6 (16), 4834-4846 (2022).</li>
<li>Colace, T. V., Diamond, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+von+Willebrand+factor+elongation+and+fiber+formation+on+collagen+during+acute+whole+blood+exposure+to+pathological+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct observation of von Willebrand factor elongation and fiber formation on collagen during acute whole blood exposure to pathological flow.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (1), 105-113 (2013).</li>
<li>Schneider, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear-induced+unfolding+triggers+adhesion+of+von+Willebrand+factor+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Shear-induced unfolding triggers adhesion of von Willebrand factor fibers.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (19), 7899-7903 (2007).</li>
<li>Savage, B., Almus-Jacobs, F., Ruggeri, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+synergy+of+multiple+substrate-receptor+interactions+in+platelet+thrombus+formation+under+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Specific synergy of multiple substrate-receptor interactions in platelet thrombus formation under flow.</a> Cell. 94 (5), 657-666 (1998).</li>
<li>Savage, B., Saldívar, E., Ruggeri, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+platelet+adhesion+by+arrest+onto+fibrinogen+or+translocation+on+von+Willebrand+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Initiation of platelet adhesion by arrest onto fibrinogen or translocation on von Willebrand factor.</a> Cell. 84 (2), 289-297 (1996).</li>
<li>Ruggeri, Z. M., Mendolicchio, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+mechanisms+in+platelet+function%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Adhesion mechanisms in platelet function.</a> Circ Res. 100 (12), 1673-1685 (2007).</li>
<li>Chernysh, I. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distinctive+structure+and+composition+of+arterial+and+venous+thrombi+and+pulmonary+emboli%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The distinctive structure and composition of arterial and venous thrombi and pulmonary emboli.</a> Sci Rep. 10 (1), 5112(2020).</li>
<li>Holcomb, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfusion+of+plasma%2C+platelets%2C+and+red+blood+cells+in+a+1%3A1%3A1+vs+a+1%3A1%3A2+ratio+and+mortality+in+patients+with+severe+trauma%3A+The+PROPPR+randomized+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Transfusion of plasma, platelets, and red blood cells in a 1:1:1 vs a 1:1:2 ratio and mortality in patients with severe trauma: The PROPPR randomized clinical trial.</a> JAMA. 313 (5), 471-482 (2015).</li>
<li>Shea, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doing+more+with+less%3A+low-titer+group+O+whole+blood+resulted+in+less+total+transfusions+and+an+independent+association+with+survival+in+adults+with+severe+traumatic+hemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Doing more with less: low-titer group O whole blood resulted in less total transfusions and an independent association with survival in adults with severe traumatic hemorrhage.</a> J Thromb Haemost. 22 (1), 140-151 (2024).</li>
<li>Cardenas, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+transfusions+improve+hemostasis+and+survival+in+a+substudy+of+the+prospective%2C+randomized+PROPPR+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Adv%22%5BJournal%5D)">Platelet transfusions improve hemostasis and survival in a substudy of the prospective, randomized PROPPR trial.</a> Blood Adv. 2 (14), 1696-1704 (2018).</li>
<li>Sperry, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prehospital+plasma+during+air+medical+transport+in+trauma+patients+at+risk+for+hemorrhagic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Prehospital plasma during air medical transport in trauma patients at risk for hemorrhagic shock.</a> N Engl J Med. 379 (4), 315-326 (2018).</li>
<li>Meyer, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Every+minute+counts%3A+Time+to+delivery+of+initial+massive+transfusion+cooler+and+its+impact+on+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22J+Trauma+Acute+Care+Surg%22%5BJournal%5D)">Every minute counts: Time to delivery of initial massive transfusion cooler and its impact on mortality.</a> J Trauma Acute Care Surg. 83 (1), 19-24 (2017).</li>
<li>Shea, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold-stored+platelet+hemostatic+capacity+is+maintained+for+three+weeks+of+storage+and+associated+with+taurine+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Cold-stored platelet hemostatic capacity is maintained for three weeks of storage and associated with taurine metabolism.</a> J Thromb Haemost. 22 (4), 1154-1166 (2024).</li>
<li>Sperry, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+cold+stored+platelet+transfusion+following+severe+injury%3A+a+randomized+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg%22%5BJournal%5D)">Early cold stored platelet transfusion following severe injury: a randomized clinical trial.</a> Ann Surg. 280 (2), 212-221 (2024).</li>
<li>Schoeman, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+model+of+hemostasis+sensitive+to+platelet+function+and+coagulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">A microfluidic model of hemostasis sensitive to platelet function and coagulation.</a> Cell Mol Bioeng. 10 (1), 3-15 (2017).</li>
