Name: בידוד ורישום Patch-Clamp של תא שלם של מיקרוגליה בהיפוקמפוס מעכברים בוגרים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:47:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: למד בידוד ורישום patch-clamp של תא שלם במיקרוגליה היפוקמפלית ממכרים בוגרים. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח פיזיולוגי מדויק של תאים בודדים בסביבתם הטבעית לחקר מחלות נוירולוגיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>רישום אלקטרופיזיולוגי של מיקרוגליה בהיפוקמפוס מעכברים בוגרים

<ol><li>Ginhoux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+mapping+analysis+reveals+that+adult+microglia+derive+from+primitive+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages.</a> Science. 330 (6005), 841-845 (2010).</li>
<li>Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+interactions+with+synapses+are+modulated+by+visual+experience%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience.</a> PLoS Biol. 8 (11), e1000527(2010).</li>
<li>Voet, S., Prinz, M., Van Loo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+central+nervous+system+inflammation+and+multiple+sclerosis+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Microglia in central nervous system inflammation and multiple sclerosis pathology.</a> Trends Mol Med. 25 (2), 112-123 (2019).</li>
<li>Salter, M. W., Beggs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sublime+microglia%3A+Expanding+roles+for+the+guardians+of+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sublime microglia: Expanding roles for the guardians of the CNS.</a> Cell. 158 (1), 15-24 (2014).</li>
<li>Wohleb, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuron-microglia+interactions+in+mental+health+disorders%3A+For+better%2C+and+for+worse%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neuron-microglia interactions in mental health disorders: For better, and for worse.</a> Front Immunol. 7, 544(2016).</li>
<li>Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratskya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Physiology of microglia.</a> Physiol Rev. 91 (2), 461-553 (2011).</li>
<li>Sarkar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+ion+channels%3A+Key+players+in+non-cell+autonomous+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Microglial ion channels: Key players in non-cell autonomous neurodegeneration.</a> Neurobiol Dis. 174, 105861(2022).</li>
<li>Hanisch, U. K., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%3A+Active+sensor+and+versatile+effector+cells+in+the+normal+and+pathologic+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia: Active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain.</a> Nat Neurosci. 10 (11), 1387-1394 (2007).</li>
<li>Collins, H. Y., Bohlen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+rodent+microglia+to+promote+a+dynamic+ramified+morphology+in+serum-free+medium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of rodent microglia to promote a dynamic ramified morphology in serum-free medium.</a> J Vis Exp. 133, e57122(2018).</li>
<li>Lyons, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+physiologic+properties+of+microglia+and+blood-borne+cells+in+rat+brain+slices+after+permanent+middle+cerebral+artery+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Distinct physiologic properties of microglia and blood-borne cells in rat brain slices after permanent middle cerebral artery occlusion.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 20 (11), 1537-1549 (2000).</li>
<li>Li, Q., Lan, X., Han, X., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+tmem119%2FSALL1+and+CCR2%2FCD69+in+FACS-sorted+microglia-+and+monocyte%2Fmacrophage-enriched+cell+populations+after+intracerebral+hemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Expression of tmem119/SALL1 and CCR2/CD69 in FACS-sorted microglia- and monocyte/macrophage-enriched cell populations after intracerebral hemorrhage.</a> Front Cell Neurosci. 12, 520(2018).</li>
