Name: בקרה מרחבית-זמנית של פעילות החלבונים באמצעות ויסות אלוסטרי אופטוגנטי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: למדו לשלוט בפעילות חלבונים באופן מרחבי-זמני באמצעות מתג אלוסטרי אופטוגנטי LightR. השיטה מאפשרת שליטה הפיכה באור כחול בקינאז Src ובחקר דינמיקת תאי HeLa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>בקרה אופטוגנטית של פעילות האנזים באמצעות מתג אלוסטרי מווסת אור

<table><tbody><tr><td>#1.5 כיסויי זכוכית 25 מ"מ עגולים</td><td>וורנר אינסטרומנטס&nbsp;</td><td>64-0715&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינורות&nbsp;</td><td>ארה"ב מדעית&nbsp;</td><td>cc7682-3394</td><td></td></tr><tr><td>2x מאגר</td><td></td><td></td> Laemmli <td>עבור 500 מ"ל: 5.18 גרם של&nbsp; Tris-HCL, 131.5 מ"ל גליצרול, 52.5 מ"ל של 20% SDS, 0.5 גרם ברומופנול כחול, pH סופי 6.8</td></tr><tr><td>4-20% Mini-PROTEAN TGX ג'ל טרומי</td><td>Biorad</td><td>4561096</td><td></td></tr><tr><td>5x Phusion Plus Buffer&nbsp;</td><td>תרמו סיינטיפיק&nbsp;</td><td>F538L</td><td></td></tr><tr><td>60 LED מיקרוסקופ טבעת אור</td><td>בולי אופטיקה</td><td>ML46241324</td><td>כחול LED, קוטר 60 מ"מ, 5 W</td></tr><tr><td>אגרוז&nbsp;</td><td>GoldBiotech</td><td>A-201</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ERK 1/2 איתות</td><td>תאי</td> נוגדן <td>9102</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן Anti-GAPDH</td><td>invitrogen</td><td>AM4300</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP</td><td>Clontech</td><td>632380</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mCherry Anti-Cherry Antibody</td><td>invitrogen</td><td>M11217</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MEK</td><td>איתות תאים</td><td>9122</td><td></td></tr><tr><td>Anti-p130Cas</td><td>BD Biosciences</td><td>610271</td><td></td></tr><tr><td>איתות תאים אנטי-פקסילין</td><td></td><td>2542</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-פוספו-ERK 1/2 T202/Y204</td><td>איתות תאי</td> נוגדנים <td>9101</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-פוספו-pY249 p130Cas</td><td>איתות תאים</td><td>4014</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-פוספו-Y118</td><td>איתות תאי</td> פקסילין <td>2541</td><td></td></tr><tr><td>תא אנטו-פוספו-S217/221 MEK</td><td> איתות</td><td>9121</td><td></td></tr><tr><td>Arduino תואם ספק כוח</td><td>מחשב ארגוני</td><td>LJH -186</td><td></td></tr><tr><td>Arduino Uno Rev3</td><td>Arduino</td><td>&lrm; </td><td></td>A000066</tr><tr><td>Attofluor Cell Chamber</td><td>invitrogen</td><td>A7816</td><td></td></tr><tr><td>Benchmark סרום בקר עוברי (FBS)&nbsp;</td><td>Gemini Bio-products</td><td>100-106</td><td>משולש 0.1 ומיקרו מומת בחום; M מסנן סטרילי&nbsp;</td></tr><tr><td>bRaf-V600E-Venus</td><td></td><td></td><td>מתנה מד"ר ג'ון אובריאן, MUSC</td></tr><tr><td>BSA&nbsp;</td><td>גולד ביוטק</td><td>A-420&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>קרבניצילין (דיסודיום)</td><td>Gold Biotechnology</td><td>C-103-25</td><td></td></tr><tr><td>CellMask צבע ממברנת פלזמה אדום עמוק</td><td>invitrogen</td><td>c10046</td><td></td></tr><tr><td>Colony Screen MasterMix&nbsp;</td><td>Genesee</td><td>42-138</td><td></td></tr><tr><td>DH5a תאים מוכשרים&nbsp;</td><td>נב&nbsp;</td><td>C2987H</td><td></td></tr><tr><td>DMEM&nbsp;</td><td>קורנינג&nbsp;</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>סולם DNA&nbsp;</td><td>גולד ביו&nbsp;</td><td>D010-500</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs&nbsp;</td><td>NEB</td><td>N04475</td><td></td></tr><tr><td>Dpn1 אנזים&nbsp;</td><td>NEB</td><td>R01765</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>GoldBio</td><td>DTT10</td><td>DL-Dithiothreitol, ריאגנטים של קלילנד&nbsp;</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>אקרוס&nbsp;</td><td></td><td></td>409910250</tr><tr><td>FastLightR-bRaf-mVenus</td><td>Addgene</td><td>#162155</td><td></td></tr><tr><td>פיברונקטין מפלזמת