כימות מיקרוסקופי בזמן אמת בתפוקה גבוהה של שחרור מלכודת נויטרופילים חוץ-תאית אנושית והערכת הפרמקולוגיה של אנטגוניסטים

פיתחנו שיטת מיקרוסקופיה בזמן אמת לכימות של מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות או NETs. NETs אלה ממלאים תפקיד חשוב בהגנה החיסונית המולדת. עם זאת, התברר כי הצטברות של NETs ברקמות תורמת לפתופיזיולוגיה של מחלות דלקתיות ואוטואימוניות מרובות.

בגלל ההשלכות הפתולוגיות של NETs, העניין בפיתוח אנטגוניסטים של NETosis עלה. כדי לחקור את עיכוב NETosis, פיתחנו שיטת מיקרוסקופיה בזמן אמת לכימות שחרור NET אנושי, המאפשרת לנו לחקור NETosis ועיכובו באופן תפוקה גבוהה. נויטרופילים הם תאים רגישים ויכולים לשנות את תגובתם לגירויים במהלך תהליך הטיהור עקב מתח מכני, מיקרוביאלי ואחרים.

לכן, חשוב לאמת את פרוטוקול בידוד הנויטרופילים כדי למזער את הפעלת הנויטרופילים. אז טכניקה זו מאפשרת לחקור שחרור NET מאנשים בריאים כמו גם חולים. בנוסף, זה מאפשר לנו לחקור את הקינטיקה של היווצרות NET הנגרמת על ידי גירויים פיזיולוגיים שונים.

בעזרת טכניקת מיקרוסקופיה בעלת תפוקה גבוהה זו, הצלחנו להוכיח כי אנטגוניסט NETosis CIT-013, נוגדן חד שבטי המכוון להיסטונים ציטרולינים 2A ו-4, הצליח לעכב ביעילות את שחרור ה-NET עם IC 50 או 4.6 ננו-מולר. זה מוכיח שבדיקה זו מתאימה לבדיקת אנטגוניסטים של NETosis. לאחר איסוף דם היקפי מהמתנדב הבריא בשפופרת ליתיום הפרין, העבירו את הדם לשפופרת טרייה של 50 מיליליטר.

שטפו את צינור הליתיום הפרין עם DPBS והעבירו אותו לאותו צינור של 50 מיליליטר, וודא שיחס הדם ל-DPBS הוא 1:1. לאחר הערבוב, הוסף דם מדולל על גבי תמיסת שיפוע הצפיפות. צנטריפוגה בדם ב -400 גרם למשך 40 דקות עם האצה ושבירה מינימלית.

השליכו את שכבת הפלזמה העליונה עם פיפטה של 10 מיליליטר. לאחר מכן, השתמש בפיפטה פסטר מפלסטיק כדי להשליך את התאים החד-גרעיניים של הדם ההיקפי ואת תמיסת שיפוע הצפיפות. יש לנער בעדינות את השכבה המכילה אריתרוציטים ונויטרופילים לפני השעיה מחדש ב-15 מיליליטר DPBS.

מוסיפים 25 מיליליטר של תמיסת 6% דקסטרן ו-0.9% נתרן כלורי ומערבבים על ידי היפוך הצינור. לאחר 25 דקות של דגירה, העבירו את שכבת הנויטרופילים העליונה לצינור טרי של 50 מיליליטר עם פיפטה של 10 מיליליטר וצנטריפוגה בטמפרטורה של 500 גרם למשך 10 דקות. שפכו את הצינור כדי להשליך את הסופרנטנט ולהשעות מחדש את הגלולה ב-10 מיליליטר של מאגר אמוניום כלוריד אשלגן ליזה.

