שורשי צפצפה הרפתקניים המושרים על ידי פתוגנים של אפטות גזע: מערכת ניסויית לחקר ביולוגיה של שורשים ותהליכים הקשורים לתגובת אור

היקף פרוטוקול מחקר זה הוא לתאר שיטה לייצור שורשים הרפתקניים באמצעות חגורה וחיסון של פתוגנים פטרייתיים בגבעולי ענפי עצי צפצפה. אנו מציעים שיטה זו כמערכת ניסויית אידיאלית לחקר ביולוגיה של שורשים ותהליכי תגובת האור באינטראקציות צפצפה-פתוגן.

למרות שדווח על קידום צמיחה של מיקרואורגניזמים מועילים על שורשים כגון ריזובקטריות מקדמות צמיחת צמחים, חיידקים אקטו-אנדופיטיים, או פטריות מיקוריזה בכלי הדם, או פטריות אקטומיקוריזה דווחו במיני צמחים רבים, אינדוקציה של גידול הרפתקני על ידי פתוגנים לא תועדה. פרוטוקול זה מציג תופעה נורמלית של התפתחות שורשים בצפצפה.

התפתחותם והתנהגותם של שורשי צפצפה נחקרו בסביבות שונות ובאינטראקציה עם מיקרואורגניזמים מועילים. עם זאת, המחקר שלנו מציג תחום חדש של ביולוגיה של גידול צמחים, השראת שורשים הרפתקניים בצפצפה על ידי פתוגנים פטרייתיים בגזע. אנו מאמינים שממצא זה יקדם לא רק את חקר הביולוגיה של הגדילה, אלא גם את ההבנה של אינטראקציות בין צמחים לפתוגן.

פרוטוקול מחקר זה הראה כי פתוגנים בגזע גרמו לשורשים הרפתקניים בצפצפה. אנו יכולים לקבל שהפתוגנים יכולים גם לשנות את דפוסי ביטוי הגנים בשורשים הרפתקניים ברמות השעתוק, הפוסט-שעתוק והשינוי האפיגנטי. לכן, השיטות המוצעות בפרוטוקול זה סללו את הדרך למחקרים על שורשי צפצפה הרפתקניים.

בעתיד נתמקד במנגנונים הפיזיולוגיים והמולקולריים של פתוגנים הגורמים להיווצרות שורשים הרפתקניים בצפצפה. כמו כן, נחקור את מנגנון העמידות והשינוי האפיגנטי של שורשי צפצפה הרפתקניים לאחר חיסון פתוגן וננסה לברר את יישום הייעור של תופעה זו.

[קריין] להכנת אגר דקסטרוז תפוחי אדמה או מדיום PDA, ממיסים שישה גרם תמצית תפוחי אדמה, 20 גרם דקסטרוז ו -20 גרם אגר בליטר מים אחד. מעקרים את המדיום בחום של 121.1 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. יוצקים את המדיום לצלחות פטרי, שכל אחת מכילה 20 מיליליטר מדיום PDA. חסנו את קוביית התפטיר הפטרייתי המופעלת של Valsa sordida או Botryosphaeria dothidea במרכז צלחת הפטרי. דגרו את המנה בחושך בחום של 28 מעלות צלזיוס למשך שבעה עד 10 ימים. לאחר הדגירה, חותכים את מדיום ה- PDA עם תפטיר פטרייתי לרצועות. לאחר מכן, בחרו שתיל צפצפה נמרץ בן שנה עד שנתיים ובחרו גבעול בוגר מהשתיל. עקר את אזור החיסון עם 75% אתנול. חגרו בזהירות את האפידרמיס והפלום של גבעול הצפצפה המעוקר. הסר את טבעות הפלום החגורות, כולל קמביום חלקי, כדי לחשוף את רקמות הקמביום הפנימיות או הקסילם. כסו לחלוטין את אזור החגורה ברצועות תפטיר פטרייתי כטיפול בחיסון חגורת הלחם. עטפו את הגבעול המחוסן בארבע שכבות של סרט השתלה נמתח ושקוף כדי לשמור על הלחות. בעזרת סכין מעוקרת מגרדים ופוגעים ברקמת הקמביום הפנימית של האזור החשוף. לאחר מכן, יש לחסן את רצועת ה-PDA על אזור החגורה כחלק מהטיפול בהסרת הקמביום. לאחר מכן, חסנו את אזורי החגורה ישירות עם רצועות בינוניות PDA לא מתורבתות כבקרת חגורה. עטפו את הגבעול המחוסן בארבע שכבות של סרט השתלה נמתח ושקוף כדי לשמור על הלחות. קושרים את הגבעול המחוסן במקל כדי להגן עליו מפני שובר רוח. לאחר 14 עד 30 יום של חיסון, התבונן ורשום את היווצרותם של שורשי צפצפה הרפתקניים. חגרו בזהירות את האפידרמיס של גזע הצפצפה כדי לחשוף את רקמת הפלומה הירוקה. לאחר מכן, מגרדים אנכית את רקמת הפלום וחושפים את המבנה הפנימי של הפלום. חסנו את אזור האפידרמיס החגורה עם תפטיר פטרייתי ורצועת PDA כפי שהודגם קודם לכן. עטפו את הגבעולים המחוסנים בארבע שכבות של סרט השתלה שקוף ונמתח. לאחר 14 עד 30 יום של חיסון, התבונן ורשום את היווצרותם של שורשי צפצפה הרפתקניים או שורשים הרפתקניים. פתוגנים של אפטות גזע V. sordida ו-B. dothidea גרמו להיווצרות שורשים הרפתקניים ב-Populus alba var. pyramidalis גבעולי לאחר חיסון חגורת פלום. שורשים הרפתקניים הושרו גם על גזעיו של P. alba var. pyramidalis בן ה-6 על ידי הפתוגן V. sordida לאחר חגורת הפלום, עם אורך שורש העולה על 7.0 סנטימטרים. לאחר השראת שורשים הרפתקניים בצפצפה בשיטת חיסון חגורת הפלום או חגורת האפידרמיס, עטפו את האזור המחוסן בפתוגן בנייר אלומיניום לטיפול בהצללה. קושרים את הגבעול במקל כדי להגן עליו מפני שובר רוח. לאחר 20 יום, הסר את נייר האלומיניום מהגבעולים. התבוננו וצלמו את שורשי הצפצפה ההרפתקניים המוצלים בנייר אלומיניום ולא מוצלים. טפחו את שורשי הצפצפה ההרפתקניים המוצלים באור השמש או תחת מקורות אור מלאכותיים. לאחר יום עד חמישה ימים של חשיפה לאור, הסר את סרטי ההשתלה וקצור את שורשי הצפצפה ההרפתקניים. עטפו את השורשים ההרפתקניים בנייר אלומיניום. משרים את דגימות השורש ההרפתקניות בחנקן נוזלי ומאחסנים אותן במינוס 80 מעלות צלזיוס. חשיפה לאור הפכה שורשים הרפתקניים לבנים או אדומים בהירים לשורשים אדומים הרפתקניים על P. alba var. pyramidalis תוך שלושה ימים, עם ביוסינתזה של פיגמנט הקשורה להיווצרות ציאנידין 3-O-גלוקוזיד.