Name: שימוש ב-Mycobacterium smegmatis כאינדיקטור ביולוגי לתנאי גידול מוגבלים באבץ במיקובקטריה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-20T14:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: חקור את ההשפעות הפיזיולוגיות של מגבלת אבץ על Mycobacterium smegmatis ו-Mycobacterium tuberculosis. הפרוטוקול מספק אינדיקטור ביולוגי לתנאי גידול מוגבלים באבץ לחקר אינטראקציות פתוגן-מארח.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה מומן על ידי פרס הקריירה של הקרן הלאומית למדע (NSF) 1844854, פרס החדשנות של איגוד הריאות האמריקאי IA -937538, והמכון הלאומי לבריאות (NIH) NIAID R21 AI109293 ל-S.P. הכתובת הנוכחית של Allexa D. Burger היא מרכז המחקר למדעי הביולוגיה של האוקיינוס השקט, אוניברסיטת הוואי במאנואה, הונולולו, הוואי, ארצות הברית.

Assessing Bioindicator Phenotypes for Zinc Limitation in M. smegmatis

<ol><li>Alloway, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soil+factors+associated+with+zinc+deficiency+in+crops+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Geochem+Health%22%5BJournal%5D)">Soil factors associated with zinc deficiency in crops and humans.</a> Environ Geochem Health. 31 (5), 537-548 (2009).</li>
<li>Middag, R., de Baar, H. J. W., Bruland, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationships+between+dissolved+zinc+and+major+nutrients+phosphate+and+silicate+along+the+GEOTRACES+GA02+transect+in+the+west+Atlantic+ocean%5BTitle%5D)+AND+%22Global+Biogeochem+Cycles%22%5BJournal%5D)">The relationships between dissolved zinc and major nutrients phosphate and silicate along the GEOTRACES GA02 transect in the west Atlantic ocean.</a> Global Biogeochem Cycles. 33 (1), 63-84 (2019).</li>
<li>Corbin, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+chelation+and+inhibition+of+bacterial+growth+in+tissue+abscesses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Metal chelation and inhibition of bacterial growth in tissue abscesses.</a> Science. 319 (5865), 962-965 (2008).</li>
<li>Panina, E. M., Mironov, A. A., Gelfand, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genomics+of+bacterial+zinc+regulons%3A+Enhanced+ion+transport%2C+pathogenesis%2C+and+rearrangement+of+ribosomal+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Comparative genomics of bacterial zinc regulons: Enhanced ion transport, pathogenesis, and rearrangement of ribosomal proteins.</a> Proc Natl Acad Sci. 100 (17), 9912-9917 (2003).</li>
<li>Outten, C. E., O’Halloran, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtomolar+sensitivity+of+metalloregulatory+proteins+controlling+zinc+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Femtomolar sensitivity of metalloregulatory proteins controlling zinc homeostasis.</a> Science. 292 (5526), 2488-2492 (2001).</li>
<li>Merchant, S. S., Helmann, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elemental+economy%3A+microbial+strategies+for+optimizing+growth+in+the+face+of+nutrient+limitation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Micro+Physiol%22%5BJournal%5D)">Elemental economy: microbial strategies for optimizing growth in the face of nutrient limitation.</a> Adv Micro Physiol. 60, 91-210 (2012).</li>
<li>Makarova, K. S., Ponomarev, V. A., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+C+or+not+two+C%3A+recurrent+disruption+of+Zn-ribbons%2C+gene+duplication%2C+lineage-specific+gene+loss%2C+and+horizontal+gene+transfer+in+evolution+of+bacterial+ribosomal+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genom+Biol%22%5BJournal%5D)">Two C or not two C: recurrent disruption of Zn-ribbons, gene duplication, lineage-specific gene loss, and horizontal gene transfer in evolution of bacterial ribosomal proteins.</a> Genom Biol. 2 (9), RESEARCH 0033(2001).</li>
<li>Yutin, N., Puigbò, P., Koonin, E. V., Wolf, Y. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenomics+of+prokaryotic+ribosomal+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Phylogenomics of prokaryotic ribosomal proteins.</a> PLoS One. 7 (5), e36972(2012).</li>
<li>Prisic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+regulates+a+switch+between+primary+and+alternative+S18+ribosomal+proteins+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Zinc regulates a switch between primary and alternative S18 ribosomal proteins in Mycobacterium tuberculosis.</a> Mol Microbiol. 97 (2), 263-280 (2015).</li>
<li>Dow, A., Prisic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+ribosomal+proteins+are+required+for+growth+and+morphogenesis+of+Mycobacterium+smegmatis+under+zinc+limiting+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Alternative ribosomal proteins are required for growth and morphogenesis of Mycobacterium smegmatis under zinc limiting conditions.</a> PLoS One. 13 (4), e0196300(2018).</li>
<li>Chen, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+translation+by+alternative+bacterial+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Selective translation by alternative bacterial ribosomes.</a> Proc Natl Acad Sci. 117 (32), 19487-19496 (2020).</li>
<li>Natori, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fail-safe+system+for+the+ribosome+under+zinc-limiting+conditions+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A fail-safe system for the ribosome under zinc-limiting conditions in Bacillus subtilis.</a> Mol Microbiol. 63 (1), 294-307 (2007).</li>
<li>Gabriel, S. E., Helmann, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+Zur-controlled+ribosomal+proteins+to+growth+under+zinc+starvation+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Contributions of Zur-controlled ribosomal proteins to growth under zinc starvation conditions.</a> J Bacteriol. 191 (19), 6116-6122 (2009).</li>
