Name: CRISPR-Cas9 תיווך מחיקת גנים בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים שגודלו בתרבית בתנאים נטולי הזנה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 21 s
Description: למדו שיטת CRISPR-Cas9 לעריכת גנים בתאי גזע עובריים אנושיים H9 באמצעות וקטורים לנטיוויראליים. השיטה מאפשרת מחיקת גנים יציבה ללא פגיעה בפלוריפוטנטיות וביכולת ההתמיינות של התאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Jiang, F., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+structures+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 structures and mechanisms.</a> Annu Rev Biophys. 46 (1), 505-529 (2017).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Xue, C., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+repair+pathway+choices+in+CRISPR-Cas9-mediated+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">DNA repair pathway choices in CRISPR-Cas9-mediated genome editing.</a> Trends Genet. 37 (7), 639-656 (2021).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+genome-editing+system+in+human+stem+cells%3A+Current+status+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 genome-editing system in human stem cells: Current status and future prospects.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 9, 230-241 (2017).</li>
<li>Qiu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MYC+regulation+of+D2HGDH+and+L2HGDH+influences+the+epigenome+and+epitranscriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">MYC regulation of D2HGDH and L2HGDH influences the epigenome and epitranscriptome.</a> Cell Chem Biol. 27 (5), 538-550.e537 (2020).</li>
<li>Sheikh, M. A., Ansari, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+mediated+delivery+of+shRNAs+to+hESCs+and+NPCs+using+low-cost+cationic+polymer+polyethylenimine+%28PEI%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Lentiviral mediated delivery of shRNAs to hESCs and NPCs using low-cost cationic polymer polyethylenimine (PEI).</a> J Vis Exp. (183), e63953(2022).</li>
<li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+cost-effective+method+for+screening+of+CRISPR%2FCas9-induced+homozygous%2Fbiallelic+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple and cost-effective method for screening of CRISPR/Cas9-induced homozygous/biallelic mutants.</a> Plant Methods. 14 (1), 40(2018).</li>
<li>Ardah, M. T., Parween, S., Varghese, D. S., Emerald, B. S., Ansari, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saturated+fatty+acid+alters+embryonic+cortical+neurogenesis+through+modulation+of+gene+expression+in+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr+Biochem%22%5BJournal%5D)">Saturated fatty acid alters embryonic cortical neurogenesis through modulation of gene expression in neural stem cells.</a> J Nutr Biochem. 62, 230-246 (2018).</li>
<li>Parween, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher+O-GlcNAc+levels+are+associated+with+defects+in+progenitor+proliferation+and+premature+neuronal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Higher O-GlcNAc levels are associated with defects in progenitor proliferation and premature neuronal differentiation.</a> Front Cell Neurosci. 11, 415(2017).</li>
<li>Parween, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrient-sensitive+protein+O-GlcNAcylation+modulates+the+transcriptome+through+epigenetic+mechanisms+during+embryonic+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci+Alliance%22%5BJournal%5D)">Nutrient-sensitive protein O-GlcNAcylation modulates the transcriptome through epigenetic mechanisms during embryonic neurogenesis.</a> Life Sci Alliance. 5 (8), e202201385(2022).</li>
<li>Varghese, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+modeling+of+hepatogenesis+using+obese+iPSCs-hepatocyte+differentiation+uncovers+pathological+features%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Developmental modeling of hepatogenesis using obese iPSCs-hepatocyte differentiation uncovers pathological features.</a> Cell Death Dis. 13 (7), 670(2022).</li>
<li>Varghese, D. S., Alawathugoda, T. T., Ansari, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine-tuning+of+hepatocyte+differentiation+from+human+embryonic+stem+cells%3A+Growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Fine-tuning of hepatocyte differentiation from human embryonic stem cells: Growth factor.</a> Stem Cells Int. 2019 (5), 5968236(2019).</li>
<li>Jacobs, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+genome+editing+in+na%C3%AFve+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated genome editing in naïve human embryonic stem cells.</a> Sci Rep. 7 (1), 16650(2017).</li>
<li>Cuevas-Ocaña, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-based+optimized+approach+for+rapid+and+efficient+gene+editing+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">A cell-based optimized approach for rapid and efficient gene editing of human pluripotent stem cells.</a> Int J Mol Sci. 24 (3), 12345(2023).</li>
<li>Veres, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+incidence+of+off-target+mutations+in+individual+CRISPR-Cas9+and+TALEN-targeted+human+stem+cell+clones+detected+by+whole-genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Low incidence of off-target mutations in individual CRISPR-Cas9 and TALEN-targeted human stem cell clones detected by whole-genome sequencing.</a> Cell Stem Cell. 15 (1), 27-30 (2014).</li>