<li>Sarkar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kv1.3+modulates+neuroinflammation+and+neurodegeneration+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Kv1.3 modulates neuroinflammation and neurodegeneration in Parkinson's disease.</a> J Clin Invest. 130 (8), 4195-4212 (2020).</li>
<li>Maezawa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kv1.3+inhibition+as+a+potential+microglia-targeted+therapy+for+Alzheimer%27s+disease%3A+Preclinical+proof+of+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Kv1.3 inhibition as a potential microglia-targeted therapy for Alzheimer's disease: Preclinical proof of concept.</a> Brain. 141 (2), 596-612 (2018).</li>
<li>Delbridge, A. R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+culture+microglia+exhibit+molecular+similarity+to+acutely+isolated+adult+microglia+and+provide+a+platform+to+study+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice culture microglia exhibit molecular similarity to acutely isolated adult microglia and provide a platform to study neuroinflammation.</a> Front Cell Neurosci. 14, 592005(2020).</li>
<li>Volden, T. A., Reyelts, C. D., Hoke, T. A., Arikkath, J., Bonasera, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+flow+cytometry+and+magnetic+bead-based+methods+to+enrich+cns+single+cell+suspensions+for+quiescent+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmune+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Validation of flow cytometry and magnetic bead-based methods to enrich cns single cell suspensions for quiescent microglia.</a> J Neuroimmune Pharmacol. 10 (4), 65-665 (2015).</li>
<li>Wulff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+voltage-gated+kv1.3+k%28%2B%29+channel+in+effector+memory+t+cells+as+new+target+for+ms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">The voltage-gated kv1.3 k(+) channel in effector memory t cells as new target for ms.</a> J Clin Invest. 111 (11), 1703-1713 (2003).</li>
<li>Tan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocytin-labeling+in+whole-cell+recording%3A+Electrophysiological+and+morphological+properties+of+pyramidal+neurons+in+CYLD-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Biocytin-labeling in whole-cell recording: Electrophysiological and morphological properties of pyramidal neurons in CYLD-deficient mice.</a> Molecules. 28 (10), 4092(2023).</li>
<li>Manitz, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+characterization+of+microglia+in+the+offspring+of+polyi%3AC+treated+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric characterization of microglia in the offspring of polyi:C treated mice.</a> Brain Res. 1636, 172-182 (2016).</li>
<li>Xu, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+protocol+of+mouse+hippocampal+primary+microglia+culture+by+using+manual+dissociation%2C+magnetic+activated+cell+sorting+and+tic+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Sheng+Li+Xue+Bao%22%5BJournal%5D)">A modified protocol of mouse hippocampal primary microglia culture by using manual dissociation, magnetic activated cell sorting and tic medium.</a> Sheng Li Xue Bao. 71 (6), 883-893 (2019).</li>
<li>Zelenka, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+protocol+for+the+isolation+of+highly+purified+neonatal+murine+microglia+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Novel protocol for the isolation of highly purified neonatal murine microglia and astrocytes.</a> J Neurosci Methods. 366, 109420(2022).</li>
<li>Keren-Shaul, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+microglia+type+associated+with+restricting+development+of+alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A unique microglia type associated with restricting development of alzheimer's disease.</a> Cell. 169 (7), 1276-1290.e17 (2017).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Various+cell+populations+within+the+mononuclear+fraction+of+bone+marrow+contribute+to+the+beneficial+effects+of+autologous+bone+marrow+cell+therapy+in+a+rodent+stroke+model%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Stroke+Res%22%5BJournal%5D)">Various cell populations within the mononuclear fraction of bone marrow contribute to the beneficial effects of autologous bone marrow cell therapy in a rodent stroke model.</a> Transl Stroke Res. 7 (4), 322-330 (2016).</li>