<li>Wolf, Y. I., Rogozin, I. B., Kondrashov, A. S., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+alignment%2C+evolution+of+prokaryotic+genome+organization%2C+and+prediction+of+gene+function+using+genomic+context%5BTitle%5D)+AND+%22Genom+Res%22%5BJournal%5D)">Genome alignment, evolution of prokaryotic genome organization, and prediction of gene function using genomic context.</a> Genom Res. 11 (3), 356-372 (2001).</li>
<li>Akanuma, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+ribosomal+protein+S14+demonstrated+by+the+reconstruction+of+chimeric+ribosomes+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Evolution of ribosomal protein S14 demonstrated by the reconstruction of chimeric ribosomes in Bacillus subtilis.</a> J Bacteriol. 203 (10), e00599(2021).</li>
<li>Owen, G. A., Pascoe, B., Kallifidas, D., Paget, M. S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc-responsive+regulation+of+alternative+ribosomal+protein+genes+in+Streptomyces+coelicolor+involves+Zur+and+%CF%83R%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Zinc-responsive regulation of alternative ribosomal protein genes in Streptomyces coelicolor involves Zur and σR.</a> J Bacteriol. 189 (11), 4078-4086 (2007).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+depletion+induces+ribosome+hibernation+in+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Zinc depletion induces ribosome hibernation in mycobacteria.</a> Proc Natl Acad Sci. 115 (32), 8191-8196 (2018).</li>
<li>Li, Y., Corro, J. H., Palmer, C. D., Ojha, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+from+remodeling+to+hibernation+of+ribosomes+in+zinc-starved+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Progression from remodeling to hibernation of ribosomes in zinc-starved mycobacteria.</a> Proc Natl Acad Sci. 117 (32), 19528-19537 (2020).</li>
<li>Graham, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+zinc+depletion+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Severe zinc depletion of Escherichia coli.</a> J Biol Chem. 284 (27), 18377-18389 (2009).</li>
<li>Greening, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology%2C+biochemistry%2C+and+applications+of+F420-+and+Fo-dependent+redox+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Physiology, biochemistry, and applications of F420- and Fo-dependent redox reactions.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 80 (2), 451-493 (2016).</li>
<li>Gurumurthy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+F+420+-dependent+anti-oxidant+mechanism+protects+Mycobacterium+tuberculosis+against+oxidative+stress+and+bactericidal+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A novel F 420 -dependent anti-oxidant mechanism protects Mycobacterium tuberculosis against oxidative stress and bactericidal agents.</a> Mol Microbiol. 87 (4), 744-755 (2013).</li>
<li>Patino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autofluorescence+of+mycobacteria+as+a+tool+for+detection+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Autofluorescence of mycobacteria as a tool for detection of Mycobacterium tuberculosis.</a> J Clin Microbiol. 46 (10), 3296-3302 (2008).</li>
<li>Dow, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+limitation+triggers+anticipatory+adaptations+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Zinc limitation triggers anticipatory adaptations in Mycobacterium tuberculosis.</a> PLoS Pathogens. 17 (5), e1009570(2021).</li>
<li>Tobiasson, V., Dow, A., Prisic, S., Amunts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+depletion+does+not+necessarily+induce+ribosome+hibernation+in+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Zinc depletion does not necessarily induce ribosome hibernation in mycobacteria.</a> Proc Natl Acad Sci. 116 (7), 2395-2397 (2019).</li>
<li>Dow, A., Burger, A., Marcantonio, E., Prisic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-omics+profiling+specifies+involvement+of+alternative+ribosomal+proteins+in+response+to+zinc+limitation+in+Mycobacterium+smegmatis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multi-omics profiling specifies involvement of alternative ribosomal proteins in response to zinc limitation in Mycobacterium smegmatis.</a> Front Microbiol. 13, 811774(2022).</li>
<li>Singh, A. K., Reyrat, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+maintenance+of+Mycobacterium+smegmatis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Laboratory maintenance of Mycobacterium smegmatis.</a> Curr Protoc Microbiol. Chapter 10, Unit10C.1(2009).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Sampson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+elicited+by+a+double+Leucine+and+Pantothenate+auxotroph+of+Mycobacterium+tuberculosis+in+Guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immunity%22%5BJournal%5D)">Protection elicited by a double Leucine and Pantothenate auxotroph of Mycobacterium tuberculosis in Guinea pigs.</a> Infect Immunity. 72 (5), 3031-3037 (2004).</li>
<li>Cheeseman, P., Toms-Wood, A., Wolfe, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+properties+of+a+fluorescent+compound+factor420%2C+from+Methanobacterium+strain+M.o.H%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Isolation and properties of a fluorescent compound factor420, from Methanobacterium strain M.o.H.</a> J Bacteriol. 112 (1), 527-531 (1972).</li>
<li>Wayne, L. G., Hayes, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+for+sequential+study+of+shiftdown+of+Mycobacterium+tuberculosis+through+two+stages+of+nonreplicating+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immunity%22%5BJournal%5D)">An in vitro model for sequential study of shiftdown of Mycobacterium tuberculosis through two stages of nonreplicating persistence.</a> Infect Immunity. 64 (6), 2062-2069 (1996).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי אינטרסים.