<li>Smith, C., Gore, A., Yan, W., Abalde-Atristain, L., Li, Z., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+sequencing+analysis+reveals+high+specificity+of+CRISPR%2FCas9+and+TALEN-based+genome+editing+in+human+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-genome sequencing analysis reveals high specificity of CRISPR/Cas9 and TALEN-based genome editing in human iPSCs.</a> Cell Stem Cell. 15 (1), 12-13 (2014).</li>
<li>Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-target+effects+in+CRISPR%2FCas9-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Off-target effects in CRISPR/Cas9-mediated genome engineering.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 4 (7), e264(2015).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2-מרקפטואתנול&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>38.5 מ"ל, סטרילי + מאושר בחינם פתוח צינורות דקים Ultra-Clear</td><td>Beckman Coulter</td><td>C14292</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>bFGF רקומביננטי אנושי</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0261</td><td></td></tr><tr><td>Brachyury Rabbit mAb</td><td>Abclonal</td><td>A5078</td><td></td></tr><tr><td>BsmBI-v2</td><td>NEB</td><td>R0739S</td><td></td></tr><tr><td>chir99021</td><td>Tocris</td><td>4423/10</td><td></td></tr><tr><td>קורנינג מטריג'ל מטריצת ממברנת מרתף,</td><td>קורנינג</td><td>ללא</td> LDEV 354234 <td></td></tr><tr><td>טכנולוגיות תאי גזע</td><td>ציקלופמין</td><td>72074</td><td></td></tr><tr><td>DMEM מדיה</td><td>Invitrogen</td><td>11995073</td><td></td></tr><tr><td>DMEM NUTRIENT MIX F12&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DPBS עם: Ca ו-Mg</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>סרום בובי עוברי</td><td>Invitrogen</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>FoxA2/HNF3&beta; &nbsp;</td><td>CST</td><td>8186</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH (14C10) נוגדן mAb ארנב</td><td>CST</td><td>2118S</td><td></td></tr><tr><td>טכנולוגיות תאי גזע</td><td>מגיב דיסוציאציה עדינה של תאים</td><td>7174</td><td></td></tr><tr><td>HyClone חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA) 100x Solution</td><td>GE healthcare</td><td>SH30238.01</td><td></td></tr><tr><td>Ki-67 (D3B5) Rabbit mAb</td><td>CST</td><td>9129</td><td></td></tr><tr><td>החלפת</td> <td>סרום נוקאאוטInvitrogen</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>L GLUTAMINE, 100x</td><td>Invitrogen</td><td>2924190090</td><td></td></tr><tr><td>L2H-BMSBSP-F1</td><td>Macrogen</td><td></td><td>CGTGCGGTCGCTGGG</td></tr><tr><td>L2HGDH נוגדן פוליקלונלי</td><td>Proteintech</td><td>15707-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>L2HGDH-SgRNA1-F</td><td>Macrogen</td><td></td><td>CACCGCGTGCGG GTTCGCGTCTGGG</td></tr><tr><td>L2HGDH-SgRNA1-R</td><td>Macrogen</td><td></td><td>AAACCCCAGACGC GAACCCGCACGC</td></tr><tr><td>L2HGDH-SgRNA2-F</td><td>Macrogen</td><td></td><td>CACCGCCCGCGG GCTTTTCGCCGG</td></tr><tr><td>L2HGDH-SgRNA2-R</td><td>Macrogen</td><td></td><td>AAACCCGGCGAA AAGCCCGCGGGC</td></tr><tr><td>L2H-seqF1</td><td>Macrogen</td><td></td><td>GCTAAAGAGCGC GGGTCCTCGG</td></tr><tr><td>L2H-SeqR1</td><td>Macrogen</td><td></td><td>GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG</td></tr><tr><td>L2H-UMSBSP-R1</td><td>מקרוגן</td><td></td><td>GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG</td></tr><tr><td>LentiCRISPRv2</td><td>Addgene</td><td>52961</td><td></td></tr><tr><td>mTesR1 מדיה מלאה</td><td>טכנולוגיות תאי גזע</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן ננוג</td><td>CST</td><td>3580</td><td></td></tr><tr><td>מדיום נוירובזאלי 1x CTS</td><td>Invitrogen</td><td>A1371201</td><td></td></tr><tr><td>Neuropan 2 תוסף 100x</td><td>PAN Biotech</td><td>P07-11050</td><td></td></tr><tr><td>Neuropan 27 תוסף 50x</td><td>PAN Biotech</td><td>P07-07200</td><td></td></tr><tr><td>Oct-4 נוגדן</td><td>CST</td><td>2750</td><td></td></tr><tr><td>Pax6 (D3A9V) XP Rabbit mAb</td><td>CST</td><td>60433</td><td></td></tr><tr><td>PENICILLIN STREPTOMYCIN SOL</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>מגיב זיהום פוליברן</td>, <td>סיגמא</td><td>TR1003- G</td><td></td></tr><tr><td>פוליאתילנימין, סיגמא מסועף</td><td></td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2.0</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Invitrogen</td><td>A1113802</td><td></td></tr><tr><td>qPCR ערכת טיטר לנטיווירוס</td><td>ABM</td><td>LV900</td><td></td></tr><tr><td>מעכב סלע Y-27632 דיהידרוכלוריד&nbsp;</td><td>טוקריס</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>SB 431542</td><td>טוקריס</td><td>1614/10</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן Sox2 CST</td><td></td><td>2748</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין .05% EDTA&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>U6-459F</td><td>מקרוגן</td><td></td><td>GAGGGCCTATT אשף TCCCATGATTC</td></tr><tr><td>ערכת טיהור DNA גנומי&nbsp;</td><td>פרומגה</td><td>A1120</td><td></td></tr><tr><td>XAV 939</td><td>טוקריס</td><td>3748/10</td><td></td></tr></tbody></table>