בקר&nbsp;</td><td>סיגמא&nbsp;</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE(R) 6 מגיב טרנספקציה&nbsp;</td><td>Promega</td><td>E2692</td><td>מגיב טרנספקציה</td></tr><tr><td>ג'ל צבע חומצת גרעין ירוקה&nbsp;</td><td>GoldBio</td><td>G-740-500</td><td></td></tr><tr><td>צבע סגול לטעינת ג'ל 6x&nbsp;</td>ערכת מיצוי ג'ל <td>NEB</td><td>B7024A</td><td></td></tr><tr><td>GeneJET&nbsp;</td><td>תרמו סיינטיפיק&nbsp;</td><td>ערכת מיצוי ג'ל</td> <td>K0692</td>&nbsp;</tr><tr><td>ערכת GeneJET פלסמיד מיני-פרפ</td><td>תרמו מדעי&nbsp;</td><td>K0502</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>GlutaMAX-l (פי 100) 100 מ"ל&nbsp;</td></tr><tr><td>תאי HEK 293T&nbsp;</td><td>ATCC&nbsp;</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>תאי HeLa&nbsp;</td><td>ATCC&nbsp;</td><td>CRM-CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fischer&nbsp;</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Iot ממסר</td><td>לוגרים דיגיטליים</td><td>DLI 705020645490</td><td>ממסר בקרת AC/DC לתאורה:</td></tr><tr><td>Kanamycin Monosulfate</td><td>Gold Biotechnology</td><td>K-120-25</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P-4504</td><td></td></tr><tr><td>L-15 1x</td><td>קורנינג&nbsp;</td><td>10-045-CV&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ל.ב. אגר&nbsp;</td><td>פישר</td><td>BP1425-2</td><td></td></tr><tr><td>מערכת תאורת גידול LED</td><td>HQRP</td><td>884667106091218</td><td>מערכת מנורות פאנל LED&nbsp;</td></tr><tr><td>LightR-bRaf-mVenus</td><td>Addgene</td><td>#162154</td><td></td></tr><tr><td>LightR-iCre-miRFP670</td><td>Addgene</td><td>#162158</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>R2024a</td><td>תוכנה להפעלת CellGEO Scripts</td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Imaging Analysis Software MgCl</td></tr><tr><td>2&nbsp;</td><td>פישר כימיקל</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>שמן מינרלי</td><td>סיגמא&nbsp;</td>ערכת <td>M5310</td><td></td></tr><tr><td>MiniPrep&nbsp;</td><td>בחירת גנים&nbsp;</td><td>96-308</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX ג'לים טרומיים 12 בארות</td><td>Bio-Rad</td><td>4561085</td><td></td></tr><tr><td>ביולוגיה מולקולרית בדרגת מים&nbsp;</td><td>קורנינג&nbsp;</td><td>46-000-CV&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>מראה פוליכרואית רב-פס</td><td>89903BS</td><td>Chroma</td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>פישר כימיקלים</td><td>S271-3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PBS עם Ca ו-Mg&nbsp;</td><td>קורנינג&nbsp;</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-iCre</td><td>Addgene</td><td>#89573</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1_Floxed-STOP mCherry</td><td>Addgene</td><td>#122963</td><td></td></tr><tr><td>pCEFL-ERK2</td><td></td><td></td><td>מתנה מהמעבדה של ד"ר צ'אנינג דר,</td></tr><tr><td>צינורות UNC PCR&nbsp;</td><td>labForce</td><td>1149Z65</td><td>0.2 מ"ל צינורות וכובעים עם 8 רצועות, רצועה קשיחה מחוברת בנפרד מכסי כיפה&nbsp;</td></tr><tr><td>Phusion Plus DNA פולימראז</td><td>תרמו מדעי&nbsp;</td><td>F630S</td><td></td></tr><tr><td>pmiRFP670-N1</td><td>Addgene</td> <td>#79987</td><td></td></tr><tr><td>Polygon 400 Pattern Illuminator</td><td>Mightex</td><td>DSI-G-00C</td><td></td></tr><tr><td>פריימרים&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PVDF ממברנות</td><td>BioRad</td><td>1620219</td><td>Immun-Blot PVDF/כריכי נייר פילטר&nbsp;</td></tr><tr><td>T0.25% טריפסין, 2.21 מ"מ, eDTA, 1x [-] נתרן</td><td>קורנינג&nbsp;</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Tris-אצטט-EDTA (TAE) 50x&nbsp;</td><td>פישר&nbsp;</td><td>BP1332-1&nbsp;</td><td>לאלקטרופורזה&nbsp;</td></tr><tr><td>UPlanSApo 40x מיקרוסקופ אובייקטיבי</td><td>אולימפוס</td><td>1-U2B828</td><td></td></tr><tr><td>USB TTL תיבת</td><td>מכשירים לאומיים</td><td>6501</td><td>לממשק TTL</td></tr><tr><td>&בטא;-מרקפטואתנול</td><td>פישר כימיקלים&nbsp;</td><td>O3446I-100</td><td></td></tr></tbody></table>