תרומה מרכזית לפער הידע על יסודות מכניסטיים של Alt-ריבוזומים היא הקושי להשיג תנאים מגבילים Zn2+ במבחנה. עקבות זיהום Zn2+ בסביבת המעבדה נפוץ; לפיכך, השגת תנאי גידול מוגבלים של Zn2+ הניתנים לשחזור היא מאתגרת. זיהום Zn2+ יכול לנבוע ממספר מקורות, אם כי המקור המשמעותי והנפוץ ביותר לזיהום ושונות הוא מהמים האולטרה-טהורים המשמשים לשטיפת כלי מעבדה וייצור מדיה. יש לתחזק כראוי מערכות מים טהורים במיוחד ולשטוף אותן למשך דקה אחת לפני שטיפת כלי מעבדה או שימוש במים למדיה. צלוחיות שאינן נשטפות או נשטפות היטב במים טהורים במיוחד עלולות לגרום לזיהום Zn2+ , וזה יהיה ניכר על ידי צפיפות התאים המוגברת בצלוחיות מסוימות אך לא באחרות מאותה אצווה של ZLM. ניתן להשתמש בצלוחיות חדשות לגמרי כדי להעריך אם מקור הזיהום של Zn2+ הוא מצלוחיות או מדיה בשימוש חוזר. יש לתקן זיהום Zn2+ ב-ZLM על ידי שטיפה מוגברת של פריטים המשמשים לייצור מדיה וסט חומרים ייעודי להכנת ZLM. אם אף אחד מהאמצעים הללו לא מצליח להשיג את הפנוטיפים הביו-אינדיקטורים הצפויים, יש לכמת את [Zn2+] במים טהורים במיוחד וב-ZLM כדי לשלול את האפשרות שמקור המים מזוהם ב-Zn2+. כפי שדווח בעבר, [Zn2+] של ZLM הוא 115 ±-37 ננומטר23, וריכוזים מתחת ל-70 ננומטר ומעל 150 ננומטר הובילו בדרך כלל לפנוטיפים מדוללים של Zn2+ ו-Zn2+ מזוהמים, בהתאמה. עם זאת, הכנת מדיה טובה היא רק גורם אחד המשפיע על התוצאה, ועלול להתרחש Zn2+ לא מספיק או מוגזם עקב הכנה לא נכונה של החיסון ו/או התרבית, כלומר סילוק לקוי של חומר מלא Zn2+ במהלך שלבי הכביסה. כל תרביות M. smegmatis הכלולות כאן הוכנו באותו אופן - תוצאות גידול מזוהמות Zn2+ (ZLM-C) ו-Zn2+ מדולדל (ZLM-D) נכללות כדי להדגיש את השונות שיכולה להתרחש בין קבוצות שונות של מדיה המשתמשות באותה מערכת מים טהורים במיוחד, גם כאשר הניסויים נעשים כהלכה.
כדי להבטיח שתרבית תאים ב-ZLM מניבה פנוטיפים ביו-אינדיקטורים מגבילים Zn2+ הניתנים לשחזור, חשוב לתייג את הצלוחיות באופן ייחודי, להשתמש בהן תמיד לאותו מצב (כלומר, עם ZLM או ZRM), לעקוב אחר צלוחיות על פני שימושים מרובים ולהשליך צלוחיות שנמצאות בסוף מחזור החיים שלהן, או שממשיכות להניב פנוטיפים ביו-אינדיקטורים מזוהמים Zn2+ עם ZLM. הכנה נכונה של החיסון חשובה מאוד להשגת צמיחה מגבילה של Zn2+, מכיוון שהעברת Zn2+ מתאי זרעים שטופים בצורה לא מספקת היא מקור נפוץ לזיהום Zn2+ שיכול להיות קשה לניתוח מ-ZLM מזוהם Zn2+. יש לבחון ולקצור תרביות M. smegmatis לאחר 72 שעות של גידול ב-ZLM (ו-ZRM גדל במקביל). המורפוגנזה והפנוטיפים הביו-אינדיקטורים מבוטאים בין 48-72 שעות; לכן, הערכה או קציר של תרביות למגבלת Zn2+ מוקדם מדי (או מאוחר מדי) עשויים שלא להניב את הפנוטיפ הביו-אינדיקטור המלא. תרביות שהתרוקנו ב-Zn2+ יציגו אורכי תאים הדומים לאלה המזוהמים ב-Zn2+; לפיכך, יש להשתמש בקרינה F420 וב-OD600 כדי להבדיל בין השניים. כמו כן, תרביות מזוהמות ב-Zn2+ עשויות לא תמיד לגדול טוב יותר מחיידקים מוגבלים ב-Zn2+, אך הקרינה של F420 ואורך התא של הסוג הפראי והמוטציה ΔaltRP אמורים לחשוף אם המצב המוגבל ב-Zn2+ מושג.
הדבר נכון גם לגבי M. tuberculosis, שכן אובדן הפנוטיפ הביו-אינדיקטור F420 בתרביות מוגבלות Zn2+ בולט בין 8-10 ימים של גידול ב-ZLM. למרות ש-M. tuberculosis אינו מציג פנוטיפ ביו-אינדיקטור חזק מוגבל Zn2+ כמו M. smegmatis, שיטת הגידול המוצגת כאן שימשה כדי לקשר אובדן של פנוטיפ ביו-אינדיקטור F420 עם צמיחה מוגבלת של Zn2+ באמצעות מבחנים פונקציונליים וטרנסקריפטומיקה הן בזנים האלימים והן בזנים המוחלשים של M. tuberculosis (הפניה23ונתונים שלא פורסמו). לכן, מעקב אחר פלואורסצנציה F420 היא דרך נגישה לנטר ולאמת תנאים מגבילים ביולוגיים של Zn2+ ב-M. tuberculosis. חשוב לציין שהמנגנון המוביל לפלואורסצנציה מופחתת של F420 בתנאים מגבילים של Zn2+ נותר לא פתור, כמו גם ההבחנה האם הקרינה המופחתת נובעת מירידה בשפע של מאגר הקו-אנזים בכללותו או משינוי במצב החמצון שלו מכיוון שרק הצורה המחומצנת פולטת פלואורסצנציה29.
כפי שהודגם כאן, ההכנה של מדיה מגבילה Zn2+ היא ניואנסים, וישנם גורמים רבים שיכולים להשפיע על הריכוז האפקטיבי של יוני Zn2+ במדיה גם כאשר עוקבים אחר אותו פרוטוקול ומשתמשים באותם ריאגנטים. עקבות של Zn2+ ב-ZLM מאפשרים צמיחה וביטוי מספקים של הפנוטיפ המגביל Zn2+. ירידה הדרגתית זו של Zn2+ להשגת מגבלה דומה למודל ויין של היפוקסיה שבו חמצן נצרך בהדרגה על ידי חיידקים הגדלים בבקבוק סגור30. מכיוון שגם היפוקסיה וגם פנוטיפים מוגבלים של Zn2+ תלויים בגידול חיידקים, אם אין מספיק חמצן, או במודל זה, Zn2+, בחיסון או במדיום, חיידקים יפסיקו לגדול לפני שהם יוכלו לעבור את התוכנית המורפוגנית הרלוונטית. לכן, בעוד שזיהום Zn2+ הוא בעיה ברורה יותר כאשר רוצים להשיג מגבלת Zn2+ , דלדול Zn2+ יכול גם להוות בעיה עקב ליקוי הגדילה והטריגר התלוי ב-Zn2+ שהוחמץ במהלך צמיחה פעילה. בנוסף, שימוש בקוראי לוחות מונוכרומטור או מבוססי פילטר עם מצבי קריאה עליונה או תחתונה לעוצמת הקרינה משפיע מעט על אחוז F375/420 המחושב. לכן, ערכים מכל מעבדה עשויים שלא להיות ניתנים להשוואה ישירה לאלה המוצגים כאן, אך הם צריכים להיות דומים ולעקוב אחר אותן מגמות. לפיכך, יש לבצע אופטימיזציה של שיטות ונהלים לייצור ZLM המניב צמיחה מגבילה של Zn2+ עבור כל מעבדה ומערכת מים טהורים במיוחד, ויש להשתמש בפנוטיפים הביו-אינדיקטורים המוצגים כאן כסטנדרט להגדרת תנאים מגבילים של Zn2+.
בשל הקושי לתקנן ולשחזר תנאי גידול מוגבלים של Zn2+, גישה נגישה לעקיפת זיהום Zn2+ היא הוספת חומר כלאט למדיה שהוכנה ללא תוספת Zn2+. עם זאת, גישה זו מבלבלת את התגובה הביולוגית האמיתית למגבלת Zn2+, ולעתים קרובות יוצרת סביבה רעבה ל-Zn2+ ומיקרו-נוטריינטים אחרים. אפילו חומרי כלאט ספציפיים ל-Zn2+ הוכחו כמווסתים את התגובה לרעב ברזל, בנוסף לתגובת השעתוק התלויה ב-Zn2+ ב-M. tuberculosis23. יתר על כן, השימוש בחומרי כלאט דורש טיטרציה ותזמון זהירים כדי למנוע סביבה רעבה מאוד ל-Zn2+ שאינה משקפת את התגובה הביולוגית במהלך המעבר מתנאים מוגבלים של Zn2+ לתנאים מוגבלים של Zn2+ או הגידול המתמשך בסביבות עם זמינות מוגבלת של Zn2+ בחינם. לבסוף, הוספת חומרי כלאט עשויה שלא להיות תואמת ליישומים במורד הזרם (למשל, מקרופאגים או זיהומים בבעלי חיים). מסקנות שונות מהותית הוסקו לגבי הצורה והתפקוד של אלט-ריבוזומים המתקבלים עם חומרי כלאט לעומת דלדול הדרגתי של Zn2+ בתרביות גידול פעיל17,24. מודגשים כאן פנוטיפים שונים הנובעים מהבדלים קלים יחסית בטוהר המים בקבוצות שונות של מדיה, גם כאשר ההליך נעשה כהלכה. המערכת הניתנת לכימות, לשחזור ורלוונטית מבחינה ביולוגית ליצירת אלט-ריבוזומים המוצגת כאן, כלומר בתרבויות טבע מוגבלות Zn2+ ללא הוספת כלאטורים, מציעה שיטה סטנדרטית שתהיה בעלת חשיבות עליונה לאיחוד תרומות ברחבי התחום לקראת הבנה טובה יותר של ביולוגיה חלופית של ריבוזומים.

