בקרה מרחבית-זמנית של פעילות החלבונים באמצעות ויסות אלוסטרי אופטוגנטי

המחקר הכולל שלנו מתמקד בפיתוח שיטות אופטוגנטיות המשיגות בקרה מרחבית-זמנית מדויקת של פעילות החלבונים על ידי אור. אנו מהנדסים תחומים הניתנים לוויסות אור הנקראים lightR עבור ויסות אלוסטרי, מה שמאפשר לנו לחקור כיצד פעילות חלבונים מבוקרת מרחבית-זמנית משפיעה על איתות תאי ועל תפקודים המסייעים במידול מחלות פרה-קליני ופיתוח טיפול. האופטוגנטיקה מתמודדת עם מספר אתגרים, כולל השגת בקרה מדויקת והפיכה על פעילות חלבון המטרה וחיקוי מדויק של קינטיקה של איתות אנדוגני.

נושאים מרכזיים הם מניעת הפעלה לא רצויה, הפעלת תת-תאים ממוקדת וניהול רעילות לאור כדי לשמר את כדאיות התא. בנוסף, פיתוח כלים תואמים וחזקים אוניברסליים הוא חיוני לשיפור הרב-תכליתיות והשחזור ביישומים. הפרוטוקול שלנו להנדסת כלי lightR משלב באופן ייחודי תכונות מתקדמות מרובות למערכת אחת, כולל ויסות אלוסטרי, רגישות גבוהה, רזולוציה מרחבית, בקרת זמן הדוקה וספציפיות איתות מדויקת.

אינטגרציה זו מאפשרת כוונון בין חלבוני מטרה מגוונים, תוך מתן מענה לפערים בשיטות אחרות שחסרות אחת או יותר מהיכולות הקריטיות הללו. אנו מעוניינים להגדיר תהליכי איתות ותהליכים מבניים מרכזיים המווסתים את נדידת התאים. אנו שואפים להשתמש בטכנולוגיה האופטוגנטית שלנו כדי לנתח תקנות של נדידת תאי אנדותל ואינטראקציות.

להבין כיצד עיצוב מחדש של המטריצה החוץ תאית מתווך על ידי תאי אנדותל, ולקבוע כיצד חוסר ויסות של תהליכים אלה תורם להתפתחות המחלה. לאנליזה ביוכימית של צלחת קינאזות קלות פי 10 בחזקת שישה תאי לין XE עבור צלחת תרבית תאים של 3.5 סנטימטרים לכל קבוצת ניסוי, דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ופחמן דו חמצני של 5% במשך 16 עד 18 שעות. למחרת, להדביק את התאים עם מבנה ה- DNA שנבחר באמצעות מגיב transfection מתאים.

מכסים את המנה ברדיד אלומיניום ומחזירים אותה לאינקובטור. לאחר 16 עד 18 שעות של טרנספקציה, מקם מערכת מנורות פאנל LED בגודל 465 ננומטר בתוך אינקובטור תרבית הרקמות. מקם לוח פרספקס מחורר 10 ס"מ מעל המנורה כדי להשיג הארה של שלושה מילי וואט לסמ"ר.

השתמש בתאורה רציפה בתאים המבטאים LightR-Src ו- D388 R-LightR-Src. הפעל וכבה את לוח ה-LED באופן ידני כדי לשלוט בתאורה. בסוף נקודות הזמן של הניסוי, קצרו את התאים באור אדום בטוח, שאפו את המדיה ושטפו את התאים עם PBS קר.

הארה גלובלית של תאי lin XE עם LightR-Src מהונדס במשך 60 דקות מראה זרחן של מצעי Src, פקסילין אנדוגני, ותאי p130Cas המבטאים את המוטציה הקטליטית הלא פעילה D388 RLightR-Src לא מראה זרחן של מצעי Src בתאורה גלובלית. כדי להתחיל, צלחת פעמיים 10 בחזקת חמישה תאי הלה לכל צלחת תרבית רקמה 35 מילימטר במדיה תרבית תאים. לדגור על התאים במשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.

לאחר שהתאים התחברו והגיעו למפגש של 60% עד 70%, יש להדביק את תאי ההלה עם התערובת הנתונה. כסו את הצלחת ברדיד אלומיניום כדי למנוע הארה מקרית של התאים. לאחר מכן לדגור על התאים במשך 16 עד 18 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ופחמן דו חמצני של 5%.

לאחר מכן, מניחים כוסות מכוסות בקוטר של 25 מ"מ ועובי של 0.17 מ"מ לתוך תא צלחת שש באר. מצפים שלושה כיסויי זכוכית עגולים עם חמישה מיליגרם לליטר פיברונקטין ב-PBS ודוגרים ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר מכן שטפו את החלקות הכיסוי עם PBS 16 עד 18 שעות לאחר ההעברה.

אספו את תאי ההלה הנגועים באור אדום בטוח, ואז השמיעו בערך פעם אחת 10 בחזקתם של חמישה תאי הלה נגועים על כל כיסוי תחת אור אדום בטוח. מכסים את הצלחת ברדיד אלומיניום ודגרים בתרבית תאים במשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. לאחר מכן, לחמם את מדיה הדמיה מוכן שמן מינרלי ל 37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן שטפו את פתקי הכיסוי המכילים את התאים עם PBS פעמיים. לאחר צביעה ושטיפת התאים, הניחו בזהירות את החלקת הכיסוי לתוך תא הדמיה של תאים חיים. הוסף מיליליטר אחד של מדיית הדמיה L15 לתא.

הוסיפו מיליליטר אחד של שמן מינרלי שחומם מראש למדיה כדי למנוע אידוי במהלך ההדמיה. שמור על התא מוגן מפני אור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שהוא מוכן לתמונה. הניחו את החדר על במת מיקרוסקופ שחומם מראש ל-37 מעלות צלזיוס.

בחר תא בודד המבטא הן דובדבן LightR-Src מהיר והן Src IRFP. בחר אזורי עניין ספציפיים בתוך התא להארה. עבור מחקר זה, בחר אזור קטן בשולי התא שנבחר.

דמיינו את התא שנבחר כל דקה במשך 20 דקות במצב הבסיסי לפני ההארה. המשך בהדמיה במשך 50 דקות תוך כדי תאורה מקומית ולאחר מכן 20 דקות לאחר ההפעלה למשך 90 דקות בסך הכל. לאחר ההדמיה, שמור את הסרטים בפורמט קובץ מחסנית tif לניתוח.

הארה גלובלית של תאי הלה הובילה ללוקליזציה של LightR-Src מהיר להידבקויות מוקדיות, שהתהפכו ברגע שהאור הכחול כבה. תאורה זו גרמה גם לעלייה משמעותית בהתפשטות התאים, שנעצרה ברגע שהאור הכחול כבה. המוטציה הקטליטית הלא פעילה D388 R-LightR-Src לא הראתה התפשטות תאים.

הארה מקומית של תאי הלה המבטאת LightR-Src מהירה הביאה להצטברות המבנה בהידבקויות מוקדיות, מה שהוביל לבליטות קרום מקומיות עם הארה של 50 דקות. לא נצפתה עלייה נוספת בשטח בחושך של 20 דקות לאחר ההארה. Fast LightR-Src נעלם בהדרגה מההידבקויות מוקדיות בשלב החשוך.

צנטרויד התא נע לכיוון האזור המואר. לאחר הפעלה מהירה של LightR-Src, המציינת תנועת תא מכוונת.