בקרה מרחבית-זמנית של פעילות החלבונים באמצעות ויסות אלוסטרי אופטוגנטי

Spatiotemporal Control of Protein Activity through Optogenetic Allosteric Regulation

LightR-Src מתוכנן ונוצר בהתאם לאסטרטגיה המתוארת באיור 1A,B. ניתוח ביוכימי של LightR-Src ניגש לזרחון של מצעי Src אנדוגניים ידועים, p130Cas (Y249)22 ופקסלין (Y118)23 בתגובה לאור כחול ב-60 דקות של הארה רציפה (איור 2B). יש לציין כי לא נצפתה הפעלת רקע של Src קינאז כאשר LightR-Src מתבטא רק בחושך במשך 16-18 שעות לאחר הטרנספקציה. יתר על כן, המוטציה הלא פעילה קטליטית של LightR-Src עם מוטציית D388R אינה גורמת לזרחון של מצע Src, מה שמדגים שהזרחן מתבצע על-ידי LightR-Src פעיל ולא נגרם על-ידי השפעה לא ספציפית של תאורת אור כחול (איור 2B). בהסתמך על דיווחים על פעילות תנודתית של קינאז Src27 בתאים חיים, חקרנו אם ניתן לכוונן את LightR-Src כך שיפגין הפעלה מחזורית. LightR-Src המקורי הציג קינטיקה של השבתה איטית (איור 2C), מה שגרם ליצירת גרסה חדשה, Fast-LightR-Src, המכילה את מוטציית I85V בשני ה-VVD. איור 2D ממחיש ש-Fast-LightR-Src מראה קינטיקה של השבתה מהירה יותר באופן משמעותי, ומשבית לחלוטין תוך 10 דקות מרגע כיבוי האור, בהשוואה ליותר משעה עבור LightR-Src. באמצעות FastLightR-Src הצלחנו גם להשיג מחזורים חוזרים ונשנים של הפעלה/אי-הפעלה (איור 2E). תוצאות אלה מדגימות באופן קולקטיבי את יכולתו של כלי LightR להשיג ויסות ספציפי ומבוקר היטב של פעילות Src בתאים חיים.
היישום של FastLightR-Src מאפשר גם להעריך את ההשפעות של הפעלת Src חולפת על מורפודינמיקה של תאים. הפעלה של FastLightR-Src בתאי HeLa גורמת להתפשטות תאים, ותהליך זה נעצר ברגע ש- FastLightR-Src מושבת. עם ההפעלה, צפינו בטרנסלוקציה של FastLightR-Src מהתא הפרי-גרעיני להידבקויות מוקדיות וקרום פלזמה, התנהגות שהוצגה על-ידי קינאז Src11,12 מסוג פראי. תאים מאירים המבטאים את המוטציה הלא פעילה קטליטית D388RLightR-Src אינם מראים השפעות התפשטות כאלה (איור 3B,C). זה עוד מאשר כי FastLightR-Src מתפקד באופן דומה למקבילו מסוג פראי. הארה מקומית של אזור התא גורמת להפעלה מקומית של FastLightR-Src המסומנת על ידי הצטברות מקומית LightR Src בהידבקות מוקדית ומלווה בהיווצרות בליטות קרום מקומיות (איור 4B (i), (ii)) והיסט צנטרויד התא (איור 4C (i), (ii)) וכתוצאה מכך תנועת התא לכיוון האור. לאחר שביססנו את היישום של כלי LightR לרגולציה של קינאז Src, אנו מציגים את השירות הרחב של LightR המורחב לרגולציה של bRaf kinase ו- DNA recombinase Cre. ניתוח של LightR-bRaf מראה זרחן המושרה על ידי אור של המצע האנדוגני של bRaf, MEK1, וזרחן במורד הזרם של קינאזות ERK1/224,25 ברמות דומות לאלה של מוטנט bRaf פעיל באופן מכונן (V600E) (איור 5A). לעומת זאת, D575RLightR-bRaf שאינו פעיל קטליטית אינו מדגים זרחן MEK1 ו-ERK1/2, בדומה לדגימות LightR-bRaf שאינן מוארות, ובכך מאשר את הספציפיות של ויסות LightR-bRaf. הדמיית תאים חיים הראתה כי מחזורים חוזרים ונשנים של הפעלה/אי-הפעלה של FastLightR-bRaf גורמים לטרנסלוקציה חוזרת ונשנית של ERK2 בתוך הגרעין ומחוצה לו, מה שמאשש את התוצאות הידועות של הפעלת bRaf28 (איור 5B). ההפעלה של LightR-Cre גורמת לרקומבינציה מוצלחת של גן mCherry reporter, ומדגימה את הישימות של LightR על סוגים שונים של אנזימים (איור 5C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67261/67261fig01.jpg"> 