<li>Sakurai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microengineered+vascularized+bleeding+model+that+integrates+the+principal+components+of+hemostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A microengineered vascularized bleeding model that integrates the principal components of hemostasis.</a> Nat Commun. 9 (1), 509(2018).</li>
<li>Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+non-Newtonian+flow+behavior+in+ducts+of+unusual+cross+section%5BTitle%5D)+AND+%22Ind+Eng+Chem+Fundamentals%22%5BJournal%5D)">Predicting non-Newtonian flow behavior in ducts of unusual cross section.</a> Ind Eng Chem Fundamentals. 11 (4), 524-528 (1972).</li>
<li>Kim, D., Bresette, C., Liu, Z., Ku, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occlusive+thrombosis+in+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22APL+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Occlusive thrombosis in arteries.</a> APL Bioeng. 3 (4), 041502(2019).</li>
<li>Kroll, M. H., Hellums, J. D., McIntire, L. V., Schafer, A. I., Moake, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets+and+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Platelets and shear stress.</a> Blood. 88 (5), 1525-1541 (1996).</li>
<li>Sorrells, M. G., Neeves, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+and+absorption+of+collagen+peptides+to+polydimethlysiloxane+and+its+influence+on+platelet+adhesion+flow+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">Adsorption and absorption of collagen peptides to polydimethlysiloxane and its influence on platelet adhesion flow assays.</a> Micromachines. 11 (1), 62(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer</td><td>Zeiss</td><td>491917-0001-000</td><td></td></tr><tr><td>בל-ארט שומר חלל מייבש ואקום</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>08-594-15A</td><td></td></tr><tr><td>פישרברנד איזוטמפ בוחש פלטה דיגיטלית</td><td>פישר</td><td>FB30786161</td><td></td></tr><tr><td>מיקסר נוטות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>88-861-043</td><td></td></tr><tr><td>OHAUS סקאוט איזון סולם</td><td>Uline</td><td>H-5852</td><td></td></tr><tr><td>תנור</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>15-103-0520</td><td></td></tr><tr><td>מנקה פלזמה</td><td>Harrick</td><td>PDC-32G (115V)</td><td></td></tr> <tr><td>משאבת מזרק (PHD ULTRA CP, I/W ניתן לתכנות)</td> <td>הרווארד מכשירים</td><td>883015</td><td></td></tr><tr><td>Zen 3.4</td><td>Zeiss</td><td>Blue Edition</td><td>תוכנה</td></tr><tr><td><חזק>חומר</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1/16 אינץ' מזהה - מחברי מרפק דוקרניים</td><td>Qosina</td><td>11691</td><td></td></tr><tr><td>מזרק 10 מ"ל</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-955-459</td><td></td></tr><tr><td>2-הידרוקסיפרופיל-ובטא;-ציקלודקסטרין</td><td>קיימן כימיקלים</td><td>16169</td><td>30% מומס במסנני מלח חוצץ פוספט</td></tr><tr><td>40 מיקרון</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NC1469671 נוגדן CD41</td><td>Novus Biologicals</td><td>&nbsp; NB100-2614</td><td>יחס של 1:600 בדם מלא</td></tr><tr><td>Chrono-Par מגיב קולגן</td><td>Chrono Log Corporation</td><td>385</td><td>יחס של 1:5 ב-0.9%</td></tr><tr><td>מיקרוסקופיה אלקטרונית מלוחה מדעי מילטקס ביופסיה אגרוף עם בוכנה, 3.0 מ"מ</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0856599</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge SafeLock Tubes, 1.5 מ"ל</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-402-25</td><td></td></tr><tr><td>Essendant 121oz. קלורוקס קוטל חיידקים אקונומיקה</td><td>פישר מדעי</td><td>50371500</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>07-678-005</td><td>70%</td></tr> <tr><td>פלקון בטיחות אבק כבוי DPSXLRCP גז דחוס</td><td>סופרה</td><td>1381978</td><td></td></tr><tr><td>אנושי TruStain Biolegend</td><td></td><td>422302</td><td>יחס של 1:600 בדם מלא</td></tr><tr><td>LevGo smartSpatula מרית פוליפרופילן חד פעמית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>18-001-017</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-550-A3</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>אזמל בטיחות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>22-079-718</td><td></td></tr><tr><td>מלח</td><td>Millipore</td><td>567442</td><td>0.90%</td></tr> <tr><td>סירות שקילה פוליסטירן Sartorius פישר</td><td>סיינטיפיק</td><td>13-735-744</td><td></td></tr><tr><td>תלושי כיסוי Superslip - Superslip מס' 1.5</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541-055</td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184 ערכת אלסטומר סיליקון</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9285739</td><td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td></tr> <tr><td>Ticagrelor</td><td>Cayman Chemicals</td><td>15425</td><td></td></tr><tr><td>Tygon PVC צינורות שקופים 1/16 אינץ' ID, 1/8 אינץ' OD, אורך 50 רגל</td><td>McMaster-Carr</td><td>6516T11</td><td></td></tr><tr><td>פליז 360 ניתן לעיבוד אולטרה בר</td><td>מקמאסטר-קאר</td><td>8954K721</td><td>לייצור עובש מאסטר</td></tr><tr><td>ואקוטיינרים</td><td>BD</td><td>363083</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר דיוק עולמי אגרוף ביופסיה לשימוש חוזר, 1.5 מ"מ</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>NC1215626</td><td></td></tr></tbody></table>

