Name: תרבית משותפת של תאי אפיתל, מזנכימליים, אנדותלים ומערכת החיסון שמקורה ב-iPSC כדי להדגים את שלמות מחסום דרכי הנשימה בבריאות ומחלות ריאות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-06T13:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: חקור מודל רב-תאי של מחסום דרכי הנשימה המבוסס על תאי iPSC, הכולל אפיתל, מזנכימה, אנדותל ומקרופאגים בממשק אוויר-נוזל. שיטה זו מאפשרת חקר תגובות לרעלים סביבתיים ושיקום ריאות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>מודל דרכי הנשימה לחקר שלמות מחסום הריאות, מחלות וגילוי תרופות

<ol><li>Wu, M., Zhang, X., Lin, Y., Zeng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+airway+basal+stem+cells+in+lung+homeostasis+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Res%22%5BJournal%5D)">Roles of airway basal stem cells in lung homeostasis and regenerative medicine.</a> Respir Res. 23 (1), 122(2022).</li>
<li>Blackburn, J. B., Li, N. F., Bartlett, N. W., Richmond, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+update+in+club+cell+biology+and+its+potential+relevance+to+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">An update in club cell biology and its potential relevance to chronic obstructive pulmonary disease.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 324 (5), L652-L665 (2023).</li>
<li>Fahy, J. V., Dickey, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+mucus+function+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Airway mucus function and dysfunction.</a> N Engl J Med. 363 (23), 2233-2247 (2010).</li>
<li>Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+epithelial+differentiation+and+mucociliary+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Am+Thorac+Soc%22%5BJournal%5D)">Airway epithelial differentiation and mucociliary clearance.</a> Ann Am Thorac Soc. 15 (Suppl 3), S143-S148 (2018).</li>
<li>Khalilgharibi, N., Mao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+form+and+function%3A+On+the+role+of+basement+membrane+mechanics+in+tissue+development%2C+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biol%22%5BJournal%5D)">To form and function: On the role of basement membrane mechanics in tissue development, homeostasis and disease.</a> Open Biol. 11 (2), 200360(2021).</li>
<li>Mcdonald, D. M., Yao, L. C., Baluk, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+airway+blood+vessels+and+lymphatics%3A+Lessons+from+development+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Am+Thorac+Soc%22%5BJournal%5D)">Dynamics of airway blood vessels and lymphatics: Lessons from development and inflammation.</a> Proc Am Thorac Soc. 8 (6), 504-507 (2011).</li>
<li>Parker, D., Prince, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+in+the+respiratory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Innate immunity in the respiratory epithelium.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 45 (2), 189-201 (2011).</li>
<li>Davis, J. D., Wypych, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+functional+heterogeneity+of+the+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cellular and functional heterogeneity of the airway epithelium.</a> Mucosal Immunol. 14 (5), 978-990 (2021).</li>
<li>Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+airway+epithelium%3A+Soldier+in+the+fight+against+respiratory+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">The airway epithelium: Soldier in the fight against respiratory viruses.</a> Clin Microbiol Rev. 24 (1), 210-229 (2011).</li>
<li>Fosse, J. H., Haraldsen, G., Falk, K., Edelmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+in+emerging+viral+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells in emerging viral infections.</a> Front Cardiovasc Med. 8, 619690(2021).</li>
<li>Wang, Y., Zheng, J., Wang, X., Yang, P., Zhao, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+and+airway+hyperresponsiveness+associated+with+respiratory+syncytial+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages and airway hyperresponsiveness associated with respiratory syncytial virus infection.</a> Front Immunol. 13, 1012048(2022).</li>