יון אבץ (Zn2+) הוא מיקרו-נוטריינט חיוני ומרכיב סטנדרטי במדיה מיקרוביולוגית. עם זאת, חיידקים רבים סובלים ממגבלת Zn2+ בסביבה מכיוון שתנאים מגבילים של Zn2+ נפוצים; soil1, marine2, ונישות בתוך המארח3 הן לרוב מוגבלות Zn2+. ככזה, רוב החיידקים פיתחו מנגנונים להתגבר על מגבלת Zn2+ ולשמר תפקוד תאי4. מערכות המעורבות בשמירה על הומאוסטזיס Zn2+ נמצאות תחת בקרת שעתוק הדוקה5 ועוסקות בניקוי Zn2+ באמצעות מערכות ייבוא Zn2+ בעלות זיקה גבוהה, גיוס עתודות Zn2+ סלולריות והחלפת חלבונים מסוימים הקשורים ל-Zn2+ בפרלוגים חלופיים בלתי תלויים ב-Zn2+6. דוגמה לאחרון היא פרלוגים של חלבון ריבוזומלי (RPs) בלתי תלוי ב-Zn2+, שהם מאפיין נפוץ של רגולונים מגיבים ל-Zn2+ בחיידקים4. RPs בלתי תלויים ב-Zn2+ שונים מאוד נבדלים מהפרלוגים המחייבים של Zn2+ שלהם על ידי שיבוש מוטיב CXXC מחייב Zn2+7. יותר ממחצית הגנומים הפרוקריוטיים המרוצפים מכילים לפחות זוג אחד של RPs משוכפלים, כאשר ברבים מהם, RP אחד קושר Zn2+, בעוד שהפרלוג שלו אינו 8. בעוד שסימון C+/C- (המציין את נוכחות/היעדר מוטיב הקישור Zn2+ העשיר בציסטאין) משמש בדרך כלל בהתייחס לזוגות RP פרלוגיים אלה7, RPs בלתי תלויים ב-Zn2+ תוארו גם כגרסאות חלופיות (Alt) של פרלוגים RP ראשוניים (Prim), Zn2+, מכיוון ש-AltRPs משמשים כ-RPs חלופיים לביוגנזה של ריבוזום ב-Zn2+-מצב מוגבל בחיידקים מסוימים וזו מילת מפתח עם יכולת חיפוש טובה יותר9,10,11.
מכיוון שביטוי AltRP מווסת היטב על ידי Zn2+, הגיוני להניח שביטוי AltRP מציע יתירות תפקודית לחלבונים ריבוזומליים תלויי Zn2+ לנוכח מגבלת Zn2+. ואכן, תכונה זו של AltRPs הודגמה עבור חיידק הקרקע המודל Bacillus subtilis, שבו הצמיחה ניצלת במהלך מגבלת Zn2+ על ידי שחרור פני השטח PrimRP L31 והחלפתו ב-AltRP L3112,13. עם זאת, חלק מה-AltRPs הם פרלוגיים ל-PrimRPs הליבה, למשל, S14, כלומר שילובם נדרש במהלך ביוגנזה של ריבוזום12,13. בנייה מחדש של הריבוזום עם AltRPs היא תוכנית מחויבת ועתירת אנרגיה. בעוד ש-AltRPs הליבה הללו עשויים לשמש לשחרור Zn2+ מהריבוזום, ייתכן גם שחלק מה-AltRPs פיתחו פונקציה נוספת בסביבה המוגבלת ב-Zn2+. זה נתמך על ידי ההבחנה ש-AltRPs שונים מה-PrimRPs הפרלוגיים שלהם; הומולוגיה של רצף של גנים AltRP היא לרוב גבוהה יותר בקרב הומולוגים במינים שונים מאשר לרצף הגנים PrimRP הקשור ל-Zn2+ באותו מין7,10. מכיוון שגנים המקודדים AltRPs שונים מאוד נמצאים תחת בקרת שעתוק תלויה ב-Zn2+, הם מוסרים מהלחץ הסלקטיבי המופעל על הסופראופ<רון הריבוזומלי המווסת היטב והשמור היטב class="xref">14. לחץ סלקטיבי מנותק על המידע הגנטי המקודד את המנגנון הריבוזומלי וה-AltRPs חושף את ה-RPs הללו למסלולים אבולוציוניים שונים מאשר ה-PrimRPs ההומולוגיים ויכול לאפשר אבולוציה ספציפית לשושלת של אותו AltRP בחיידקים10,15. קיומם הנרחב של AltRPs בחיידקים והוויסות הגנטי המנותק של RPs ייחודיים אלה מעלה שאלה מעניינת האם שילוב AltRPs בריבוזומים חיידקיים מעניק תכונה מיוחדת לריבוזומים המכילים AltRP (Alt-ribosomes).
מיקובקטריה היא קבוצה אידיאלית של חיידקים לחקר התכונות המכאניסטיות של Alt-ריבוזומים. ראשית, למיקובקטריה יש אופרון altRP שמור מאוד המכיל ארבעה גנים המקודדים AltRPs: S14-2, S18-2, L28-2 ו-L33-28,9. AltRPs מיקובקטריאליים שונים באופן משמעותי מפרלוגי ה-PrimRP שלהם; בכל ארבעת זוגות PrimRP/AltRP, גן AltRP נתון דומה יותר בכל מיני המיקובקטריאליים מאשר לגן PrimRP באותו מין10. אבולוציה ספציפית לשושלת של AltRPs ניכרת גם בתוך מיקובקטריה, כפי שמעידים AltRPs S18-2 ו-L28-2 ב-Mycobacterium tuberculosis ו-M. bovis, המכילים רצפים ייחודיים בקצה C שאינם קיימים במיקובקטריה10. שנית, קבוצה