crispr-cas9 תיווך מחיקת גנים בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים שגודלו בתרבית בתנאים נטולי הזנה

CRISPR-Cas9 Mediated Gene Deletion in Human Pluripotent Stem Cells Cultured Under Feeder-Free Conditions

שיבוט של L2HGDH sgRNA ב-lentiCRISPRv2 puro וקטור הפורו lentiCRISPRv2 הושג באופן מסחרי (ראו טבלת חומרים) ועוכל עם BsmB1, מה שהביא לשחרור של קטע פוחלץ של 1.8 Kb. כפי שניתן לראות באיור 2A, נצפה עיכול מלא של הווקטור. עבור כל מבנה, שישה שיבוטים נבדקו לנוכחות או היעדר החדרה באמצעות רצף sgRNA הפוך כפריימר ופריימר קדמי (U6-459F) מתוך הרצף הווקטורי. באמצעות גישה זו, רק השיבוטים שקיבלו את האינסרט הניבו תוצר PCR של 288 bp, ושיבוטים שליליים שלא הכילו את הרצף ההפוך של sgRNA לא הניבו מוצר PCR, כפי שמוצג באיור 2B.
זיהומי H9, בחירות יציבות וכתם מערבי תאי גזע עובריים (hESCs) היו נגועים בחלקיקים לנטי-ויראליים המבטאים שני sgRNA שונים המכוונים לאקסון 1 של הגן L2HGDH ונבחרו באמצעות פורומיצין. ניתוח כתמים מערביים בוצע מאוכלוסיות הטרוגניות של תאי sgRNA ו-Cas9 בעלי ביטוי משותף יציב כדי לקבוע איזה משני ה-sgRNA שנעשה בהם שימוש היה יעיל יותר בגרימת מחיקת גנים. כפי שניתן לראות באיור 3A, L2HGDH-sgRNA-1 היה יעיל יותר מהרצף האחר בהפחתת הביטוי של L2HGDH באוכלוסיות תאים הטרוגניות.
בחירת השבטים, הרחבתם וניתוחם של חלבונים בחירה של תא בודד והרחבת שבטים נעשו עבור תאים המבטאים L2HGDH-sgRNA-1. הבארות שהניבו שיבוטים בודדים סומנו וגדלו עד שהושג גודל מספיק עבור המושבות (בדרך כלל שבועיים) כדי להתרחב עוד, לשמר בהקפאה ולנתח (איור 3B). בסך הכל נותחו 22 שיבוטים באמצעות ניתוח כתמים מערביים, שהניבו חמישה נוקאאוטים הומוזיגוטיים (23%) עבור L2HGDH. תוצאה זו מראה יעילות גבוהה של נוקאאוט גנים באמצעות העברת גנים בתיווך לנטיויראלי לביטוי משותף יציב של sgRNA ו- Cas9 מקלטת יחידה. איור 4 מראה ניתוח כתם מערבי של חמשת שיבוטי הנוקאאוט ההומוזיגוטיים יחד עם תאי ביקורת, ומראה ביטוי מופחת ב-100% בהשוואה לבקרה בשיבוטים שנבחרו.
ניתוח ברמת ה- DNA על מנת למפות את אתר מוטציית הקריספר במעלה הזרם של רצף זיהוי PAM של Cas9, בוצעה תגובת שרשרת של פריימרים פולימראז ספציפיים (MS-BSP PCR) המבוססת על אתרי מוטציה באמצעות DNA גנומי מתאי ביקורת ומחמישה שיבוטים שונים. כפי שניתן לראות באיור 5, לשני שיבוטים (A5 ו-B4) יש מוטציות קרובות באופן מיידי לרצף זיהוי ה-PAM, בעוד ששלושת השיבוטים האחרים (A1, A9 ו-B12) הראו שהמוטציה עשויה שלא להיות קרובה מאוד לאתר PAM והיא נמצאת במעלה הזרם של רצף sgRNA של 20bp בתוך האקסון 1 של הגן L2HGDH .
על מנת למצוא את המוטציות המדויקות בדנ"א, תוצרי PCR מטוהרים מתאי ביקורת (וקטור נגוע רק H9) כמו גם שלושה שיבוטים שונים של קריספר, A5, A1 ו-B4, עברו ריצוף סנגר, ואתרי מוטציות מופו באמצעות כלי היישור המרובים clustalw במעלה הזרם של אתר PAM8. התוצאות חשפו מוטציית מחיקה בשיבוט A5 במעלה הזרם של אתר PAM. שני השיבוטים האחרים, A1 ו-B4, הראו מוטציה החדרתית במעלה הזרם של אתר PAM, כפי שמודגש באיור 6.
