בידוד ורישום Patch-Clamp של תא שלם של מיקרוגליה בהיפוקמפוס מעכברים בוגרים

המחקר שלנו מתמקד בבידוד חריף של מיקרוגליה עבור הקלטות של תאים שלמים, כולל זרמי אשלגן כדי להבין את פעילות תעלת היונים. הפרוטוקול גם ניתן להתאמה לבידוד מיקרוגליה לאזורי מוח שונים, ומספק תובנות לגבי אפס במצבים נוירולוגיים שונים.

ההתפתחויות האחרונות בתחום המחקר שלנו כוללות שימוש בעיכול אנזימי דלקת לבלב מסורתי, בשילוב עם טיהור מיקרוגליה באמצעות מיון תאים פעילים פלואורסצנטיים. התקדמות זו שיפרה את הדיוק והיעילות של בידוד אוכלוסיות מיקרוגליה ספציפיות למחקר נוסף.

הפרוטוקול שלנו חוקר את התכונות האלקטרו-פיזיולוגיות של מיקרוגליה ישירות מההיפוקמפוס של העכבר הבוגר, במקום להסתמך על CS מתורבת ראשונית. גישה זו מאפשרת ניתוח מדויק יותר של פונקציות מיקרוגליה בסביבתן המקורית.

התוצאות שלנו סללו את הדרך לשאלות מדעיות חדשות על התכונות הביוכימיות והתפקודיות של מיקרוגליה בתנאים פיזיולוגיים ומחלות כאחד, והציעו לחוקרים הדרכה רבת ערך בחקר היבטים אלה לעומק.