זו של חיידקים קרובים מאוד מכילה חברים לא פתוגניים ופתוגניים שחיים בסביבות מגוונות מאדמה (למשל, M. smegmatis) ועד לאינספור פונדקאים: בני אדם (למשל, M. tuberculosis), בקר (למשל, M. bovis), מימיים (למשל, M. marinum) ועופות (למשל, M. avium), אם להזכיר כמה. האופי השמור מאוד של אופרון altRP במיקובקטריה, האבולוציה הספציפית לשושלת של גנים ספציפיים של AltRP, והסביבות השונות מאוד שבהן חברים בקבוצה זו קיימים מספקים הזדמנות ייחודית לנתח את האבולוציה השמורה והספציפית לשושלת של פונקציית AltRP והתכונות המכאניסטיות של Alt-ribonesmes. למרות השפע של AltRPs בגנומים פרוקריוטיים, תפקידם של AltRPs ו-Alt-ribosomes נחקר רק בכמה חיידקים9,10,11,12,13,16,17,18,19. הקמת מערכת סטנדרטית עם מדדים ספציפיים לאימות תנאי גידול מגבילים של Zn2+ במיקובקטריות תשפר את תוצאות הניסוי ותקדם את ההבנה של אלט-ריבוזומים בתחום חקר הריבוזומים.
Zn2+ הוא מיקרו-נוטריאנט; לכן, עקבות של זיהום Zn2+ בכימיקלים ובמים תורמים לזמינות הביולוגית של Zn2+, גם כאשר הם מושמטים מתכשיר המדיה. כמויות העקבות של Zn2+ הקיימות במים או בכימיקלים יכולות להשתנות באופן דרסטי בין מעבדות, ובכך להשפיע על התוצאה של צמיחה מגבילה של Zn2+. כימות אמפירי של [Zn2+] בכל הכנה עצמאית של מדיה מכביד מדי עבור רוב המעבדות המבצעות בדיקות גידול שגרתיות, אך מנגנון לביטול האפשרות של זיהום Zn2+ במצע הגידול יהיה בעל ערך מהותי. לשם כך, מוצגת כאן שיטה מפורטת להכנת מצע מוגבל Zn2+ (ZLM) מוגדר כימית, כלי גידול ותרביות זרעים לצמיחה מגבילה של Zn2+ וייצור Alt-ריבוזום ב-M. smegmatis ו-M. tuberculosis. מאפיינים מורפוגניים עיקריים (צפיפות תאים נמדדת על ידי OD600, אורך התא והפלואורסצנטיות של קו-אנזים F420) לאחר גידול ב-ZLM משמשים כדי לוודא שהושגה מגבלת Zn2+. קו-אנזים F420 הוא קו-פקטור של דאזפלבין בעל תפקידים חשובים בקטבוליזם ובהגנה מפני עקה חמצונית במתאנוגנים ובמיקובקטריה20,21. חשוב לציין, מיקובקטריות הן אוטו-פלואורסצנטיות כאשר הן מעוררות ב-420 ננומטר בשל השפע של מחלקה זו של קופקטור22. הקשר המולקולרי בין [Zn2+] לפלואורסצנציה F420 נותר לא פתור, אך מעקב אחר פלואורסצנטיות F420 בתרביות הוא אינדיקטור ביולוגי ניתן למעקב ואמין.
ב-M. smegmatis, הפנוטיפים הביו-אינדיקטורים מופיעים בחיידקים מסוג הבר, אך מוטנט מחיקה חסר אופרון altRP אינו עובר את אותה תוכנית מורפוגנית ויכול לשמש כאינדיקטור ביולוגי דיפרנציאלי10. למרות ש-M. tuberculosis אינו עוקב אחר אותה תוכנית מורפוגנית כמו M. smegmatis במהלך מגבלת Zn2+, ל-M. tuberculosis יש תגובה חזקה וגלובלית ל-Zn2+ מגבלה ופנוטיפ ביו-אינדיקטור מרכזי בעקבות שיטה זו23. לפיכך, המערכת המוגדרת כאן מאפשרת לייצר פריים ואלט-ריבוזומים באותם תנאי גידול (כלומר, מגבלת Zn2+), מה שמקל על החיתוך המכניסטי של תפקוד אלט-ריבוזום ותפקידו בעיצוב הפיזיולוגיה של החיידקים. שיטת גידול זו שימשה כדי לפתור את המבנה של Alt-ריבוזומים פעילים ולהדגים את פעילותם התרגומית בסוג בר M. smegmatis24. תמיכה נוספת בכך ששיטת גידול זו ופנוטיפ ביו-אינדיקטור מדגישים את הפונקציונליות הביולוגית של AltRPs במהלך מגבלת Zn2+, ביטוי AltRP נדרש למורפוגנזה התלויה ב-Zn2+ ויש לו השפעה עמוקה על הטרנסקריפטום והפרוטאום של M. smegmatis10,25. אותה שיטה, עם שינויים קלים בכמות החיסון וזמן הדגירה, משמשת ליצירת תרביות מוגבלות Zn2+ של M. tuberculosis9,23. כאן, מפורטים פרוטוקולים ופנוטיפים ביו-אינדיקטורים להשגת צמיחה מגבילה של Zn2+ הן ב-M. smegmatis והן ב-M. tuberculosis, עם דגש על M. smegmatis מכיוון שחיידק זה רגיש יותר לזיהום Zn2+ במדיה והוא נגיש יותר מהפתוגן הגדל לאט.