<li>Gingras, M., Gagnon, V., Minotti, S., Durham, H. D., Berthod, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+protocols+for+isolation+of+primary+motor+neurons%2C+astrocytes+and+microglia+from+embryonic+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized protocols for isolation of primary motor neurons, astrocytes and microglia from embryonic mouse spinal cord.</a> J Neurosci Methods. 163 (1), 111-118 (2007).</li>
<li>Ramesha, S., Rayaprolu, S., Rangaraju, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+approach+to+characterize+phagocytic+properties+of+acutely-isolated+adult+microglia+and+brain+macrophages+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry approach to characterize phagocytic properties of acutely-isolated adult microglia and brain macrophages in vitro.</a> J Vis Exp. 160, e61467(2020).</li>
<li>Mccarthy, K. D., De Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).</li>
<li>Sakmann, B., Edwards, F., Konnerth, A., Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+used+for+studying+synaptic+transmission+in+slices+of+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Q+J+Exp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques used for studying synaptic transmission in slices of mammalian brain.</a> Q J Exp Physiol. 74 (7), 1107-1118 (1989).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>צלחת פטרי 100 מ"מ</td><td>קורנינג</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל צינורות בז</td><td>BD</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 24 בארות</td><td>BD</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>35 מ"מ צלחת פטרי</td><td>קורנינג</td><td></td> <td>353001-50</td></tr> <tr><td>מ"ל צינורות פלקון</td><td>BD</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m סינון תאים</td><td>Miltenyi</td><td>130-095-823</td><td>להסרת גושי תאים לפני מיון תאים</td></tr><tr><td>ערכת דיסוציאציה של מוח עכבר בוגר</td><td>Miltenyi</td><td>130- 107-677</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן Anti-CD11b</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA74</td><td>Goat Anti-Mouse IgG זמין גם כן. לחסימת אימונוגלובולינים אנדוגניים.</td></tr><tr><td>נוגדן נגד Iba 1</td><td>SYSY</td><td>234308</td><td>עז נגד שרקנים IgG) זמין גם כן. לחסימת אימונוגלובולינים אנדוגניים.</td></tr><tr><td>Axon Digidata 1440A</td><td>ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מגבר Axon MultiClamp 700B</td><td>ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA אלבומין שבר V</td><td>BioFrox</td><td>4240GR500</td><td>סרום</td></tr><tr><td>C57BL/6 עכברים&nbsp;</td>מרכז <td></td><td></td><td>בעלי חיים מעבדה רפואית גואנגדונג</td></tr><tr><td>CD11 b/c מיקרו-חרוזים</td><td>Miltenyi</td><td>130-105-634</td><td></td></tr><tr><td>כלורל הידרט</td><td>אבסין</td><td>abs47051394</td><td>בשימוש נרחב כהרדמה בעכברים</td></tr><tr><td>Clampfit 10.6</td><td>ארה"</td><td></td><td></td></tr>ב <tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Zeiss</td><td>&nbsp; LSM 800</td><td></td></tr><tr><td>תרבות בינוני</td><td>פישר מדעי</td><td></td> <td>C11995500BT-DAPI</td></tr> <tr><td>צבע</td><td>Beyotime</td><td>C1002</td><td></td></tr><tr><td>חולץ אלקטרודות</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Servicebio</td><td>G4203</td><td></td></tr><tr><td>שייקר אופקי</td><td>SCILOGEX</td><td>SLK-O3000-S</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת ניתוח תמונה</td><td>פיג'י</td><td></td><td></td></tr><tr><td>עמודות MACS</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>מפרידי MACS</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>T353-500</td><td>השתמש בתמיסה טרייה של 4% ב-1X PBS, pH 7.2-7.4.&nbsp;</td></tr><tr><td>פולי-ליזין</td><td>ביוטיים</td><td>&nbsp; ציפוי C0313</td><td>Coverslip</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד ורישום patch-clamp של תא שלם של מיקרוגליה בהיפוקמפוס מעכברים בוגרים