<li>Costa, A., De Souza Carvalho-Wodarz, C., Seabra, V., Sarmento, B., Lehr, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triple+co-culture+of+human+alveolar+epithelium%2C+endothelium+and+macrophages+for+studying+the+interaction+of+nanocarriers+with+the+air-blood+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Triple co-culture of human alveolar epithelium, endothelium and macrophages for studying the interaction of nanocarriers with the air-blood barrier.</a> Acta Biomater. 91, 235-247 (2019).</li>
<li>Leibel, S. L., Mcvicar, R. N., Winquist, A. M., Snyder, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+3D+whole+lung+organoids+from+induced+pluripotent+stem+cells+for+modeling+lung+developmental+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of 3D whole lung organoids from induced pluripotent stem cells for modeling lung developmental biology and disease.</a> J Vis Exp. (170), e62456(2021).</li>
<li>Mccauley, K. B., Hawkins, F., Kotton, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+epithelial-only+airway+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Derivation of epithelial-only airway organoids from human pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 45 (1), e51(2018).</li>
<li>Choi, K. -Y. G., Wu, B. C., Lee, A. H. -Y., Baquir, B., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+organoid+and+air-liquid+interface+models+as+a+screening+method+in+the+development+of+new+host+defense+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Utilizing organoid and air-liquid interface models as a screening method in the development of new host defense peptides.</a> Front Cell Infect Microbiol. 10, 228(2020).</li>
<li>Fulcher, M. L., Randell, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+nasal+and+tracheo-bronchial+respiratory+epithelial+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Human nasal and tracheo-bronchial respiratory epithelial cell culture.</a> Methods Mol Biol. 945, 109-121 (2013).</li>
<li>Hao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+modeling+of+SARS-COV-2+infection+of+in+vitro+cultured+polarized+human+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Long-term modeling of SARS-COV-2 infection of in vitro cultured polarized human airway epithelium.</a> mBio. 11 (6), e02852-e02920 (2020).</li>
<li>Patsch, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+vascular+endothelial+and+smooth+muscle+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Cell Biol. 17 (8), 994-1003 (2015).</li>
<li>Van Wilgenburg, B., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient%2C+long-term+production+of+monocyte-derived+macrophages+from+human+pluripotent+stem+cells+under+partly-defined+and+fully-defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient, long-term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions.</a> PLoS One. 8 (8), e71098(2013).</li>
<li>Pouyanfard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+macrophages+ameliorate+liver+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human-induced pluripotent stem cell-derived macrophages ameliorate liver fibrosis.</a> Stem Cells. 39 (12), 1701-1717 (2021).</li>
<li>Ardini-Poleske, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lungmap%3A+The+molecular+atlas+of+lung+development+program%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Lungmap: The molecular atlas of lung development program.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 313 (5), L733-L740 (2017).</li>
<li>Ronaghan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M1-like%2C+but+not+m0-+or+m2-like%2C+macrophages%2C+reduce+RSV+infection+of+primary+bronchial+epithelial+cells+in+a+media-dependent+fashion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">M1-like, but not m0- or m2-like, macrophages, reduce RSV infection of primary bronchial epithelial cells in a media-dependent fashion.</a> PLoS One. 17 (10), e0276013(2022).</li>
<li>Gotoh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+alveolar+epithelial+spheroids+via+isolated+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Generation of alveolar epithelial spheroids via isolated progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Rep. 3 (3), 394-403 (2014).</li>
<li>Yamamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+alveolar+stem+cells+derived+from+human+iPS+cells+in+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of alveolar stem cells derived from human iPS cells in organoids.</a> Nat Methods. 14 (11), 1097-1106 (2017).</li>