<table><tbody><tr><td>1000 מ"ל מערכות סינון ואקום, קו סטנדרטי</td><td>VWR</td><td>10040-440</td><td></td></tr><tr><td>125 מ"ל צלוחיות שייקר Erlenmeyer</td><td>Greiner Bio-One</td><td>679501</td><td></td></tr><tr><td>14 מ"ל צינורות תרבית, פלסטיק, עם מכסים דו-מיקומיים</td><td>VWR</td><td>60818-725</td><td></td></tr><tr><td>250 מ"ל צלוחיות שייקר Erlenmeyer</td><td>Greiner Bio-One</td><td>679502</td><td></td></tr><tr><td>40X-1000X מעבדה תרכובת ביולוגית דו-עינית מיקרוסקופ</td><td>Omax</td><td>M82EZ</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינורות ביו-תגובה, סטרילי</td><td>VWR</td><td>76211-286</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינורות צנטריפוגה בעלי ביצועים גבוהים עם מכסי דגל</td><td>VWR</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>Alcojet אבקת ניקוי עם קצף נמוך</td><td>Alconox</td><td>1404</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום ברזל (III) ציטראט, חום</td><td>Thermo Scientific</td><td>AAA1119930&nbsp;</td><td>MW: 265 גרם/מול, עבור תמיסה של 1M הוסף 1.325 גרם עד 5 מ"ל מים טהורים במיוחד; יש לאחסן מוגן מפני אור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס</td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>Thermo Scientific</td><td>J10857-A1</td><td></td></tr><tr><td>סידן D-פנטותנט</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>AC243300050</td><td></td></tr><tr><td>קטלאז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C1345-10G</td><td></td></tr><tr><td>חומצת לימון נטולת מים, גבישי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP339-500</td><td></td></tr><tr><td>דקסטרוז נטול מים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>D14-500</td><td></td></tr><tr><td>Difco Middlebrook 7H9 Broth</td><td>BD Diagnostics</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>DiluPhotometer OD600 לקביעת צפיפות התאים ומבחני ברדפורד</td><td>Implen</td><td>OD600-10</td><td></td></tr><tr><td>GENios FL Microplate Reader</td><td>Tecan</td><td></td><td>הופסק</td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-4</td><td></td></tr><tr><td>Infinite M200 PRO Multimode Microplate Reader</td><td>Tecan</td><td>LGE140213-20BL</td><td></td></tr><tr><td>L-אספרגין</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>AAB2147336&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucine</td><td>Thermo Scientific</td><td>A1231122</td><td></td></tr><tr><td>Macrofire SP CCD מצלמה</td><td>Optronics</td><td></td><td>לשימוש עם מיקרוסקופ אולימפוס</td></tr><tr><td>מגנזיום סולפט heptahydrate</td><td>VWR</td><td>97062-134</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q Direct 8 מערכת טיהור מים</td><td>Millipore</td><td>C85358</td><td></td></tr><tr><td>Moticam X3</td><td>Motic</td><td></td><td>הופסק, הוחלף על ידי Moticam X5 Plus; לשימוש עם מיקרוסקופ מורכב</td></tr><tr><td>חומצה אולאית</td><td>Thermo Scientific</td><td>031997-14</td><td></td></tr><tr><td>אולימפוס BX51 מיקרוסקופ זקוף</td><td>אולימפוס</td><td></td><td>הופסק, הוחלף על ידי BX53M</td></tr><tr><td>אשלגן פוספט, מונו-בסיסי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>חצי מיקרו דו צדדי קוביות פלסטיק חד פעמיות</td><td>VWR</td><td>97000-590</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי, קריסטל</td><td>VWR</td><td>VW1494-01</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S318-500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>מגה פיקסל ביומדיקל</td><td>103170</td><td></td></tr><tr><td>אבץ גופרתי הפטהידרט, גבישי/ACS</td><td>MP ביומדיקל</td><td>219145290</td><td></td></tr></tbody></table>