Isolation and Whole-Cell Patch-Clamp Recording of Hippocampal Microglia from Adult Mice

בקצרה, התהליך כולל בידוד של מיקרוגליה בהיפוקמפוס ממוח העכבר הבוגר ואחריו רישום של תאים אלה על ידי תאים שלמים (איור 1). ההליך מתחיל בניתוח ההיפוקמפוס של עכברים בוגרים בני 3 עד 5 חודשים C57BL/6J. באופן ספציפי, המוח כולו מוסר אחרי הזלוף ומונח בצלחת תרבית שמכילה PBS קר כקרח (איור 2A). כדי להבטיח בידוד חריף של תאים מההיפוקמפוס, קליפת המוח מוסרת, ורקמת ההיפוקמפוס בצורת סהר מבודדת שלמה (איור 2B).
לאיכות תאים אופטימלית ולהקלטות מהדק תיקון איכותיות לאחר מכן, חיוני לשלוט בזמן העיכול במהלך הכנת התרחיף החד-תאי. המחקר עורר באופן עקבי באופן ידני את רקמת ההיפוקמפוס בתערובת האנזימים והגביל בקפדנות את תקופת העיכול ללא יותר מ-15 דקות (איור 3). לאחר מכן בודדו התאים בשיטת MACS, והשיגו טוהר של 86.20% ±-0.68%19,20. כדי לאשר שהתאים הממוינים הללו הם מיקרוגליה, סמני פני השטח של מיקרוגליה נבדקו על ידי אימונופלואורסצנציה באמצעות נוגדנים אנטי-Iba1 ו-CD11b, הנמצאים בשימוש נרחב לאיתור מיקרוגליה18. התוצאות הצביעו על כך שהתאים המבודדים היו חיוביים ל-CD11b ו-Iba1, מה שאישר את הבידוד המוצלח של מיקרוגליה (איור 4).
לבסוף, כדי להעריך אם המיקרוגליה המבודדת באופן חריף היא באיכות גבוהה לניסויי מעקב, אנו מתארים כיצד לבצע הקלטות של מהדק טלאי תא שלם כדי להעריך זרמי אשלגן מיקרוגליאליים. למיקרוגליה המתועדת הייתה קיבול ממברנה ממוצע של 10.42 ±-2.05 (איור 5). התוצאות הראו שניתן לרשום זרמי אשלגן מיקרוגליאליים, מה שמצביע על כך שהמיקרוגליה המבודדת באופן חריף מתאימה למחקרים נוירו-ביולוגיים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67315/67315fig01.jpg"> 
איור 1: סקירה כללית של הליך הניסוי. ישנם ארבעה שלבים עיקריים: רקמות המוח נשאבות בקפידה, וההיפוקמפוס מנותח באופן דו-צדדי; רקמות ההיפוקמפוס מתעכלות להכנת תרחיף חד-תאי באמצעות תערובת אנזימים כמפורט בסעיף הפרוטוקול; תאי המטרה מבודדים בשיטת מיון תאים המופעלת מגנטית; וזרמי אשלגן בתאים מבודדים באופן חריף נבדקים על ידי הקלטת מהדק תיקון של תא שלם. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67315/67315fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67315/67315fig02.jpg"> 
איור 2: דיסקציה של ההיפוקמפוס. (A) כל המוח של עכבר בן 3 עד 5 חודשים. (B) היפוקמפוס דו-צדדי מבודד. סרגל קנה מידה: 0.5 ס"מ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67315/67315fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67315/67315fig03.jpg"> 
איור 3: דיאגרמה סכמטית שמראה עיכול של רקמות היפוקמפוס. המחשה של שלבי ניסוי קריטיים, המבטיחים שרקמת ההיפוקמפוס מתעכלת לתרחיף של תא בודד על ידי הוספת תערובות אנזימים ב-37 מעלות צלזיוס עם ניעור מתמשך עד 15 דקות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67315/67315fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67315/67315fig04.jpg"> 
איור 4: זיהוי של מיקרוגליה היפוקמפוס מבודדת באופן חריף. תמונות קונפוקליות מייצגות המציגות תאים חיוביים CD11b (ירוק) ו-Iba1 (אדום) מטוהרים מההיפוקמפוס, ומאשרים שהתאים המבודדים הם מיקרוגליה. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67315/67315fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה מוגדלת של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67315/67315fig05.jpg"> 
איור 5: רישום זרמי אשלגן מיקרוגליאלי של תאים שלמים. (A) אלקטרודת הקלטה ממוקמת על פני השטח של מיקרוגליה היפוקמפוס מבודדת. סרגל קנה מידה: 20 מיקרומטר. (B) זרמי אשלגן מייצגים של מיקרוגליה היפוקמפוס מבודדת באופן חריף בתנאי מהדק מתח. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67315/67315fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