ניתוח פונקציונלי של שיבוטים עם יצירת שורות תאי נוקאאוט של CRISPR בתאי גזע עובריים עובריים, השלב הבא הוא לאשר את פוטנציאל הריבוי וההתמיינות שלהם. לשם כך, בדקנו סמני פלוריפוטנציה שונים עבור שלושה שיבוטים שונים, A1, A5 ו-B4, והשווינו את התוצאות לתאי בקרה (H9 נגועים וקטוריים בלבד). התוצאות לא הראו שינוי בפוטנציאל הפלוריפוטנציה של קווי תאי נוקאאוט כפי שנקבע על ידי צביעה חיסונית עבור סמנים OCT4, NANOG ו-SOX2. לאחר מכן, קווי תאי הבקרה והנוקאאוט הוכתמו גם עבור סמן התפשטות התא, KI67, שגם הוא לא הראה שינוי בקווי תאי הנוקאאוט בהשוואה לביקורת. תוצאות אלה מראות כי נוקאאוט CRISPR לא השפיע על תכונות ההתחדשות העצמית של תאים אלה. נוסף על כך, EB והיווצרות מושבות לא הושפעו גם הם (איור 7). באמצעות שיטות במבחנה שהוקמו במעבדה שלנו, כל השיבוטים התמינו בהצלחה לשלושה תאי שכבת נבט כפי שאושר על ידי צביעה חיסונית עבור PAX6 (סמן נוירואקטודרם), Brachyury (סמן מזודרם) ו- FOXA2 (סמן אנדודרם). לא נצפה שינוי בפוטנציאל ההתמיינות של שורות תאי נוקאאוט בהשוואה לתאי ביקורת, מה שהראה שתאי נוקאאוט שמרו על פוטנציאל ההתמיינות שלהם (איור 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig01.jpg"> 
איור 1: תרשים סכמטי המציג את תכנון המחקר ב-5 שלבים. שלב 1: תכנון ושכפול של sgRNA לווקטור V2 CRISPR מעוכל Bsmb1. שלב 2: יצירת חלקיקים לנטי-ויראליים באמצעות וקטור כניסה הנושא sgRNA יחד עם פלסמידים אריזה על ידי העברה משותפת של תאי HEK293T באמצעות פוליפקציות וריכוז נגיפים באמצעות אולטרה-צנטריפוגה. שלב 3: זיהום של תאי גזע עובריים באמצעות חלקיקים לנטי-ויראליים ב-MOI של 10-20 ובחירת תאים יציבה באמצעות פורומיצין ואחריו ניתוח של אוכלוסיות תאים הטרוגניים כדי לראות את היעילות של sgRNAs. שלב 4: שיבוט תא בודד על ידי הגבלת שיטת דילול מהתאים שהראו הפלה מקסימלית באוכלוסיות הטרוגניות ובחירת שיבוטים בודדים. שלב 5: הרחבת שיבוטים בודדים וניתוח ברמת ה- DNA, חלבון וניתוח פונקציונלי של שיבוטים עבור פוטנציאל גזע והתמיינות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig02.jpg"> 
איור 2: שיבוט של sgRNA בווקטור lentiCRISPR V2.puro. (A) עיכול של וקטור lentiCRISPR V2.puro עם אנזים ההגבלה, BsmB1. החץ מציין קטע פוחלץ של 1.8 Kb המשתחרר עם עיכול הווקטור. (B) ניתוח PCR מושבה עבור שיבוטים שונים של L2HGDH sgRNA מבנים 1 ו -2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig03.jpg"> 
איור 3: כתמים מערביים והתפשטות שבטים באמצעות ברירה של תא בודד. (A) ניתוח כתמים מערביים משני שכפולים ביולוגיים שונים (S1 ו-S2) של אוכלוסיות הטרוגניות של sgRNA בעל ביטוי משותף יציב (L2H-1 ו-L2H-2) ו-Cas9 יחד עם בקרה (C) H9 hESCs. (B) בחירה של תא בודד והתפשטות שבטית של תאי H9 המבטאים ביציבות L2HGDH-sgRNA-1. החיצים מצביעים על בארות של 96 לוחות בארות המציגים רק שיבוטים בודדים. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig04.jpg"> 