שימוש ב-mycobacterium smegmatis כאינדיקטור ביולוגי לתנאי גידול מוגבלים באבץ במיקובקטריה

Using Mycobacterium smegmatis as a Bioindicator for Zinc-Limited Growth Conditions in Mycobacteria

חיידקים רבים בונים ריבוזומים חלופיים בתנאי גידול מגבילים של Zn2+ על ידי החלפת חלבונים ריבוזומליים קושרים Zn2+ בפרלוגים בלתי תלויים ב-Zn2+. הגדרת מערכת לחקר הריבוזומים החלופיים הללו הוכחה כקשה מכיוון שזיהום Zn2+ במעבדה נפוץ. כדי לטפל בבעיה זו, לפעמים מוסיפים חומרי כלאט למצע הגדילה, אך גישה זו מרכזת את התגובה הביולוגית להגבלה הדרגתית של Zn2+ וקשורה לתרדמת ריבוזום. כאן, מתוארות הוראות מפורטות להכנת מדיה וזריעה של תרביות לגידול מוגבל Zn2+ ללא הוספת כלאטורים. בעקבות שיטה זו, חיידק המודל, Mycobacterium smegmatis, עובר מורפוגנזה, התלויה בריבוזומים חלופיים. מכיוון שמורפוגנזה ניתנת למעקב ומתרחשת רק בתנאים מגבילים של Zn2+, M. smegmatis יכול לשמש כאינדיקטור ביולוגי לאימות תנאי גידול רלוונטיים מבחינה ביולוגית. מתוארים שלושה פנוטיפים ביו-אינדיקטורים (צפיפות תאים, אורך תא וקואנזים F420 פלואורסצנטי) המצביעים על מגבלת Zn2+ בסוג הבר, ומתוארים שינויים בביו-אינדיקטורים אלה למוטציה מחיקה שאינה יכולה לבנות ריבוזומים חלופיים. מכיוון שקשה לשלוט בזיהום עקבות Zn2+ עבור כל אצווה של מדיה, וכימות מדויק של Zn2+ בכל הכנת מדיה מכביד מדי, מעקב אחר פנוטיפ ביו-אינדיקטור זה הוא דרך נגישה לאמת את ההכנה של מצע גידול מוגבל Zn2+. כדי לסייע בזיהוי תנאים נאותים לצמיחה המגבילה Zn2+ וייצור ריבוזום חלופי, שינויים בפנוטיפים הביו-אינדיקטורים תוארו גם עבור תכשירים מזוהמים Zn2+ או מדוללים מאוד Zn2+ של מדיה מוגבלת Zn2+. מוצגים פרטים נוספים להשגת צמיחה מגבילה של Zn2+ וייצור ריבוזום חלופי ב-M. tuberculosis, יחד עם הפנוטיפ הביו-אינדיקטור הקשור אליו. בסך הכל, ההוראות המפורטות והפנוטיפים הביו-אינדיקטורים המתוארים כאן יעזרו לתקנן את הייצור של ריבוזומים חלופיים פעילים בתרגום במיקובקטריה.

פרוטוקול זה מפרט הכנה של מדיה מוגבלת ב-Zn2+, כלי גידול ותרביות זרעים לייצור ריבוזומים מוגבלים ב-Zn2+ במיקובקטריה. עקבות של Zn2+ מובילים לצמיחה מגבילה של Zn2+ ואנו מתארים תכונות מורפוגניות המשמשות כאינדיקטורים ביולוגיים לאימות מגבלת Zn2+ במבחנה בחיידק המודל, Mycobacterium smegmatis, והפתוגן האנושי M. tuberculosis.