מיקרופלואידיקה בהערכת תפקוד טסיות הדם

Microfluidics in Assessing Platelet Function

ניסויים מיקרופלואידים בעקבות השימוש בשיטה זו אמורים להראות היווצרות תרומבי עשירה בטסיות באזור ההיצרות של ערוץ הזרימה (איור 1). איור 1A מדגים תוצאות מייצגות שבהן טסיות דם תפקודיות יצרו פקקת באזור הסטנוטי של התעלה כדי לחסום את זרימת הדם דרך הערוץ. עקומות של עוצמה פלואורסצנטית ממוצעת (MFI) של תמונות קינטיות שצולמו במשך הניסוי מדגימות פיגור, צמיחה ושלב מישורי של שילוב טסיות בפקקת הגדלה (איור 2A,C). הגדלת הריכוזים של אנטגוניסט P2Y12, Ticagrelor, מפחיתה את ה-MFI של טסיות הדם כמו גם את השטח המחושב מתחת לעקומה (AUC) של עקומות MFI (איור 2B,D). יש צורך בזמני דגירה ארוכים יותר (30 דקות לעומת 5 דקות) כדי לצפות בתפקוד לקוי בולט של טסיות הדם, בהתאם ליחס מנה-תגובה בולט יותר תוך שימוש באגרגומטריה של עכבת דם מלאה לאחר דגירה של 30 דקות Ticagrelor בהשוואה לדגירה של 5 דקות (איור משלים S1). בתנאי רכב שונים, השפעות תלויות זמן דומות של עיכוב P2Y12 נצפו במודל המיקרופלואידי (איור משלים S2).
הדמיה של שתי אוכלוסיות טסיות בשיטת החייאה המוסטטית מדומה מדגימה את השילוב של שתי אוכלוסיות טסיות הדם בתוך פקקת (איור 3A). ניתן לכמת את השילוב של שתי אוכלוסיות טסיות הדם באות הפלואורסצנטי המתאים להן באופן קינטי לאורך משך הניסוי באמצעות מדידות MFI (איור 3B). שיפועים תלולים יותר בשלב הצמיחה, כמו גם מדידות MFI מוגברות של נקודות קצה, מדגימים פונקציונליות טסיות מוגברת ופוטנציאל המוסטטי, אשר ניתן לראות בכימות של טסיות הדם כאשר דגימת הדם נגרמה עם תפקוד לקוי של טסיות הדם באמצעות עיכוב P2Y12, ולאחר מכן, החייאה המדומה על ידי ערבוב דם שלם אוטולוגי טרי ביחס נפחי של 1:10 המוכתם בפלואורופור טסיות מובהק. עם ערבוב אוטולוגי של דם שלם, יותר טסיות שולבו מהמוצר המדומה בהשוואה למוצר טסיות אפרזיס ביום אחסון בטמפרטורת החדר ביום 5, אשר הראה שילוב מוצר מינימלי בפקקת היוצרת. ערבוב מוצרי טסיות בטמפרטורת החדר ביום 5 הראה גם שילוב טסיות נמוך יותר בהשוואה לערבוב עם דם מלא אוטולוגי טרי (איור 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67214/67214fig01.jpg"> 
איור 1: ייצוג של בדיקת תפקודי טסיות באמצעות מיקרופלואידיקה. (A) מוצג מערך ניסויי מיקרופלואידי סכמטי לבדיקת תפקודי טסיות באמצעות דגימות דם בנפח נמוך, כולל משאבת מזרק נסיגה המושכת דם דרך תא זרימה סטנוטי, ומאפשרת לכידת תמונה בזמן אמת. (B) מוצג מבט צדדי על תא זרימה סטנוטי, כולל משטח מצופה קולגן שעליו טסיות הדם נצמדות, מופעלות ומצטברות, וכתוצאה מכך פקקת הולכת וגדלה באזור הסטנוטי. (C) לכידת תמונה בזמן אמת של דגימת דם ציטרלית תחת זרימה בתעלה מיקרופלואידית סטנוטית (3,500 s-1) ופקקת הולכת וגדלה שנוצרה מעל 300 שניות. פסי קנה מידה = 200 מיקרומטר (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67214/67214fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67214/67214fig02.jpg"> 