איור 4: ניתוח כתמים מערביים משיבוטים שונים של H9. (A-C) ניתוח כתמים מערביים מכלל ליזטים של תאים של 22 שיבוטים הניב חמישה נוקאאוטים הומוזיגוטיים (23%) עבור L2HGDH. (D) אישור נוקאאוטים L2HGDH מניסוי העתקה ביולוגי אחר באמצעות כתם מערבי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig05.jpg"> 
איור 5: ניתוח MSBSP PCR של שיבוטים שונים של H9. (A) ניתוח רצף של L2HGDH exon 1 המשמש לניתוח MSBSP PCR. (B) אופטימיזציה של טמפרטורת חישול עבור ניתוח MSBSP PCR באמצעות בקרה ו- H9 V2 L2HGDH KO Clone B4. ב- 96.8, הפקד מציג פס, אך B4 אינו מציג פס, כפי שמוצג על-ידי חצים. (C) ניתוח של כל שיבוטי KO הומוזיגוטיים הביא למיפוי להלן של אתר המוטציה בתוך אקסון 1. A1 = In/Del לא קרוב לאתר PAM; A5 = In/Del קרוב לאתר PAM; A9 = in/del קרוב למדי לאתר PAM; B4 = In/Del קרוב מאוד לאתר PAM B12 = In/Del לא קרוב לאתר PAM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig06.jpg"> 
איור 6: יישור מוצרי PCR ברצף Sanger עם ייחוס לרצף L2HGDH exon 1. יישור מרובה של מוצרי PCR ברצף Sanger מ-A1, A5 ו-B4, ותאי בקרה נעשו יחד עם רצף ייחוס בתוך האקסון הראשון של L2HGDH ממסד הנתונים של NCBI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig07.jpg"> 
איור 7: אפיון פונקציונלי של קווי תאי נוקאאוט מסוג CRISPR. (A) התאים עברו חיסון עבור סמני פלוריפוטנציה (OCT4, NANOG, SOX2), התחדשות עצמית (KI67), EBs והיווצרות מושבה ביחס לתאי H9 hESC הנגועים בביקורת. פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר. (B) אחוז התאים המבטאים באופן חיובי (+ve) חושב ביחס לצביעת DAPI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig07large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig08.jpg"> 
איור 8: פוטנציאל התמיינות של קווי תאי נוקאאוט של CRISPR. אפיון פונקציונלי של קווי תאי נוקאאוט CRISPR מבחינת פוטנציאל ההתמיינות שלהם באמצעות סמנים עבור PAX6 (neuroectoderm), Brachyury (mesoderm) ו-FOXA2 (Endoderm) ביחס לתאי H9 הנגועים בביקורת. פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig08large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>שלב הפרוטוקול</td>
			<td>הזמן הדרוש</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>שיבוט sgRNA ב-LentiCRISPRv2</td>
			<td>4 ימים</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ייצור Lentivirus וקביעת טיטר</td>
			<td>5 ימים</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>זיהומי תאי גזע עובריים עובריים, בחירת תאים יציבים והתרחבות</td>
			<td>שבועיים</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>בחירה והרחבה של תא בודד</td>
			<td>שבועיים</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ניתוח פונקציונלי של שיבוטים</td>
			<td>שבועיים</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
טבלה 1: ציר הזמן עבור שלבי הפרוטוקול והזמן המשוער הנדרש.