<li>Firth, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+multiciliated+cells+in+functional+airway+epithelia+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Generation of multiciliated cells in functional airway epithelia from human induced pluripotent stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (17), E1723-E1730 (2014).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>12 צלחות באר</td><td>קורנינג</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>מוסיף 12 בארות, 0.4 ומיקרו; m, שקוף&nbsp;</td><td>VWR</td><td>10769-208</td><td></td></tr><tr><td>2-מרקפטואתנול&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Tech</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>Activin A</td><td>R& D Systems</td><td>338-AC</td><td></td></tr><tr><td>חומצה רטינואית All-trans (RA)&nbsp;</td>חומצה אסקורבית <td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>B27 ללא חומצה רטינואית;</td><td>ThermoFisher</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>BMP4&nbsp;</td><td>מו"פ D Systems</td><td>314-BP/CF</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין בסרום בקר (BSA) Fraction V, תמיסה של 7.5%&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>Br-cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5386</td><td></td></tr><tr><td>CD 14 (FITC)</td><td>BioLegend</td><td>982502</td><td></td></tr><tr><td>CD 31 PECAM-1(APC)</td><td>R& D System</td><td>FAB3567A</td><td></td></tr><tr><td>CD 45 (PE)</td><td>BD Biosciences</td><td>560975</td><td></td></tr><tr><td>CD 68 (PE)</td><td>BioLegend</td><td>33808</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab120890</td><td></td></tr><tr><td>CPM</td><td>Fujifilm</td><td>014-27501</td><td></td></tr><tr><td>דקסמתזון&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>Dispase&nbsp;</td><td>StemCellTech</td><td>7913</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12&nbsp;</td><td>גיבקו</td><td>10565042</td><td></td></tr><tr><td>דורסומורפין</td><td>מו"פ D Systems</td><td>3093</td><td></td></tr><tr><td>E-CAD/CD 324 (APC)</td><td>BioLegend</td><td>324107</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>R& D Systems</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>EGM2 Medium</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>EPCAM/CD 326 (APC)</td><td>BioLegend</td><td>324212</td><td></td></tr><tr><td>FBS&nbsp;</td><td>ג'יבקו</td><td>10082139</td><td></td></tr><tr><td>FGF10</td><td>מו"פ D Systems</td><td>345-FG/CF</td><td></td></tr><tr><td>FGF7</td><td>מו"פ D Systems</td><td>251-KG/CF</td><td></td></tr><tr><td>פיברונקטין</td><td>פישר</td><td>356008</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Abcam</td><td>ab120058</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax&nbsp;</td><td>לייף טכנולוג'יז</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>חם s F12&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>IL-3</td><td>Peprotech</td><td>200-03</td><td></td></tr><tr><td>Iscove' s Modified Dulbecco' s בינוני (IMDM) + גלוטמקס&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>31980030</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement (KSR)</td><td>Life Technologies</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>מונותיוגליצרול&nbsp;</td><td>ערכת Sigma</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR plus (10 למארז)</td> <td>Stem Cell Tech</td><td>5825</td><td></td></tr><tr><td>N2&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>עט/סטרפטוקוקוס</td><td>Lonza</td><td>17-602F</td><td></td></tr><tr><td>ReleSR</td><td>Stem Cell Tech</td><td>5872</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 + Glutamax&nbsp;</td><td>לייף טכנולוג'יז</td><td>12633012</td><td></td></tr><tr><td>SB431542&nbsp;</td><td>מו"פ D Systems</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>PeproTech</td><td>300-07</td><td></td></tr><tr><td>SMA</td><td>Invitrogen</td><td>50-9760-80</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff APEL 2</td><td>Medium STEMCELL Technologies</td><td>5275</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td></td></tr><tr><td>VEGF165</td><td>Preprotech</td><td>100-20</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin</td><td>Cell Signaling</td><td>5741S</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (מעכב סלעים)&nbsp;</td><td>מו"פ די סיסטמס</td><td>1254/1</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1</td><td>Invitrogen</td><td>339100</td><td></td></tr></tbody></table>