איור 2: שינויים מופחתים בקיפול MFI טסיות ובשטח מתחת לעקומה לאחר 30 דקות דגירה עם אנטגוניסט P2Y12 Ticagrelor. (A) דגירה עם אנטגוניסט P2Y12 במשך 5 דקות בלבד מדגימה שלבי השהיה מעט מורחבים של עקומות MFI ו-(B) ירידות קלות ב-MFI AUC. (C) דגירה במשך 30 דקות עם אנטגוניסט P2Y12 גורמת לשלבי השהיה מורחבים ולערכי MFI מופחתים של נקודות קצה, כמו גם (D) תפקוד לקוי חזק יותר שהודגם באמצעות MFI AUC. נקודות נתונים בודדות מייצגות שכפולים ביולוגיים ומוצגת סטיית תקן ± ממוצעת. קיצורים: MFI = עוצמת פלואורסצנטיות ממוצעת; AUC = שטח מתחת לעקומה; HP-β-CD = 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67214/67214fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67214/67214fig03.jpg"> 
איור 3: ערבוב של תוצרי דם עם עיכוב P2Y12 קוגולופתי בדגימת הנמען, המדמה תפקוד לקוי של טסיות הדם של המטופל, בתא המיקרופלואידי. (A) יחידת טסיות אפרזיס (פלזמה, יום אחסון 7) (CD41 בציאן) מעורבבת ביחס של 1:10 עם דם ציטרטי מודגר מראש עם 0.8 מיקרומטר טיקרלור למשך 30 דקות (CD41 באדום). (B) עקומות עוצמת פלואורסצנטיות מנורמלות מייצגות של דגימת הדם המקבלת יחידת טסיות אפרזיס (יום אחסון 5) או דם שלם טרי אוטולוגי (יחס של 1:10) יחד עם קינטיקה של טסיות הדם המקבלות לאורך זמן. דם ציטרלי מושתל הודגר מראש עם 0.8 מיקרומטר Ticagrelor במשך 30 דקות לפני ערבוב עם מוצרי דם. (C) תמונה מייצגת של ערימת z ממכשיר שעבר שינוי המחוברת למכסה עבור מיקרוסקופ קונפוקלי. מוצר טסיות אפרזיס עורבב עם דגימת דם טרומבוציטופנית ביחס נפחי של 1:5 (מוצר:דם) בנוסף לנוגדן גורם פון וילברנד (1:600). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67214/67214fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
קובץ משלים 1: קוד Matlab לניתוח תמונות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67214/ImageReader_Jove_Supplemental.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
איור משלים S1: עכבת דם שלמה אגרגומטריה תלות בזמן של עיכוב P2Y12 עם Ticagrelor. דגירה במשך 30 דקות מביאה ליחס מנה-תגובה בולט יותר בהשוואה ל-5 דקות. פתרונות רכב ותרופות נוצלו ב -0.1% v/v. נקודות נתונים בודדות מייצגות שכפולים ביולוגיים ומוצגת סטיית תקן ± ממוצעת. קיצורים: AUC = שטח מתחת לעקומה; HP-β-CD = 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67214/67214_Supp%20Fig%201.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
איור משלים S2: עיכוב P2Y12 תלוי זמן עם Ticagrelor במודל מיקרופלואידי של תפקוד טסיות. עקומות MFI מייצגות וערכי שטח מתחת לעקומה עבור שכפולים טכניים מתורם בריא יחיד מוצגים עם רכב אתנול (1% v/v) המשמש למסיסות תרופות. קיצורים: MFI = עוצמת פלואורסצנטיות ממוצעת; AUC = שטח מתחת לעקומה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67214/67214_Supp%20Fig%202.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