CRISPR-Cas9 תיווך מחיקת גנים בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים שגודלו בתרבית בתנאים נטולי הזנה

The CRISPR-Cas9 system for genome editing has revolutionized gene function studies in mammalian cells, including stem cells. However, the practical ...

crispr-cas9-mediated-gene-deletion-human-pluripotent-stem-cells

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מתארים פרוטוקול להפקת תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים מתוכנתים מחדש ומאופיינים ללא גורמים והמרה למצבים קליניים משוערים.

גזירה ואפיון ללא transgene האדם המושרה pluripotent גזע קו סלולארי והמרה לתנאי כיתה קלינית מוגדרים

אימות ניסיוני של פעילות משפר ניגש בצורה הטובה ביותר על ידי ניתוח אובדן תפקוד. מוצג כאן פרוטוקול יעיל המשתמש במחיקה בתיווך CRISPR/Cas9 כדי לחקור ויסות ספציפי לאלל של שעתוק גנים בתאי F1 ES המכילים גנום היברידי (Mus musculus129 x Mus castaneus).

יצירת CRISPR / Cas9 מתווכת Monoallelic מחיקות ללמוד לתפקד Enhancer בתאי עכבר גזע עובריים

עריכת גנום של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) יכולה להיעשות במהירות וביעילות. מוצג כאן הליך ניסיוני חזק להנדסה גנטית של hPSCs כפי שמודגם על ידי עריכת מיקום נמל המבטחים AAVS1 כדי לבטא EGFP ולהציג עמידות לאנטיביוטיקה.

