מודל תרבית משותפת באמצעות שני סוגים של קווי תאים דבקים

כפי שמרמז שמו של המוסד שלנו, המכון לרפואת האם והעובר, המחקר שלנו מתמקד בעיקר בביולוגיה של הרבייה הנשית. אנו שואפים להבין את המנגנון של הפרעות רבייה ולזהות מטרות פוטנציאליות לטיפול בהן. יתרון מרכזי אחד של גישה זו הוא ההפחתה המשמעותית בזמן ובהוצאות בהשוואה למערכות קו-קולטור זמינות מסחרית.

הפיגום הביתי בנוי מחומרים זמינים, מה שמוזיל משמעותית את עלות ההתקנה. מודלים מרובי תאים במבחנה אלה מייצגים טוב יותר אנטומיה מורכבת in vivo של אזור ההשתלה. בעתיד, המעבדה שלנו תציג סוגי תאים אחרים למודל רב-תאי מעורב זה במבחנה, ותחקור יותר הן מחקרי השתלה והן תפקוד רחם בפתוגנזה של מחלות כגון פגיעה ברירית הרחם והיצמדות תוך רחמית.

כדי להתחיל, השג את הפיגום המודפס בתלת מימד לבניית דגמים. לתרבית תאים, הניחו כיסוי מרובע נקי וסטרילי בגודל 18 מילימטר בתחתית צלחת בת 12 בארות. מצפים את הכיסוי ב -200 מיקרוליטר מטריצה חוץ-תאית בריכוז של 200 עד 300 מיקרוגרם למיליליטר.

שמור את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. ואז הסר את המטריצה החוץ-תאית מהצלחת. לאחר מכן, בדוק את תאי הגזע העובריים האנושיים ותאי אישיקווה שתורבתו בעבר תחת מיקרוסקופ כדי לאשר מפגש מתאים.

לאחר מכן הוציאו את המדיום המושקע מהבארות, ושטפו את התאים פעמיים עם שלושה מיליליטר PBS. כעת דגרו על התאים עם שני מיליליטר של אנזים דיסוציאציה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות כדי לנתק אותם. נטרל את התגובה באמצעות מדיום תרבית שלם.

לאחר מכן צור מתלה חד-תאי על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. כעת מערבבים 100 מיקרוליטר של תרחיף התא עם טריפן כחול, תוך שמירה על מקדם דילול של שניים. לאחר מכן החלק את הכיסוי מעל תא ההמוציטומטר.

מלאו את שני התאים הצדדיים במתלה התא מעורבב בכחול טריפאן. ספרו את מספר התאים בריבועים משני הצדדים תחת מיקרוסקופ פי 20, וחשבו את צפיפות התאים על סמך הספירות. כעת זרעו את תאי הגזע העובריים האנושיים בריכוז של 10 בחזקת חמישה תאים למיליליטר בצלחת המוכנה המכילה מדיום טרי, ודגרו ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך 24 שעות.

עבור קו התאים של אישיקאווה, זרעו את התאים לבאר ללא כיסוי למחרת. משרים היטב את הפיגומים באלכוהול אתילי ומים מזוקקים כפולים למשך יומיים. לאחר ההשריה, הסר את המים המזוקקים הכפולים ואטום את פחית המתכת.

לאחר מכן יש לעקר את הפיגומים באמצעות חיטוי בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הניחו להם להתייבש. הוסף כשני מיליליטר של מדיום משלים לבאר עם תאי אישיקאווה.

העבר את הכיסוי עם תאי גזע עובריים אנושיים מחוברים על הפיגום, ומקם את צד התא כלפי מטה. חבר את הפיגום לבאר המכילה תאי אישיקאווה. עבור ההתקנה השנייה, הנח את הכיסוי עם תאי אישיקווה על הפיגום וחבר אותו לבאר המכילה תאי גזע עובריים.

דגרו על מערכות התרבות המשותפת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. הסר בזהירות את מדיום התרבות מהבארות, ושטוף בעדינות את התאים עם PBS סטרילי. בעזרת מלקחיים עדינים או פינצטה, הסר את הכיסויים עם תאים מחוברים מכלי התרבות.

לחלופין, הניחו את הכיסויים בכלי חדש עם PBS כדי לשמור על לחות במהלך תהליך ההעברה. הוסף טיפה של PBS על שקופית מיקרוסקופ נקייה, והעביר בעדינות את הכיסוי המכיל את התאים אל הטיפה, וודא שהתאים פונים כלפי מטה אל השקופית. מקם את השקופית המוכנה על הבמה של מיקרוסקופ הפוך.

בחר את עדשת המטרה המתאימה, והשתמש בכפתורי המיקוד הגסים והעדינים כדי לכוונן את המיקוד. הגדר פרמטרים של מיקרוסקופ, כולל עוצמת תאורה והגדרות מצלמה. השתמש בתוכנת המיקרוסקופ כדי לצלם תמונות בהגדלות ובשדות ראייה רצויים.

הצפיפות של שני סוגי התאים נותרה נמוכה במצב תרבית משותפת לאחר 72 שעות, בעוד שצפיפות התאים בתרבית עצמאית עלתה משמעותית. אורכם של תאי גזע עובריים אנושיים בתרבית משותפת היה קצר יותר מאלה שגודלו באופן עצמאי.