תכני מיקרופלואידיקה למינציה פוליאתילן טרפתלט בעלות נמוכה עבור הדמיית דג זברה מרובה

המעבדה שלנו מתעניינת במנגנונים המווסתים נדידה והפעלה של נויטרופילים בפגיעות רקמות, זיהום וסרטן תוך התמקדות במאפיינים ובמשמעות הביולוגית של איתות סידן תוך תאי בריפוי פצעים.

[שלי] שיטות תכנון מיקרופלואידיות קונבנציונליות הן יקרות ומורכבות, ולכן מאטות את ההתקדמות בתחומים כמו ביולוגיה התפתחותית הדורשים סביבות מגוונות. ראינו גישה מהירה ויעילה יותר לפיתוח ובדיקה של עיצובים בודדים. לכן שיטת בנייה זו מספקת גמישות תכנון ורזולוציה מרחבית רבה יותר מאשר פרוטוקולים פשוטים דומים, תוך שהיא מאפשרת איטרציה מהירה וקלה יותר מאשר התקני PDMS סטנדרטיים. באמצעותו, פיתחנו את ה-RADISH כדי לדמות בו זמנית עוברי דג זברה מרובים בשדה ראייה אחד.

עם מכשיר לכידה זה התומך בהדמיית חיים ברזולוציה גבוהה, אנו ערוכים להבין כיצד אותות מגוונים, כולל גירויים כימיים ומכניים, משולבים כדי לתאם דלקת וריפוי פצעים.

[מדריך] כדי להתחיל, עצב את התבנית למכשיר באמצעות התוכנה הנבחרת. בהתאם לגיל וגודל העובר, התאם את רוחב התעלה ואת גודל תא ההדמיה המרכזי להתאמה הטובה ביותר. שמרו כל שכבה כקובץ תמונה נפרד עם מידות זהות. כעת, אתחל את מכונת החיתוך על פי הוראות היצרן. בסביבת העבודה של העיצוב, בחר את העיצובים החדשים שהועלו. קבץ דפוסים המיועדים לאותו עובי של יריעת PET יחד באותו חתך. אשר את מספר וסוג הדפוסים בחיתוך, ולאחר מכן בחר את החומר החתוך. לאחר מכן, חבר את יריעת ה-PET למחצלת החיתוך בעובי הרצוי תוך לחיצה חזקה כדי להסיר בועות אוויר, וטען את המחצלת למכונת החיתוך. עקוב אחר ההוראות שעל המסך כדי להנחות את מכונת החיתוך להתחיל בחיתוך. לאחר מכן, הסר את החתכים המוגמרים ממחצלת החיתוך. כעת, יישר את השכבות על זכוכית החלקת כיסוי, ללא סיוע או עם סימני רישום חתוכים מראש. אבטח את השכבות עם סרט משרדי כדי למנוע תזוזה במהלך למינציה. בהתאם לגודל המכשיר ולקיבולת הלמינציה, הרכיב עיצובים קטנים על גב גדול יותר עם יותר סרט כדי למנוע חסימה או סתימה של הזנת הלמינציה. לאחר מכן, הפעל את הלמינציה והלמינציה לפי הוראות היצרן. הסר את הסרט המשרדי לפני יישור השכבה הבאה. בעזרת דבק ציאנואקרילט, אבטח את המכשיר לצלחת של 35 מילימטר שנקדחה עם חור של שלושת רבעי אינץ '. לאחר מכן אטום את הלמינציה על ידי ציפוי יסודי של קצוות המכשיר החיצוניים בדבק ציאנואקרילט. השתמש במספיק דבק כדי לכסות את הקצוות החיצוניים במלואם ללא פערים. כדי להתחיל, יש לגדל עוברי דג זברה לפחות יומיים לאחר ההפריה ב-E3 או במדיום גידול עוברים מתאים אחר. לאחר מכן, יש להרדים את העוברים באמצעות 164 מיליגרם לליטר MS-222. לאחר מכן, מלאו את צלחת האחיזה המכילה את המכשיר המותקן בחמישה מיליליטר E3 או מדיום עוברי אחר המכיל 164 מיליגרם לליטר MS-222. בעזרת פיפטת העברה, הפקידו עובר מורדם אחד בכל תא החזקה של המכשיר. לאחר מכן, באמצעות לולאת שיער, כוונו את העוברים כשהזנב של כל עובר בולט לתוך תא ההדמיה המרכזי, והחלמון משותק בתעלה בצורת טריז. אם תרצה, אבטח את ראש העובר על ידי הוספת אגרוז נמס נמוך של 1.5% לתא ההחזקה באמצעות מיקרו פיפטה. לבסוף, העבירו את המכשיר עם העוברים למערכת ההדמיה לבחירתכם כדי להתחיל בהדמיה, בחרו את מערכת ההדמיה המתאימה ואת המטרה לניסוי. התאם את מיקוד הדגימה ופרמטרי ההדמיה ליחס אות לרעש אופטימלי ומהירות רכישה. כדי לפצוע את העובר באמצעות חתך ידני, הפעל לחץ עם להב אזמל על רקמת סנפיר הזנב בקצה הנוטוכורד תחת מיקרוסקופ סטריאו. לאחר מכן, החזר את המכשיר לבמה. כדי לפצוע את העובר באמצעות גירוי לייזר, הגדר אזור עניין ליד קצה קפל סנפיר הזנב, ועורר בהתאם לעוצמת הלייזר הזמינה. דמיין את העובר בטמפרטורת החדר באמצעות ערוץ GFP ו-RFP עם מרווח פריימים של דקה אחת למשך שעה בסך הכל. במידת הצורך, שחררו את העוברים לאחר ההדמיה על ידי שאיבה עדינה ליד הראש באמצעות פיפטת העברה או על ידי סיבוב הצלחת.