הקמת שורות תאי גזע pluripotent האדם בעריכה-הגנום: ממיקוד לבידוד

פרוטוקולים כדי ליצור קווים מוטנטים hPSC באמצעות פלטפורמת iCRISPR וכדי לבדל hPSCs לתאי β-כמו גלוקוז-תגובה מתוארת. שילוב של טכנולוגית עריכת הגנום עם בידול מכוון hPSC מספק פלטפורמה חזקה עבור הניתוח השיטתי של תפקיד גורמי שושלת בהתפתחות אנושית והתקדמות מחלה.

הגנום עריכה בימוי בידול של hPSCs עבור חקירת גורמים המשפיעים Lineage בהתפתחות האנושית הלבלב

זה הפרוטוקול מתאר בפירוט הדור של תאי גזע pluripotent המושרה ללא טביעת רגל (iPSCs) מתאי הלבלב האנושי בתנאים ללא מזין, ואחריו עריכה באמצעות ribonucleoproteins CRISPR/Cas9 ואפיון שונה תא בודד שיבוטים.

דור יעיל ועריכה של נטול מזין IPSCs מתאי הלבלב האנושי באמצעות מערכת CRISPR-Cas9

עבור פרוטוקול מהיר CRISPR/Cas9-מתווכת ' שיבוש גנטי עכבר, התאים hematopoietic העיקרי של האדם מתואר במאמר זה. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins הם הציגו ויה אלקטרופורציה עם sgRNAs שנוצר דרך במבחנה שעתוק ו Cas9 מסחרי. יעילות העריכה גבוהה מושגות עם זמן מוגבל ועלות פיננסיים.

שיבוש גנטי יעילים ביותר מאתר ואנושי Hematopoietic ובתאים מאת CRISPR/Cas9

המתוארים כאן הוא פרוטוקול עבור תיוג endogenously לידי ביטוי חלבונים עם תגי פלורסנט בתאי גזע pluripotent המושרה האנושי באמצעות CRISPR/Cas9. תאים putatively הערוך מועשרים ידי קרינה פלואורסצנטית מופעל מיון תא, שורות תאים המשובטים נוצרים.

חלבון אנדוגני תיוג-אנוש המושרה בתאי גזע Pluripotent באמצעות CRISPR/Cas9

פרוטוקול זה מספק שיטה כדי להקל על הדור של heterozygous או homozygous נוקלאוטיד שינויים באמצעות CRISPR-CAS9 בתאי גזע האדם pluripotent.

הדור של שינויים גנומית מוגדרים באמצעות CRISPR-CAS9 בתאי גזע האדם Pluripotent

כאן אנו מתארים שיטה מפורטת לעריכת גנים חלקה בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות פלסמיד תורם מבוסס piggyBac ומוטנט ניקאז Cas9. שתי מוטציות נקודתיות הוכנסו לאקסון 8 של לוקוס הגורם הגרעיני הפטוציטים 4 אלפא (HNF4α) בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs).

החדרת מוטציות נקודתיות לתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות עריכת גנום חלקה

פרוטוקול הבאה מספקת הדרכה והתאמת האדם הנגרמת גזע pluripotent (שב"ס) תאים עד תרבות מזין בחינם באמצעות נוקאאוט להשלים סרום מזין החלפה ללא בינוני (KSR-FF). מותאם פעם, הוראות תחזוקה מתמדת ניתנים גם.

מזין ללא עיבוד, התרבות Passaging של תאים שב&quot;ס האדם באמצעות נוקאאוט השלם החלפת סרום מזין ללא בינוני

למדו שיטת CRISPR-Cas9 לעריכת גנים בתאי גזע עובריים אנושיים H9 באמצעות וקטורים לנטיוויראליים. השיטה מאפשרת מחיקת גנים יציבה ללא פגיעה בפלוריפוטנטיות וביכולת ההתמיינות של התאים.

CRISPR-Cas9 תיווך מחיקת גנים בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים שגודלו בתרבית בתנאים נטולי הזנה

גלה סרטונים נוספים