Microfluidics incorporate physiologically relevant substrates and flows that mimic the vasculature and are, therefore, a valuable tool for studying ...

microfluidics-in-assessing-platelet-function

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

מפל הידבקות טסיות מתקיים בנוכחות זרימה גזירה, גורם לא היוו ב קונבנציונאלי (סטטי) היטב הצלחת מבחני. מאמר זה מדווח על assay טסיות צבירה תוך שימוש בתבנית microfluidic צלחת היטב לחקות פיסיולוגי תנאי הזרימה גזירה.

הדבקה צבירת טסיות דם תחת זרימה באמצעות תאים תזרים Microfluidic

עירוי טסיות דם והמוסטזיס עוצבו באמצעות בנייה מחדש של דם ותאי זרימה מיקרופלואידיים כדי לחקור את תפקוד טסיות הדם. הנתונים מדגימים את ההשלכות של נגע אגירת טסיות דם על המוסטזיס, במבחנה.

Microfluidic זרימה צ&#39;יימברס שימוש מחדש דם למודל המוסטאסיס ואת טסיות עירוי<em&gt; במבחנה</em

מאמר זה מתאר מודל ניסיוני של המוסטאסיס המודד פונקציה וקרישה טסיות זמנית. טסיות קרינת הפיברין נמדדות בזמן אמת, וקצב הידבקות טסיות דם, קרישת שיעור, והתחלה של קרישה נחושה. המודל משמש כדי לקבוע מאפיינים טסיות procoagulant תחת זרם מתרכז עבור עירוי.