הוסף 40 מיליליטר מאותו מאגר ליזה ודגר בטמפרטורת החדר תוך היפוך רציף של הצינור עד שהתמיסה הופכת לשקופה. צנטריפוגה את הצינור ב -350 גרם למשך 10 דקות. לאחר הסרת הסופרנטנט, לאט וטיפתי, הוסיפו חמישה מיליליטר של מדיום תרבית, 10% על גבי כדור הנויטרופילים מבלי להכניס את הנויטרופילים לתרחיף.

סובב בעדינות את הצינור עד שרוב האריתרוציטים הקיימים על גבי כדור הנויטרופילים מושעים מחדש במדיום התרבית. לאחר הסרת הסופרנטנט, השעו מחדש את כדור הנויטרופילים ב-10 מיליליטר של מדיום תרבית, 10%לאחר השעיה מלאה, הוסיפו עד 50 מיליליטר של מדיום תרבית 10% וצנטריפוגה את התערובת לפני השעיה מחדש של הגלולה ב-10 מיליליטר של מלכודת נויטרופילים חוץ-תאית או מאגר בדיקת NET. כדי להתחיל, הוסף תמיסת פולי-L-ליזין של 0.001% לכל באר בצלחת 96 הבארות ודגירה למשך שעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

שטפו את הבארות שלוש פעמים עם 200 מיקרוליטר DPBS וייבשו את הבארות באוויר. לאחר מכן, השעו מחדש את המספר הנדרש של נויטרופילים במלכודת הנויטרופילים החוץ-תאית או במאגר בדיקת NET. העבר צבע DNA מרוכז פי ארבעה במאגר בדיקת NET לכל באר.

הוסף גירויים מרוכזים פי ארבעה של NETosis במאגר בדיקת NET לבארות המתאימות. לאחר מכן, הוסף אנטגוניסטים מרוכזים פי ארבעה של NETosis במאגר בדיקת NET ותרחיף נויטרופילים לבארות המתאימות. צנטריפוגה את הצלחת בחום של 100 גרם למשך שתי דקות.

לאחר מכן, הכנס את הצלחת למערכת ניתוח מיקרוסקופ התאים החיים המונחת בחממה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. לאחר הנחת לוחית ההדמיה של 96 הבארות המכילה תרחיף נויטרופילים במערכת ניתוח מיקרוסקופיה של תאים חיים, פתח את תוכנת המערכת. לחץ על לוח זמנים כדי לרכוש ולחץ על כפתור הפלוס כדי להשיק.

לאחר מכן, בחר סרוק לפי לוח הזמנים ולחץ על הבא. כדי ליצור כלי חדש מאפס, בחר חדש במקטע יצירת כלי ולחץ על הבא. במקטע סוג סריקה, בחר רגיל ולחץ על הבא.

בחר את הגדרות הסריקה כתא אחר תא, ללא. ערוצי תמונה, ניגודיות פאזה בירוק. זמן רכישה, 100 מילישניות ומטרה פי 20.

לאחר מכן לחץ על הבא. במקטע בחירת כלי שיט, בחר את סוג כלי השיט המתאים לסריקה ולחץ על הבא. ציין את המיקום במגירה של הכלי ולחץ על הבא.

בקטע דפוס סריקה, בחר את הבארות שצריך לסרוק ואת מספר התמונות לבאר. לחץ על הבא. במקטע מחברת כלי השיט, ספק מידע על כלי השיט.

הזן את שם הלוחית ולחץ על הבא. במקטע הגדרת ניתוח, בחר דחה את הניתוח למועד מאוחר יותר ולחץ על הבא. במקטע לוח זמנים לסריקה, בחר צור לוח זמנים חדש עם סריקות במרווחי זמן של ובחר שעה אחת במקטע הוסף סריקות לתזמון.

בחר הפסק את הסריקה חמש שעות לאחר הסריקה הראשונה. לחץ על הבא ולחץ על הוסף כדי לתזמן מתי פרטי הסריקה נכונים. לאחר רכישת ניגודיות פאזה ותמונות אימונופלואורסצנטיות של נויטרופילים, הפעל את תוכנת ניתוח מיקרוסקופיה של תאים חיים.