תרבית משותפת של תאי אפיתל, מזנכימליים, אנדותלים ומערכת החיסון שמקורה ב-ipsc כדי להדגים את שלמות מחסום דרכי הנשימה בבריאות ומחלות ריאות

iPSC-Derived Epithelial, Mesenchymal, Endothelial, and Immune Cell Co-Culture to Model Airway Barrier Integrity in Lung Health and Disease

ישנם מספר שלבים שבהם ניתן להעריך את ההתמיינות של אורגנואידים בדרכי הנשימה שמקורם ב-iPSC, תאי אנדותל, תאי חיסון ותרביות משותפות שהושלמו בהצלחה. ניתן לבצע הבדלים בקווי iPSC שונים, ופרוטוקול זה נבדק בחמישה קווים שונים לפחות. יש להתאים את הפרוטוקול לכל קו iPSC חדש, במיוחד על ידי שינוי ואופטימיזציה של צפיפות הזריעה.
ניתן להעריך את התפוקה המוצלחת של אורגנואידים בדרכי הנשימה שמקורם ב-iPSC באמצעות שדה בהיר ויהיו לה ארבעה מאפיינים: גבולות/קצוות מוגדרים, מורפולוגיה שקופה/ציסטית, יכולת התרבות/התרחבות והיעדר תאים נמקיים. אורגנואידים של דרכי הנשימה שנראים מטושטשים אינם גדלים בגודלם במהלך השבועיים של התרבית, ואין להשתמש בנמק לניסויים בתרבית משותפת. אורגנואידים עם שכבת לומינל עבה בפריפריה לעומת האורגנואידים השקופים/ציסטיים עדיין יכולים לשמש לניסויים הבאים. עם זאת, האורגנואידים השקופים/ציסטיים של דרכי הנשימה מורכבים בעיקר מתאי בסיס, ואילו האורגנואידים העבים של הממברנה הכפולה מורכבים בעיקר מתאי מועדון. מכיוון שתאי בסיס מתרבים ומתרחבים בקלות, הם מתאימים יותר לתרבית וקיטוב בין פאזות אוויר-נוזל. שיטות אחרות להערכת התפוקה המוצלחת של אורגנואידים ריאתיים שמקורם ב-iPSC הן ניתוח זרימה-ציטומטריה בשלב אב הריאה (יום 16 להתמיינות) עבור CPM של סמן פני השטח (טבלה 1), תפוקת התמיינות מוצלחת &gt;50% תאי CPM+.
עבור דיסוציאציה של אורגנואידים בדרכי הנשימה ותרבית אינטרפאזה אוויר-נוזלית, ודא שכל פולימר ה-ECM הוסר, אחרת זה ימנע מהתאים להתרחב על הממברנה. התאים צריכים להיות מתכנסים עד היום השלישי של התרבית, לפני ההרמה האווירית. ניתן להעריך את אישור סוגי התאים ב-iAirways על ידי צביעה עבור סמנים ספציפיים לסוג התא המתאימים: תאי בסיס (p63+), תאי מועדון (SCGB1A1+), תאי גביע (MUC5AC+) ותאים ריסניים (AcTub+). אפיון וסמנים ספציפיים לסוג תאי ריאה מאומתים ב-LungMAP21. ניתן לזהות מזנכימה עם נוגדנים נגד וימנטין או אקטין שריר חלק. כדי ליצור תאים ריסניים יותר, התרביות עשויות לדרוש הרמת אוויר לפרק זמן ארוך יותר או תוספת של DAPT.
ניתן להעריך את התפוקה המוצלחת של תאי אנדותל שמקורם ב-iPSC באמצעות שדה בהיר, המראה מורפולוגיה דמוית אבן מרוצפת (יום 6 של התמיינות האנדותל שמקורה ב-iPSC). תרבית אנדותל מוצלחת שמקורה ב-iPSC תכיל &gt;50% תאי CD31+, ויש לייצר מספיק תאים כך שלאחר המיון, התשואה צריכה להיות יותר מ-500,000 תאים. ניתן להעביר תאים או לשמר אותם בהקפאה, ויש לבדוק את סמן CD31 באמצעות זרימה עם כל מעבר או תרבית חדשה. אין לעבור תאים מעבר ל-P4. לעיון, ראו תאי אנדותל שמקורם ב-iPSC לפני/אחרי מיון CD31 (איור 1C). תאי אנדותל יהיו שטוחים עם גוף תא גדול עם מורפולוגיה מוארכת וצורת ציר.