מודל לשכת תזרים Microfluidic עבור עירוי טסיות המוסטאסיס מודד הפקדת טסיות והיווצרות הפיברין בזמן אמת

אנו מתארים שיטה פשוטה עבור בידוד של טסיות נשטף מן הדם האנושי ואחריו מדידות צימות טסיות דם הנגרמת אגוניסט ידי turbidimetry. כדוגמא אנחנו מיישמים שיטה זו לחקר התגובה אגרגציה של טסיות אדם קולגן לאחר דגירה מראש עם מעכב ערוץ Pannexin1 בריליאנט בלו FCF.

Turbidimetry על אדם שנשטף טסיות: השפעת מעכבי Pannexin1 FCF הכחול המבריק על צבירה מושרת קולגן

עבודה זו מתארת ​​שיטה מבוססת מיקרוסקופיה פלואורסצנטי לחקר הדבקה טסיות, התפשטות, והפרשה תחת זרימה. פלטפורמה רב-תכליתית זו מאפשרת חקירת תפקוד טסיות למחקר מכניסטי על פקקת והמוסטאזיס.

Live-cell הדמיה של degranulation טסיות והפרשה תחת זרימה

אנו מציגים מודל מחלת כלי דם במבחנה לחקור אינטראקציות דם שלם עם אנדותל נגזר המטופל. מערכת זו מאפשרת לחקור תכונות טרומבוגניות של תאי אנדותל ראשוניים בנסיבות שונות. השיטה מתאימה במיוחד להעריך את הטיפול situ thrombogenicity ונוגדי קרישה בשלבים שונים של קרישה.

במודל מחלה מיקרופלוידיקית במבחנה ללמוד אינטראקציות דם-אנדותל שלם ודינמיקת קריש דם בזמן אמת

פרוטוקול לבדיקה פונקציונלית חדשה של טסיות דינמיות מרובות פרמטרים באמצעות חיישן ביולוגי קיבולי מוצג כאן. גישה זו, שתוכננה בתוך מיקרו-סביבה קשיחה למחצה כדי לשפר את הרלוונטיות הפיזיולוגית, מספקת שלושה פרמטרי פלט הרגישים לספירת טסיות הדם, עוצמות הגירוי ומסלולי ההפעלה.

הערכת תפקוד טסיות דינמית רב-פרמטרית באמצעות חיישן ביולוגי קיבולי

היווצרות טסיות דם מעודדות נקשרה עם סיכון מוגבר לפקקת. מוצג כאן פרוטוקול מדויק לבידוד טסיות דם שטופות מדם אדם, שנועד לכמת את החשיפה של פוספטידיל-סרין ושחרור מיקרו-שלפוחית, שהם מאפיינים ייחודיים של טסיות מעודדות.

אפיון טסיות מעודדות קרישה על ידי מדידת חשיפה לפוספטידיל-סרין ושחרור מיקרו-שלפוחיות מטסיות אדם מטוהרות

עבודה זו מתארת בדיקה מיקרופלואידית המשתמשת במאמץ גזירה כדי להפעיל יצירת קרישי דם בדם ומאפיינת את הקריק באמצעות ממדים מרובים של קריאה. הבדיקה יכולה למדוד את הנטייה הפרותרומבוטית של דגימות דם, ולכן היא שימושית באבחון מחלות, גילוי תרופות, וכן במחקרים מכניים בסיסיים הקשורים לטרומבוזיס.

מבחן פרופיל תרומבוס: פלטפורמה מבוססת מיקרופלואידיקה לאפיון מקיף של תרומבוגנזה ביומכנית

הליך פולשני להערכת תפקוד האנדותל הוא הוכיח באמצעות Endo-PAT 2000.

הערכת תפקוד האנדותל vasodilator עם 2000 Endo-PAT

חקור תפקוד טסיות דם באמצעות מכשירים מיקרופלואידיים ומשטחים ביולוגיים. שיטה זו משפרת הערכה פיזיולוגית ותורמת לטיפולי עירור המוסטטי בחולי טראומה.

מיקרופלואידיקה בהערכת תפקוד טסיות הדם

גלה סרטונים נוספים