מהתצוגה, בחר את ניסוי המיקרוסקופיה של התא החי לניתוח. בחר Create New Analysis Definition ולחץ על Next. לאחר מכן, בחר מנתח בסיסי מהקטע סוג ניתוח ולחץ על הבא.

באזור Image Channel, בחרו ירוק, בטלו את הבחירה בשלב ולחצו על Next. פתחו את חלון שכבות התמונה, בחרו ירוק ובטלו את הבחירה בשלב. כבה את קנה המידה האוטומטי בחלק הירוק והגדר ידנית את המינימום והמקסימום.

לאחר מכן פתח את חלון זמני סריקת הכלי ובחר את התמונות המייצגות בארות בקרה חיוביות עם NETs. פתח את חלון הגדרות הגדרת הניתוח וכתוב NETs עבור שם האובייקט. עבור הפילוח, בחר מסתגל.

עבור סף GCU, בחר בין שלוש לחמש, והגדר את Edge Split On בין מינוס 10 לאפס. לאחר מכן, לניקוי, בחר מילוי חורים ל-100 מיקרומטר רבוע והתאם את הגודל למינוס פיקסל אחד. מתוך מסננים, בחר שטח גדול מ-200 מיקרומטר רבוע, עוצמה ממוצעת קטנה מ-24.6 ועוצמה משולבת גדולה מ-7,000.

לאחר מכן לחץ על תצוגה מקדימה נוכחית או על תצוגה מקדימה של הכל כדי להחיל את ההגדרות. רחף מעל מבני ה-NET השונים והתאם את הגדרות הניתוח כדי לכוונן את ה-NETs החיוביים השגויים והשליליים השגויים. כאשר ההגדרות עבור ניתוח NET נכונות, לחץ על הבא.

בחר את נקודות הזמן והבארות לניתוח בסעיף זמני הסריקה והבארות ולחץ על הבא. הוסף את שם ההגדרה במקטע שמור והחל הגדרת ניתוח ולחץ על הבא. לחץ על סיום כאשר פרטי הניתוח מאומתים ונכונים.

פתח את ניתוח הניסוי על ידי לחיצה על הניתוח בתוך הכלי המבוקש. לאחר מכן, פתח את חלון מדדי הגרף. לאחר מכן, לחץ על לחצן הפלוס כדי ליצור מדד.

בעת הצגת נתונים כאחוז מפגש נטו, בחר אזור במקטע מדד ובחר מפגש במקטע ערך. בעת הצגת נתונים כאחוז של נויטרופילים NETting, בחר ספירת אובייקטים במקטע מטרי ובחר לכל תמונה במקטע ערך. לאחר קביעת התצורה של הגדרות המדדים, במקטע מדדים המוגדרים על ידי המשתמש, בחר NETs Area Confluence או NETs Object Count Per Image.

בחר את כל נקודות הזמן והבארות הנדרשות לניתוח מהסעיפים בחר סריקות ובחר באר בהתאמה. לבסוף, לחץ על ייצוא נתונים. גירוי סידן יונופור גרם ל-NETosis מהיר יותר בהשוואה ל-PMA, מה שהביא לשיעור גבוה יותר של נויטרופילים לשחרר NETs.

NETs המושרים על ידי יונופורים של סידן היו מפוזרים יותר מעבר לקרום הפלזמה של הנויטרופילים, בעוד ש-NETs המושרים על ידי PMA נותרו קרובים יותר לקרום הפלזמה של הנויטרופילים. מגמה של רמות NET גבוהות נצפתה כאשר נויטרופילים הופעלו עם קומפלקסים חיסוניים מצופים, FMLP וגבישי מונוסודיום אוראט. שחרור NET בתגובה ל-23187 עוכב לחלוטין על ידי CIT-013 בריכוז מעכב חצי מקסימלי של 4.6 ננו-מולר.