לצורך התמיינות מקרופאגים, גופים עובריים צריכים להישאר בתחתית באר ה-ULA, ורק EB אחד צריך להיות בכל באר. הם אמורים להראות שינויים ציסטיים עד יום 5-7. אם הם לא יוצרים EB לאחר צנטריפוגה, זרעו את ה-iPSCs לתוך צלחת ULA של 96 בארות מבלי להסתובב. ייתכן שיהיה צורך להגדיל את מספר ה-iPSCs. התפוקה המוצלחת של תאי חיסון שמקורם ב-iPSC תלויה לחלוטין ביכולתם של גופים עובריים (EBs) להתפתח לציסטות (יום 7 להתמיינות). EBs חיסוניים שמקורם ב-iPSC שאינם מפתחים ציסטות לא ייצרו סטרומה כאשר הם מצופים על ג'לטין ולא ייצרו אבות מיאלואידים. לאחר ההעברה לצלחת המצופה ג'לטין, ה- EBs צריכים להישאר מחוברים לתחתית הצלחת. תנועת הצלחת צריכה להיעשות בזהירות כדי לא לעקור אותם. יש להחליף צלחות פעמיים בשבוע באופן ידני, ולהעביר את התאים התלויים ל-Mac-CM2 או לשמר בהקפאה. בנוסף, לאחר קצירת האבות המיאלואידים התלויים, עליהם להיצמד לבקבוק הפלסטיק הלא מצופה, וליצור תאים בהירים מתחת לשדה בהיר עם ואקואולים, מה שמעיד על מקרופאגים. הסמן למונוציטים, CD14+, צריך להיות &gt;90% בתאים התלויים. סמן המקרופאגים, CD68, אמור לעלות עם הזמן, כאשר ~50% מהמקרופאגים מבטאים CD68+ לאחר שבועיים (איור 1D). יש לקבוע יעילות הידבקות עבור כל קו תאים. אנו משיגים יעילות הידבקות ממוצעת של 20%. לצורך קיטוב, מקרופאגים M0 מקוטבים למקרופאגים M1 (iPSC-M1) או M2 (iPSC-M2) למשך 48 שעות במדיום התמיינות II בתוספת גירויים שונים: 100 ננוגרם/מ"ל LPS ו-20 ננוגרם/מ"ל IFN-g עבור קיטוב M1 או 50 ננוגרם/מ"ל IL-4 ו-20 ננוגרם/מ"ל IL-13 עבור קיטוב M2. הסמן לקיטוב M1 הוא CD80+, וקיטוב M2 הוא CD206+.
ניתן להעריך יצירה מוצלחת של התרבות המשולשת באמצעות אימונופלואורסצנציה עבור סמני צומת הדוקים אפיתל EPCAM, ECAD או ZO-1, או סמן צומת הדוק אנדותל CD31 (איור 2C, טבלה 1). ניתן להעריך את הפונקציונליות של התרבות המשולשת גם באמצעות התנגדות אפיתל/אנדותל טרנס-חשמלית (TEER). תרבויות אורגנואידים ואנדותל של דרכי הנשימה המורכבות היטב יהיו בעלות התנגדות חשמלית גדולה יותר, מה שמעיד על תקשורת וחיבור תאים אופטימליים. עלבונות סביבתיים, כמו למשל סיגריות אלקטרוניות או אתגר ויראלי, יפגעו בשלמות מחסום האפיתל והאנדותל, וכתוצאה מכך ההתנגדות החשמלית המופחתת של התרבות המשותפת (איור 3A,B) וצמתים הדוקים לא מאורגנים (איור 3C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67247/67247fig01v2.jpg"> 
איור 1: בידול ואפיון של אפיתל דרכי הנשימה שמקורו ב-iPSC, אנדותל ותרביות חיסוניות. (A) סכמטי של התמיינות מכוונת iPSC עבור הרכבת ה-iAirway. (B) אורגנואידים של אפיתל דרכי הנשימה שמקורם ב-iPSC המאופיינים בשדה בהיר (משמאל) וניתוח ציטומטריית זרימה (מימין) עבור EPCAM ו-ECAD. (C) אנדותל דרכי הנשימה שמקורו ב-iPSC המאופיין בשדה בהיר (משמאל), אימונופלואורסצנציה וניתוח ציטומטריית זרימה (מימין) עבור CD31. שדה הבהירות המתאים לאחר מיון CD31 מוצג בצד ימין. (D) מקרופאגים שמקורם ב-iPSC מאופיינים בניתוח שדה בהיר (משמאל) וניתוח ציטומטריית זרימה (מימין) עבור הסמן ההמטופויאטי הפאן CD45, יצרן המונוציטים CD14 וסמן המקרופאגים CD68. פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67247/67247fig01largev2.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67247/67247fig02.jpg"> 