שימוש ב-Mycobacterium smegmatis כאינדיקטור ביולוגי לתנאי גידול מוגבלים באבץ במיקובקטריה

Many bacteria build alternative ribosomes in Zn2+-limiting growth conditions by replacing Zn2+-binding ribosomal proteins with Zn2+-independent paralogs. ...

using-mycobacterium-smegmatis-as-bioindicator-for-zinc-limited-growth

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שחפת Mycobacterium מהווה biofilms סמים סובלניים כאשר בתרבית בתנאים מסוימים. כאן אנו מתארים שיטות culturing מ ' שחפת biofilms וקביעת תדירות persisters סמים סובלניים. פרוטוקולים אלה יהיה שימושי למחקרים נוספים לתוך מנגנוני עמידות לתרופה בתוך: מ ' שחפת.

גידול של שחפת Mycobacterium Biofilms

בדיקות אבחון רגישות מיקרוביאלית הנוכחי מסתמך על צמיחה של planktonic מבודד ב מזין, עשיר תנאים אירוביים. כאן, אנו מעסיקים בינוני חלופה כיח מלאכותית ללמוד הרגישות מיקרוביאלית של Pseudomonas aeruginosa biofilms תחת שני תנאים אירוביים ו microaerophilic נציג נוסף של הריאה סיסטיק פיברוזיס.

שימוש בינוני כיח מלאכותית לבדיקת יעילות אנטיביוטי נגד<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; בתנאי רלוונטיים יותר ריאות סיסטיק פיברוזיס

מקור: Gupta, S., et al. בידוד ואפיון שלפוחיות חוץ-תאיות המיוצרות על ידי מיקובקטריות מוגבלות בברזל. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים את ההליך לתרבית Mycobacterium tuberculosis בתנאים מוגבלים בברזל כדי לגרום ללחץ ברזל ולקדם הפרשת סידרופורים התומכים בהישרדות חיידקים.

גידול Mycobacterium tuberculosis בתנאים מוגבלים בברזל

כאן, אנו מתארים בדיקה פנוטיפית החלה על מסכי תפוקה גבוהה / תוכן גבוה של RNA סינתטי קטן מפריע (siRNA), תרכובת כימית, וספריות מוטציה שחפת Mycobacterium. שיטה זו מסתמכת על זיהוי של שחפת Mycobacterium שכותרתו פלואורסצנטית בתוך תא מארח שכותרתו פלואורסצנטית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית אוטומטית.

בדיקה פנוטיפית מיקרוסקופית לכימות של מיקובקטריה תאית המותאמת להקרנה בתפוקה גבוהה/תוכן גבוה

ה-charcoal agar resazurin assay (CARA) היא שיטה כמותית למחצה, תפוקה בינונית להערכת הפעילות של סוכני בדיקה כנגד מיקובקטריות המשכפלות, אינן משתכפלות או שניהם.  ה-CARA מאפשר הערכה מהירה של פעילות תלוית זמן וריכוז ומזהה פרמטרים שיש לעקוב אחריהם על ידי מבחני יחידת יצירת מושבה (CFU).

ויזואליזציה של Assay Resazurin פחם אגר עבור וכמותיות, ספירת בינוני תפוקה של Mycobacteria

שחפת של פטרת מראה הפקה מוגברת ושחרור של ושלפוחיות של מסחטות בתגובה לתנאי ברזל נמוך. עבודה זו מפרטת פרוטוקול ליצירת תנאי ברזל נמוך ושיטות לטיהור ואפיון של שלפוחיות ומסחטות בקטריאליים שפורסמו בתגובה למחסור בברזל.

בידוד ואפיון מסחטות ושלפוחיות מתוצרת ברזל-בקטריה מוגבלת

פרוטוקול זה מתאר שיטה חזקה לפיתוח ביופילם כדורי. השיטה ניתנת להרחבה לנפחי תרבות שונים, ומאפשרת אימוץ קל למטרות ניסוי שונות. תכנון השיטה מאפשר הערכה איכותית או כמותית של פוטנציאל יצירת הביופילם של מספר מינים מיקובקטריאליים.

גידול ביופילם מיקובקטריאלי כמודל לחקר עמידות מיקרוביאלית

מחקר זה פיתח בדיקה לסינון בתפוקה גבוהה נגד Mycobacterium abscessus עם זן כפול של כתב שנוצר לאחרונה, תוך שימוש בפלואורסצנטיות ולומינסנציה כדי להעריך את כדאיות החיידקים במהירות. פרוטוקול זה יהיה רלוונטי לחוקרים השואפים לסנן תרופות חדשות נגד חיידק עמיד לתרופות.

פיתוח Assay לבדיקת תרופות בתפוקה גבוהה נגד מיקובקטריה

CD4 + T-לימפוציטים לכידת באמצעות שבב Microfluidic פנויה ל-HIV

אסטרטגיות פתוגניים Mycobacterial להישאר ממעטים להבין. קצב הצמיחה האיטי ביותר של מינים, אופי בלתי חדיר של קיר התא, ואת הסכנות של עבודה עם פתוגנים לעשות mycobacteria קשה ללמוד אחראים במידה רבה להבנת העניים שלנו של אורגניזמים אלה. בסרטון זה נדגים את הטכניקה של electroporation, הכוללת תאים העמדת לדחף קצר חשמלי גבוה על מנת לאפשר את כניסתם של ה-DNA. זוהי השיטה הנפוצה ביותר עבור החדרת דנ"א לתוך תאים mycobacterial.

Electroporation של mycobacteria

חקור את ההשפעות הפיזיולוגיות של מגבלת אבץ על Mycobacterium smegmatis ו-Mycobacterium tuberculosis. הפרוטוקול מספק אינדיקטור ביולוגי לתנאי גידול מוגבלים באבץ לחקר אינטראקציות פתוגן-מארח.

שימוש ב-Mycobacterium smegmatis כאינדיקטור ביולוגי לתנאי גידול מוגבלים באבץ במיקובקטריה

גלה סרטונים נוספים