הגדרת מיון מוצלח לבידוד שלפוחית חוץ-תאית

אז המוקד העיקרי של המחקר שלנו הוא לחקור תאי סטרומה מזנכימליים, שלפוחית חוץ-תאית להתחדשות רקמות. נושא ומטרה של המחקר שלנו הוא לתרגם את הגישה נטולת התאים ליישום קליני לצד טיפולים תאיים. האפיון הוא קריטי וכיום קשה מאוד לקבל שלפוחית טהורה לאפיון עמוק מכיוון שאין פרוטוקולים להשגת טוהר גבוה.

לכן, רצינו ליישם את טכנולוגיית מיון התאים כדי ללמוד, לאפיין, ובסופו של דבר, לתרגם לפרקטיקה קלינית את הגישה החדשה הזו המבוססת על שלפוחית חוץ-תאית, הפרוטוקול שלנו מורכב מארבעה חלקים, הכנת הדגימה, אפיון שלפוחיות חוץ-תאיות, מיון וניתוח לאחר מיון. נתמקד בחלק המיון. כפי שתראה, חלק מהפקודות יבוצעו בתוכנת המיון ואילו אחרות במסך המגע.

הפרוטוקול שלנו מציע יתרונות משמעותיים בהשוואה לשיטות אחרות של הפרדת EV. ראשית, השימוש ב-70 זרבובית מיקרו ב-35 psi שומר על שלמות המיון לאחר EV. לאחר מכן ניתן לבודד אוכלוסייה ספציפית של EV ואז לבסוף, המכשיר מאפשר לשמור הגדרת מיון על מנת להפוך את התהליך לניתן לשחזור.

במעבדה שלנו, אנו עובדים על פיתוח פאנל רב צבעוני חדש לניתוח שלפוחיות חוץ-תאיות. בפרט, אנו מתמקדים במערך המכשירים ובחקר הפלואורוכרומים. אנו מאמינים כי היכולת לזהות ולהפריד אוכלוסיות נדירות של שלפוחיות, יכולה לספק שיפור טוב לאפיון שלהן וגם לחקר תפקידן בתהליכים ביולוגיים.

כדי להתחיל, פתח את קו הלחץ ומערכת הוואקום של סדרן התאים. הפעל את המכשיר, פתח את ארון הבטיחות הביולוגית והפעל את תוכנת המיון. לחץ על מערכת הנוזל ולאחר מכן הפעל את המערכת הנוזלית.

הפעל את הטיפה להניע את הגביש הפיזואלקטרי בזרבובית שרוטטת ליצירת טיפות. בצע את הליך הבעבוע כדי לחסל בועות במערכת. לאחר מכן הפעל צינור של חמישה מיליליטר של תמיסת ניקוי למשך חמש דקות בלחץ דיפרנציאלי גבוה, ואחריו צינור של חמישה מיליליטר של מים נטולי יונים למשך חמש דקות.

כדי לבצע את הליך ההפעלה הידני, עבור ללשונית בקרת הלייזר והפעל את כוח הלייזר. בחן את היישור האנכי של הנחל. לקביעת נקודת לייזר, לחץ על לשונית יירוט זרם הלייזר.

לחץ על לחצן החץ הירוק ופעל לפי ההוראות שעל צג מסך המגע. אתחל את IntelliSort, והגדר את תדר כונן הנפילה יחד עם ערך ברירת המחדל של משרעת הגורם לזרם ליצור טיפה. עבור הליך יישור הלייזר העדין, טען צינור של חמישה מיליליטר של חרוזי יישור QC לתוך הדגימה והפעל אותו בפרוטוקול QC.

בכרטיסיית היישור העדין, בחר את הפרמטרים הרצויים בצירי X ו-Y כדי לדמיין חרוזים דחוסים ומקולקלים היטב. לאחר בדיקת היישור הידני, בצע את ה-QC האוטומטי כאשר קוטר חרוזי ה-QC מוגדר לשלושה מיקרומטרים. שמור את רכישת QC בפרוטוקול יישור התוכנה.

כדי לסיים את IntelliSort, אתר את לוחות הסטייה במיקום הנכון בממיין, והפעל את המתח לכ-3,000 וולט. בחר את פלט המיון של מחזיק שישה צינורות. בחר את הזרמים במחוון הזרם כדי להפעיל אותם ולבצע את זרם הבדיקה.