איור 2: תרבית משותפת של תאי אפיתל, מזנכימליים, אנדותל ומקרופאגים שמקורם ב-iPSC. (א) שרטוט של מכלול נתיב האוויר האווירי. (B) תמונות שדה בהירות של המונוקולטורה של האפיתל והאנדותל בהתאמה, הדו-תרבות של האפיתל והאנדותל, והתרבות המשותפת של האפיתל, האנדותל והמקרופאגים. מקרופאגים מתויגים ב-Cytotracker אדום. מוטות קנה מידה: 100 מיקרומטר. (C) צביעה אימונו-פלואורסצנטית לסמן צומת הדוק ZO-1 בצד האפיקלי של תוספת תרבית התא ו-CD31 בצד הבסיסי. מוטות קנה מידה: 100 מיקרומטר. (D) חתך רוחב של הכנסת תרבית התא עם אורגנואידים מנותקים של דרכי הנשימה בצד האפיקלי, שבוע לאחר הרמת האוויר. הפאנל השמאלי עם צביעת H&amp;E עם החץ השחור מראה תאים ריסניים. הפאנל האמצעי, עם הדמיה אימונופלואורסצנטית, מראה את סמן האפיתל E-cadherin (ECAD). הפאנל הימני, עם הדמיה אימונופלואורסצנטית, מראה סמנים מזנכימליים כגון וימנטין (VIM) ואקטין שריר חלק (SMA). פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67247/67247fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67247/67247fig03.jpg"> 
איור 3: שינויים בתפקוד מחסום דרכי הנשימה של נתיבי האוויר החשופים לסיגריות אלקטרוניות ווירוסים. (A) סכמטי של כלי מדידת התנגדות אפיתל/אנדותל טרנס-חשמלית (TEER). (ב) גרף עמודות של TEER לאחר 7 ימים של הוספת סיגריה אלקטרונית מנטול למדיה. רווח בר-סמך ממוצע +/- 95%. N = 5 שכפולים ביולוגיים ו-3 שכפולים טכניים; ערך p &lt;0.001. (C) צביעה אימונו-פלואורסצנטית לחלבון צומת הדוק ZO-1 לפני ואחרי הדבקה ב-SARS-CoV-2. שימו לב לפריסה הלא מסודרת של ZO-1 לאחר ההדבקה. פסי קנה מידה: 50 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67247/67247fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>נוגדן</td>
			<td>יישום</td>
			<td>דילול</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>תקליטור 31 PECAM-1 (נגמ"ש)</td>
			<td>ציטומטריית זרימה (FC)</td>
			<td>10 מיקרוליטר במאגר 100 UL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPCAM/CD 326 (נגמ"ש)</td>
			<td>מועדון הכדורגל</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-CAD/CD 324 (נגמ"ש)</td>
			<td>מועדון הכדורגל</td>
			<td>5 מיקרוליטר במאגר 100 UL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>עלות לאלף הופעות</td>
			<td>מועדון הכדורגל</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>תקליטור 45</td>
			<td>מועדון הכדורגל</td>
			<td>5 מיקרוליטר במאגר 100 UL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>תקליטור 14 (FITC)</td>
			<td>מועדון הכדורגל</td>
			<td>5 מיקרוליטר במאגר 100 UL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>תקליטור 68</td>
			<td>מועדון הכדורגל</td>
			<td>5 מיקרוליטר במאגר 100 UL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZO-1</td>
			<td>אימונופלואורסצנציה (IF)</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>וימנטין</td>
			<td>אם</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMA</td>
			<td>אם</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
טבלה 1: נוגדנים המשמשים ב-FACS ואימונופלואורסצנטיות.
קובץ משלים 1: קומפוזיציות מדיה ומאגר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67247/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.</a>