איור 1: אסטרטגיית פיתוח של גישת LightR. (A) מבנים גבישיים של שני מונומרים חיים במצב כהה (PDB: 2PD7) ודימר במצב מואר (PDB: 3RH8). (B) ייצוג קריקטורה של עיצוב LightR. שני פוטורצפטורים VVD מחוברים זה לזה המוחדרים לתחום הקטליטי משבשים את הפעילות הקטליטית של החלבון בחושך. דימריזציה של VVD בתגובה לאור כחול משחזרת את פעילות החלבון. (C) מבנים גבישיים של (i) Src (PDB 1Y57), ו-(ii) bRaf (PDB 4MNF) תחומים קטליטיים. (ii) מבנה של Cre recombinase (PDB 1MA7). חיצים צהובים מציינים את אתר החדרת LightR ומציינים חומצת אמינו חלופית. (D) דיאגרמה סכמטית של אסטרטגיית שיבוט להחדרת תחום LightR לרצף אנזימי מטרה19. בשלב 1, פריימרים שתוכננו במיוחד משמשים לסינתזה PCR של מקטע LightR שמשני צדדיו אתרים המחושלים בגן המטרה לפני ואחרי אתר ההחדרה. בשלב 2, מקטע LightR שנוצר כך מוצג כמשמש כ"מגה-פריימר" להחדרת LightR לגן אנזים המטרה על ידי מוטגנזה מכוונת אתר לשינוי מהיר. לוחות A-C הותאמו ושונו באישור Shaaya et al.10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/67261fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67261/67261fig02.jpg"> 
איור 2: אפיון ביוכימי של חלבוני LightR מהונדסים. (A) ייצוג סכמטי של פרוטוקול ניסויי לאפיון ביוכימי של LightR Src. (B) תאי LinXE המבטאים באופן ארעי את מבנה LightR Src הנושא mCherry ותג myc במסוף C הוארו ברציפות באור כחול במשך 60 דקות, באמצעות מערך LED של 465 ננומטר. ליזטים של תאים נבדקו עבור זרחן של מצעי Src, פקסילין ו-p130Cas. תוצאות Western Blot מראות זרחן של פקסילין אנדוגני ו-p130Cas בתגובה להפעלת LightR-Src בתאים חיים. (ג,ד) תאי LinXE המבטאים באופן ארעי את מבני LightR-Src שצוינו הנושאים תג mCherry-myc טנדם במסוף C נחשפו ברציפות לאור כחול לזמנים מוגדרים (0 דקות ו -30 דקות) ולאחר מכן הונחו בחושך לפרקי זמן שצוינו. ליזטים של תאים נבדקו עבור זרחון של מצעי Src, והראו את ההשוואה של קינטיקה הפעלה ונטרול בין (C) LightR-Src ו (D) FastLightR-Src. (E) תאי LinXE המבטאים באופן ארעי את מבני LightR-Src שצוינו הנושאים תג mCherry-myc טנדם במסוף C נחשפו ברציפות לאור כחול במשך 20 דקות ולאחר מכן דגירה חוזרת ונשנית בחושך במשך 10 דקות ובאור במשך 20 דקות. ליזטים של תאים נאספו ונבדקו עבור זרחן של מצעי Src, והראו את היעילות של מחזור קינאז Src בין מצבי הפעלה ואינאקטיבציה. כל הניסויים חזרו על עצמם לפחות שלוש פעמים עם תוצאות דומות. המספרים המוצגים לצד כל לוח כתם מערבי B-E מייצגים את המשקלים המולקולריים של החלבונים, הנמדדים בקילודלטונים (kDa). לוחות B-E הותאמו ושונו באישור Shaaya et al.10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/67261fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67261/67261fig03v3.jpg"> 