הפעל את לחצן קביעת עיכוב השחרור האוטומטי של IntelliSort כדי להגדיר את עיכוב השחרור הנכון ולאמת שוב את הזרמים. לאחר מכן הפעל את מצב התחזוקה של IntelliSort ואמת את עיכוב השחרור באופן ידני. טען את פרוטוקול השהיית הנפילה הידני בתוכנת המיון ורכוש חרוזי בקרה פלואורסצנטיים.

לאחר הוספת מציין השקופיות הנכון, בחר מיון, ולאחר מכן אשף השהיית שחרור ולוגיקת מיון. ודא במיקרוסקופ פלואורסצנטי ש-97% מחרוזי הפלואורסצנט נמצאים בשלולית החמישית. כדי להתחיל, הגדר את סדרן התאים והפעל את IntelliSort.

לאחר ביצוע כיול פיזור, בצע את שלבי רכישת הדגימה עבור כל דגימה. כדי ליצור פרוטוקול חדש למיון לדוגמה, בחר קובץ ואחריו פרוטוקול וחדש בסרגל הכלים. לחץ על הגדרת רכישת נתונים בתוכנת המיון.

בחלון פרמטר הרכישה, בחר את הערוצים המעניינים והשבת את האחרים. לאחר מכן הניחו צינור של חמישה מיליליטר של הדגימה בדגימה. במסך המגע, לחץ על כפתור הטעינה.

בסרגל הכלים של תוכנת המיון, בחר רכישה ולחץ על התחל. כאשר חלון המאפיינים לדוגמה מופיע, הוסף את השם לדוגמה ולחץ על אישור. ליצירת אסטרטגיית השער, בחר היסטוגרמה ולאחר מכן צור היסטוגרמה.

צור שלוש עלילות נקודות, הראשונה עם יומן גובה 488-FSC1 על ציר X ויומן גובה 488-SSC על ציר Y. השני עם יומן גובה 488-FSC-2 על ציר X ויומן גובה 488-SSC על ציר Y, והשלישי עם יומן גובה 488 513 X 26 CFSE על ציר X ויומן גובה 488-SSC על ציר Y. לחץ על רכישה ולאחר מכן התחל והוסף את שם הדוגמה.

במהלך הרכישה, צייר אזור המזהה את האירועים השליליים של CFSE, ואחד המזהה את האירועים החיוביים של CFSE. לאחר מכן, בכרטיסיה מיון, זהה את האזור שיש למיין. כאשר קצב הזרימה יציב, בחר רכישה ואחריה עצירה.

התחל את המיון על-ידי בחירת מיון בסרגל הכלים של תוכנת המיון. כדי לשמור את הגדרות המיון, בחר מיון בסרגל הכלים ולאחר מכן לחץ על שמור הגדרות מיון. כדי לבדוק את טוהר האוכלוסייה הממוינת, רכשו תחילה צינור של חמישה מיליליטר של תמיסת ניקוי למשך 10 דקות בלחץ דיפרנציאלי גבוה ואחריו צינור של חמישה מיליליטר של מים נטולי יונים למשך 10 דקות.

רכוש PBS מסונן בגודל 0.22 מיקרומטר ובדוק שאין אירועים חיוביים של CFSE. לאחר מכן יש לדלל חמישה מיקרוליטר מהדגימה הממוינה ב -100 מיקרוליטר של 0.22 מיקרומטר, PBS מסונן. רכוש את הדגימות הממוינות ורשום את הנפחים ביטוי של CD9, CD63, CD81 ו-CD44, בשלפוחיות החוץ-תאיות שמקורן בשומן לא השתנה לאחר מיון CFSE.

ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים הראה כי התפלגות הגודל של השלפוחיות נותרה עקבית לפני ואחרי המיון. ניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים הולכה הצביע על כך שהמורפולוגיה של השלפוחיות לא השתנתה באופן משמעותי בתהליך המיון. בנוסף, הטיפול היה 0.1% Triton X-100 הפחית את מספר השלפוחיות החיוביות ל-CFSE המאשרות את מקורן השלפוחית.