תרבית משותפת של תאי אפיתל, מזנכימליים, אנדותלים ומערכת החיסון שמקורה ב-iPSC כדי להדגים את שלמות מחסום דרכי הנשימה בבריאות ומחלות ריאות

Human lung tissue is composed of an interconnected network of epithelium, mesenchyme, endothelium, and immune cells from the upper airway of the ...

ipsc-derived-epithelial-mesenchymal-endothelial-immune-cell-co

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

מוצג כאן פרוטוקול לבידוד מונוציט דם אנושי ראשי, כמו גם ההבידול שלהם לתוך מקרופאגים ותאים דנדריטיים והרכבה עם תאים אפיתל לתוך מודל ריאות אנושי רב תאי. תגובות ביולוגיות של cocultures המורכבים תאים חיסוניים מובדלים או חדוציטים מבודדים טריים או מופשרים, עם חשיפה לגירוייםדלקתיים, מושווים.

מודל אדם רב-תאי המורכב מתאי אפיתל ותאי מערכת החיסון העיקריים להערכת סיכונים

מאמר זה מספק מתודולוגיה מפורטת לגישות דיסוציאציה של רקמות ופירוק תאי, המאפשרות העשרה של תאי אפיתל בני קיימא מאזורים פרוקסימליים ודיסטליים של הריאה האנושית. כאן גישות אלה מיושמות לניתוח פונקציונלי של תאי אב אפיתל ריאה באמצעות שימוש במודלים של תרביות אורגנואידים תלת-ממדיות.

בידוד והעשרה של תאי אב אפיתל הריאה האנושיים לתרבית אורגנואידית

הפרוטוקול הנוכחי מתאר תאים דמויי אפיתל דמויי אפיתל פלוריפוטנטיים מסוג 2 המושרים על ידי בני אדם (iAT2s). תאים אלה יכולים להיות מתורבתים ככדורים המתחדשים בעצמם בתרבית תלת-ממדית או מותאמים לתרבית ממשק אוויר-נוזלי (ALI).

יצירת כדורים תלת-ממדיים ותרביות ממשק אוויר-נוזל דו-ממדיות של תאי אפיתל פלוריפוטנטיים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם מסוג 2

ההתקדמות האחרונה בפרוטוקולי התמיינות תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם מאפשרת נגזרת מדורגת של סוגי תאים ספציפיים לאיברים. כאן, אנו מספקים שלבים מפורטים לתחזוקה והרחבה של תאי בסיס של דרכי הנשימה שמקורם ב-iPSC והתמיינותם לאפיתל רירית בתרביות ממשק אוויר-נוזל.