איור 3: בקרת תאורה גלובלית וזמנית והשפעה על פעילות FastLightR-Src. (A) ייצוג קריקטורה של סכמת הניסוי של תאורה מחזורית גלובלית וזמנית וניתוחי הנתונים הבאים. (ב,ג) ויסות המורפולוגיה של התא ולוקליזציה של FastLightR-Src על ידי אור כחול מתואר בתמונות מייצגות של תאי HeLa המתקבלות מסדרת קיטועי זמן באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב שדה. תאים אלה ביטאו באופן זמני את FastLightR-Src-mCherry-myc (N = 10 תאים) או D388RLightR-Src-mCherry-myc (N = 9 תאים) יחד עם Stargazin-iRFP670 (סמן קרום פלזמה). הדמיה של תאים חיים בוצעה כל דקה בזמן שהתאים היו מוארים באור כחול (קווי מתאר כחולים). (B) חיצים צהובים מדגישים לוקליזציה של FastLightR-Src במבנים הדומים להידבקויות מוקד. התמונות התקבלו מסדרה של תאי HeLa בהילוך מהיר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב שדה. (C) כימות השינויים בשטח התא הנגרמים על-ידי הפעלה של FastLightR-Src לעומת D388RLightR-Src מוצג בכל לוח. חלון התאורה מסומן כמלבנים כחולים. גרפים מייצגים רווח בר-סמך ממוצע ± 90%. לוחות B ו-C הותאמו ושונו באישור Shaaya et al.10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/67261fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67261/67261fig04.jpg"> 
איור 4: בקרת תאורה תת-תאית מקומית והשפעה על פעילות FastLightR-Src. (A) ייצוג מצויר של סכמה ניסיונית של בקרת תאורה תת-תאית מקומית. (B) (i) רצף קיטועי זמן הממחיש תא HeLa המבטא FastLightR-Src-mCherry, מואר מקומית באור כחול (מתואר על ידי עיגול כחול). התמונות צולמו בכל דקה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת (60x אובייקטיבי). התמונות מוצגות כתמונות ניגודיות הפוכות המתקבלות בפרקי זמן מוגדרים. (ii) תמונות הקרנה של תאים המציגות בליטות שנוצרו בפרקי זמן מוגדרים. סף ומיסוך המורפולוגיה של התא על ציר הזמן הניסויי מייצג את הפלטפורמה לניתוח התפשטות התא והדינמיקה של קצה התא. האזור המואר שצוין בתא מסומן בעיגול כחול. (C) (i) תרשים קוטבי לתאים המייצגים את מרחק הנדידה של הצנטרויד (d) ואת זווית הסטייה (θ) ביחס לתאורת האור הכחול המקומית. נקודות שחורות מייצגות תאי HeLa בודדים המבטאים D388RLightR-Src (N = 6 תאים) או FastLightR-Src (N = 10 תאים). (ii) ייצוג סכמטי המדגים את מרחק ההסטה הצנטרואידי (d) שעבר הצנטרואיד של התא מההתחלה (1) ועד לסיום (2) של גירוי מקומי של אור כחול. זווית הסטייה (θ) מציינת את מידת הסטייה של התנועה הצנטרואידית של התא ממיקום האור הכחול. ההצללה האפורה בהירה מציינת את האזור הבולט על-ידי התא בתגובה לגירוי FastLightR-Src מקומי. האזור המואר שצוין של התא מסומן על ידי עיגול כחול מלא. לוחות B ו-C הותאמו ושונו מ-Shaaya et al.10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/67261fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67261/67261fig05.jpg"> 