[מגישה] כדי להתחיל, הניחו את החיה המורדמת על שולחן ניתוח והצמידו את גפיה. חשפו את החזה וחדרו את הלב עם PBS סטרילי וקר כקרח כדי להסיר תאי דם במחזור הדם התוך-וסקולרי. לאחר מכן החזיקו את הראש וחתכו את העור לאורך קו האמצע של המוח בעזרת מספריים כדי לחשוף את הגולגולת. לאחר מכן, חותכים את החלק האחורי של הגולגולת באופן דו צדדי ובין ארובות העיניים בעזרת מספריים קטנים. חותכים את הגולגולת לאורך התפר הסגיטלי ומסירים את הגולגולת בעזרת פינצטה. לאחר מכן, חלץ את רקמת המוח במהירות. כעת, הניחו את רקמת המוח בצלחות תרבית של 10 סנטימטרים המכילות PBS קר כקרח. נתח את קליפת המוח באופן דו-צדדי בעזרת פינצטה. בודדו את רקמת ההיפוקמפוס וחתכו אותה לחתיכות קטנות יותר. מעבירים את החלקים לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר. לאחר מכן תלו מחדש את החתיכות הקטנות של רקמת ההיפוקמפוס בשני מיליליטר של תמיסת מלח מאוזנת של הנקס או HBSS. וצנטריפוגה בחום של 300 גרם למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר השלכת הסופרנטנט, הוסף 1,950 מיקרוליטר של תערובת אנזימים אחת לצינור הצנטריפוגה של 15 מיליליטר המכיל את חלקי רקמת ההיפוקמפוס. יש לנער את צינור הצנטריפוגה ברציפות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן, הוסף 30 מיקרוליטר של תערובת אנזימים טרייה שהוכנה שתיים לצינור הצנטריפוגה של 15 מיליליטר. פיפטה הרקמה מתפרקת למעלה ולמטה 20 פעמים עם קצה פיפטה של מיליליטר אחד ודוגרת באמבט מים למשך חמש דקות עם ניעור מתמשך ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר הסרת צינור הצנטריפוגה, פיפטה את התרחיף למעלה ולמטה מספר פעמים עם פיפטה של מיליליטר עד שלא יישארו חתיכות רקמה גדולות. לאחר מכן סנן את מתלה התא דרך מסנן סינון תאים של 70 מיקרומטר ואסוף את המסנן בצינור צנטריפוגה נקי של 50 מיליליטר. העבירו את המסנן לצינור צנטריפוגה חדש של 15 מיליליטר וצנטריפוגה ב-300 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן השליכו את הסופרנטנט עם פיפטה של מיליליטר אחד. כעת, פיפטה את מתלה התא למעלה ולמטה 20 פעמים עם 15 מיליליטר HBSS כדי לשטוף אותו וצנטריפוגה ב-300 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר השלכת הסופרנטנט, השעו מחדש את כדור התא במיליליטר אחד של מאגר מיון תאים המופעל על ידי מגנטית. כדי להתחיל, העבירו מיליליטר אחד מהתרחיף החד-תאי המוכן לצינור מיקרוצנטריפוגה של שני מיליליטר וצנטריפוגה ב -300 גרם למשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסרת הסופרנטנט, השעו מחדש את הגלולה החד-תאית ב-90 מיקרוליטר של מיון תאים מופעל מגנטי או מאגר מקסימלי. הוסף 10 מיקרוליטר של מיקרו-חרוזים CD11b או c ודגר את המתלה בארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות על שייקר אופקי. לאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של מאגר מקסימלי ישירות לצינור כדי לשטוף את המתלה החד-תאי. לאחר צנטריפוגה, השעו מחדש את גלולת התא ב-500 מיקרוליטר של מאגר מקסימלי. בעזרת פיפטה של מיליליטר אחד, העבירו את תרחיף התא התלוי מחדש לעמודת המיון בשדה המגנטי. בזמן שהוא נשאר בשדה המגנטי, שטפו את העמוד שלוש פעמים עם 500 מיקרוליטר של מאגר מקסימלי. לאחר מכן הסר את עמודת המיון מהשדה המגנטי. הוסף מיליליטר אחד של מאגר מקסימלי לעמוד ודחף אותו לאט לאט עם הבוכנה. אסוף את הזרימה דרך. כעת, זרעו את התאים שנבחרו לתוך צלחת של 24 בארות המכילה תלוש כיסוי מצופה בפולי-L-ליזין. מוסיפים 200 מיקרוליטר של מדיום תרבית ודוגרים למשך 20 דקות בחממה של 37 מעלות צלזיוס עם 95% חמצן, 5% פחמן דו חמצני ו-60 עד 80% לחות. כדי להתחיל, קחו את המיקרוגליה המתורבתת שבודדה מרקמת המוח של עכברים. אתר את המיקרוגליה הכדורית מתחת למיקרוסקופ מים באמצעות המטרה 40x. לאחר מכן, מלאו את האלקטרודה בתמיסה תוך-תאית והצמידו אותה לשלב ראש המגבר של מערך האלקטרופיזיולוגיה. הפעל לחץ חיובי. עבור למטרה 4x ואתר את האלקטרודה. ואז הורד את האלקטרודה לתמיסת האמבטיה. הגדר את המגבר למתח clamp מצב כדי לבצע את בדיקת הממברנה במצב אמבטיה. לאחר מכן, חזור למטרה של פי 40 וקירב את קצה האלקטרודה למיקרוגליה. לאחר מכן, הפעל לחץ שלילי זעיר כדי להחזיק את התא. כאשר ההתנגדות מגיעה ל 100 מגה אוהם, עבור ממצב אמבטיה לתיקון במבחן הממברנה. כאשר ההתנגדות מגיעה ל -300 מגה-אוהם, שחרר את הלחץ השלילי. כאשר ההתנגדות מצביעה על היווצרות חותם ג'יגה-אוהם בין האלקטרודה לקרום המיקרוגליה. עבור ממצב תיקון לתא בבדיקת הממברנה. לאחר מכן יש למרוח כמות קטנה של יניקה וליזום התחשמלות כדי לקרוע את הממברנה. לאחר מכן עבור למתח clamp מצב, פתח את תוכנית ההקלטה והקלט זרמי אשלגן למשך 200 אלפיות השנייה.