יצירת תרביות ממשק אוויר-נוזל של תאי אפיתל דרכי הנשימה מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

הפרוטוקול המוצג מתאר את הפיתוח והשימוש בטכניקת צביעת אקטין נימה מבוססת פלואידין עם מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (CLSM) כדי להמחיש את מבנה שכבת התא הדבק בתעלות תרבית דינמיות מיקרופלואידיות ובתאי תרבית סטטיים קבועים מסורתיים. גישה זו מסייעת בהערכת מפגש שכבות התא, היווצרות חד-שכבתית ואחידות בעובי השכבה.

הכנה והערכה מבנית של חד-שכבות תאי אפיתל במכשיר תרבית מיקרופלואידית בגודל פיזיולוגי

מוצגת כאן שיטה ניתנת לשחזור, משתלמת וחזקה לבידוד והרחבה של תאי אפיתל סימפונות ראשוניים עבור ביו-בנקאות לטווח ארוך ויצירת תאי אפיתל ממוינים על ידי תרבית בממשק אוויר-נוזל.

בידוד תאי אפיתל של הסימפונות מרקמת ריאה שנכרתה לצורך ביו-בנקאות והקמת תרביות ממשק אוויר-נוזל ממוינות היטב

דוח זה מספק פרוטוקולים להרכבה, תרבית תאים ובדיקות על פלטפורמת μSiM לבניית מודלים של מחסום דם-מוח.

שימוש בפלטפורמת רקמת מחסום MicroSiM (μSiM) למידול מחסום הדם-מוח

כאן, פרוטוקול לתרבית אורגנואידים של הוושט האנושי ותרבות ממשק אוויר-נוזל מסופק. ניתן להשתמש בתרבית ממשק אוויר-נוזל של אורגנואידים בוושט כדי לחקור את ההשפעה של ציטוקינים על מחסום אפיתל הוושט.

מודלים תלת מימדיים של תרביות תאים לחקר מחסום האפיתל בדלקת ושט אאוזינופילית 

במאמר זה אנו מתארים מודל במבחנה לבידוד והתמיינות של תאי אפיתל בדרכי הנשימה, תוך התמקדות בהתאקלמותם לתמצית עשן סיגריות כרונית (CSE). ניתן להשתמש במודל כדי לאפיין באופן מקיף את ההשפעה הרב-אומית של CSE, מה שעשוי לספק תובנות לגבי התגובות התאיות תחת חשיפה כרונית לעשן.

מודל In Vitro לחקר התמיינות ושינויים של מולטי-אומיקה בתאי אפיתל של דרכי הנשימה של מורין המגורות באמצעות תמצית עשן סיגריות

פרוטוקול זה מתאר את התרבות העיקרית / שיתוף התרבות של רקמת השחלה עכבר, באמצעות השחלות מעכברים בילוד וזקיקים בשחלות בודדות מעכברים לפני גיל בגרות מיניים. טכניקות התרבות לתמוך בפיתוח באופן פיסיולוגי מאוד, המאפשר חקירה של ההשפעה של סוכנים חיצוניים בשחלה, ושל יחסי גומלין בין זקיקים בשחלות.

תרבות ושיתוף התרבות של עכבר שחלות וזקיקים בשחלות

חקור מודל רב-תאי של מחסום דרכי הנשימה המבוסס על תאי iPSC, הכולל אפיתל, מזנכימה, אנדותל ומקרופאגים בממשק אוויר-נוזל. שיטה זו מאפשרת חקר תגובות לרעלים סביבתיים ושיקום ריאות.

תרבית משותפת של תאי אפיתל, מזנכימליים, אנדותלים ומערכת החיסון שמקורה ב-iPSC כדי להדגים את שלמות מחסום דרכי הנשימה בבריאות ומחלות ריאות (וידאו) | JoVE Journal

תרבית משותפת של תאי אפיתל, מזנכימליים, אנדותלים ומערכת החיסון שמקורה ב-iPSC כדי להדגים את שלמות מחסום דרכי הנשימה בבריאות ומחלות ריאות

גלה סרטונים נוספים