איור 5: ישימות רחבה של גישת LightR. (א) רגולציה של LightR-bRaf. תאי LinXE המבטאים באופן ארעי את LightR-bRaf-Venus, D575R LightR-bRaf Venus שאינו פעיל באופן קטליטי, או bRaf פעיל באופן מכונן (V600E)-Venus נחשפו לאור כחול רציף למשך פרק הזמן שצוין. תאים lysates נבדקו עבור phosphorylation של חלבונים מסומנים. (B) תמונות מייצגות שהתקבלו מסדרה בהילוך מהיר של דימות תאים חיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב שדה ממחישות את ויסות תגובת האור הכחול הגלובלית בתאי LinXE המבטאים באופן ארעי את FastLightR-bRaf-Venus ו-mCherry-ERK2. תאים אלה הוארו ברחבי העולם באור כחול (50 מילישניות פולסים בכל שנייה, 50 פעימות לדקה) לפרקי זמן מוגדרים המתוארים בכחול. הדמיה של תאים חיים של mCherry-ERK2 בוצעה בכל דקה. חיצים צהובים מדגישים שלבים של לוקליזציה גרעינית של ERK2 הנגרמת על ידי הפעלת אור כחול של bRaf מהונדס. (C) תאי LinXE הודבקו באופן ארעי יחד עם כתב Floxed-stop-mCherry ו-LightR-Cre-iRFP670. התאים היו נתונים לתנאים חשוכים או לאור כחול פועם (2 שניות דולקות, 10 שניות כבויות) למשך עד 8 שעות. תמונות עבור כל נקודות הזמן של כל ערוץ נרכשו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב שדה (10x אובייקטיבי) בהגדרות זהות והותאמו לרמות בהירות וניגודיות עקביות כדי להקל על השוואה של רמות ביטוי חלבונים בין דגימות. הניסוי חזר על עצמו לפחות שלוש פעמים, והניב תוצאות דומות. הדמות הותאמה ושונתה מ-Shaaya et al.10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/67261fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
טבלה משלימה 1: רצף LightR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
טבלה משלימה 2: תיאור אתרי החדרת LightR ורשימת תיוג לתכנון LightR-Protein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20Table%202.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
טבלה משלימה 3: פריימרים לשיבוט LightR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20Table%203.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
טבלה משלימה 4: תנאי טרנספקציה לאנליזה ביוכימית של פעילות חלבון LightR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20Table%204.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
טבלה משלימה 5: תנאי טרנספקציה לניתוח מבוסס הדמיה של פעילות חלבון LightR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20Table%205.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ משלים 1: תאורה פועמת באמצעות סביבת פיתוח משולבת (IDE). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ משלים 2: הגדרות הארה במיקרוסקופ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20File%202_Updated.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

Optogenetics offers the potential for mimicking complex spatiotemporal control of enzyme activity down to a subcellular resolution. However, most ...

spatiotemporal-control-protein-activity-through-optogenetic

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שיטה לשליטה במרחב ובזמן פעילות GTPase קטן לאור המתואר. שיטה זו מבוססת על heterodimerization FKBP-FRB rapamycin הנגרמת צילום-caging מערכות. אופטימיזציה של הקרנת אור מאפשר הפעלה מבוקרת spatio-temporally של GTPases קטנים ברמה subcellular.

במרחב ובזמן מניפולציה של פעילות GTPase קטן ברמת subcellular ועל לוח זמנים של שניות בתאים חיים

כאן, מוצג הליך להפעלה סלקטיבית של חלבון עצבי עם פולס קצר של אור על ידי קידוד גנטי של חומצת אמינו לא טבעית תגובתית-אור לחלבון עצבי מטרה המתבטא בתאי עצב בתרבית או in vivo.

שליטה אופטית של חלבון עצבי באמצעות חומצות אמינו לא טבעי מקודדים גנטיים בנוירונים

פרוטוקול זה מתאר אסטרטגיה optogenetic כדי לווסת מיטוגן המופעל חלבון קינאז (MAPK) פעילות במהלך התמיינות תאים והתפתחות עובריים Xenopus . שיטה זו מאפשרת הפעלה הפיכה של המסלול איתות MAPK בתרבית תאים יונקים ועל אורגניזמים חיים תאיים, כמו עוברי Xenopus , עם רזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה.

אור בתיווך אפנון הפוך של מיטוגן המופעל חלבון קינאז נתיב במהלך הבחנה Cell ו<em&gt; קסנופוס</em&gt; התפתחות עובריים

פרוטוקול זה מתאר שיטה מבוססת הדמיה כדי להפעיל באמצעות photoactivatable פפטיד MHC, המאפשר שליטה מדויקת ייתכן של הפעלת תא T לימפוציטים מסוג T.

יכולות בקרה של תא T הפעלה באמצעות אגוניסט Photoactivatable

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנתח-לתא בהעברת מידע מתנדנדות על ידי שליטה optogenetic ולחיות ניטור של ביטוי גנים. גישה זו מספקת פלטפורמה ייחודית לבחון את משמעות תפקודית של תוכניות ביטוי גנים דינמי במערכות רב תאיים.

שיטת Optogenetic לשלוט ולנתח ג'ין תבניות ביטוי באינטראקציות לתא

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע ניסויים אופטוגנטיים לבקרת ביטוי גנים באור אדום ואדום רחוק באמצעות PhyB ו-PIF3. כלולות הוראות שלב אחר שלב לבניית מערכת תאורה פשוטה וגמישה, המאפשרת שליטה על ביטוי גנים או אופטוגנטיקה אחרת באמצעות מחשב.

בניית מערכת תאורה פשוטה ומגוונת לניסויים אופטוגנטיים

שליטה אמינה בתאי יונקים מגיבים לאור דורשת סטנדרטיזציה של שיטות אופטוגנטיות. לקראת מטרה זו, מחקר זה מתאר צינור של בניית מעגלי גנים, הנדסת תאים, פעולת ציוד אופטוגנטי, ובדיקות אימות כדי לתקנן את המחקר של ביטוי גנים המושרה באור באמצעות מעגל גנים אופטוגנטי משוב שלילי כמקרה מבחן.

הנדסה אמינה ושליטה במעגלי גנים אופטוגנטיים יציבים בתאי יונקים

שליטה אופטוגנטית בחילוף החומרים המיקרוביאלי מציעה שליטה דינמית גמישה על תהליכי תסיסה. הפרוטוקול כאן מראה כיצד להגדיר תסיסה מווסתת אור כחול לייצור כימי וחלבון בקנה מידה נפחי שונה.

תסיסה מבוקרת אור לייצור כימיקלים וחלבון מיקרוביאליים

פרוטוקול זה מתאר את השלבים לשימוש בפלטפורמה האוטומטית Lustro לביצוע אפיון תפוקה גבוהה של מערכות אופטוגנטיות בשמרים.

ניסויים באופטוגנטיקה בתפוקה גבוהה בשמרים באמצעות הפלטפורמה האוטומטית Lustro

וידאו זה מדגים את לנתיחה והסרה של בלוטת התימוס העובר, כמו גם הכנת תרבויות vivo לשעבר של 2-dGuo שטופלו התימוס.

הכנת 2-dGuo שטופלו תרבויות איברים קורנית

למדו לשלוט בפעילות חלבונים באופן מרחבי-זמני באמצעות מתג אלוסטרי אופטוגנטי LightR. השיטה מאפשרת שליטה הפיכה באור כחול בקינאז Src ובחקר דינמיקת תאי HeLa.

בקרה מרחבית-זמנית של פעילות החלבונים באמצעות ויסות אלוסטרי אופטוגנטי

גלה סרטונים נוספים