בידוד ורישום Patch-Clamp של תא שלם של מיקרוגליה בהיפוקמפוס מעכברים בוגרים

Microglia are resident immune cells in the brain that interact with neurons to maintain the homeostasis of the central nervous system (CNS). Studies show ...

isolation-whole-cell-patch-clamp-recording-hippocampal-microglia-from

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

ההכנה של פרוסות חריפות מוח מhippocampi המבודד, כמו גם את ההקלטות אלקטרו סימולטני של האסטרוציטים ונוירונים...

קלטות אלקטרו כפולות של תגובות Astroglial ועצביות עוררו-synaptically בפרוסות ביפוקמפוס חריפות

הסרטון מדגים טכניקה לבידוד תאי מיקרוגליה מקליפת המוח של מוח עכבר בוגר. ראשית, קליפת המוח עוברת סגמנטציה והומוגניזציה כדי להסיר תאי עצב ותאי גלייה אחרים, תוך שמירה על תאי מיקרוגליה. לאחר מכן, תרחיף התא נחשף למיקרו-כדוריות מגנטיות אנטי-מיאלין ולשדה מגנטי, המפריד ביעילות תאי מיקרוגליה ומיאלואיד מפסולת המיאלין ותאים המכילים מיאלין.

בידוד תאי מיקרוגליה מקליפת המוח של מוח עכבר בוגר

הסרטון מדגים פרוטוקול לחקר אינטראקציות סינפטיות ותגובות עצביות בפרוסת מוח של עכבר נגוע בהיפוקמפוס. היא כוללת הארת נוירונים חושיים ארוכי טווח כדי להפעיל פוטנציאלי פעולה ורישום הפוטנציאלים הפוסט-סינפטיים המעוררים המתקבלים בתא העצב המוקלט באמצעות טכניקת מהדק טלאי של התא כולו.

פוטו-טימולציה והקלטות מהדק טלאי של תא שלם של תאי עצב בפרוסות היפוקמפוס עכבר

סרטון זה מדגים הקלטה של פעילות רשת עצבית קצבית, הידועה גם בשם תנודות תטא, בהיפוקמפוס מבודד. אלקטרודות מוכנסות לשכבות שונות ולמיקומים מרחביים שונים כדי לזהות ולנתח תנודות תטא. זה מראה את ההרכבים העצביים הייחודיים ואת הקישוריות של הרשת העצבית על פני שכבות שונות של ההיפוקמפוס.

הקלטה חוץ גופית של תנודות תטא בהיפוקמפוס העכבר

מפתח אחד לחקירה מוצלחת של הביולוגיה microglial הוא שימור immunofunction microglial vivo לשעבר במנותק מרקמת מערכת העצבים המרכזית. בידוד מיקרוגליה דרך תוצאות רועדות סיבוביות בתרביות תאים טהורות וimmunofunctional מאוד כפי שהוערך על ידי הדמיה ניאון, immunocytochemistry, והפעלת מיקרוגליה הבאות ELISA עם lipopolysaccharide מעודדי דלקת הגירויים (LPS) ופאם 3 צסק"א 4 (פאם).

בידוד של קליפת המוח Microglia עם immunophenotype משומר ופונקציונאלי מילודי Murine

רשתות קליפת המוח נשלטות על ידי קבוצה קטנה, אך מגוונת של interneurons המעכב. חקירה פונקציונלית של interneurons לכן דורשת הקלטה ממוקדת וזיהוי קפדני. שתואר כאן היא גישה משולבת הכוללת כל תא הקלטות מזוגות בודדים או synaptically מצמידים של נוירונים עם תיוג תאיים, שלאחר הוק מורפולוגיים וניתוח immunocytochemical.

הקלטות תיקון מהדק כל התא מMorphologically- וinterneurons היפוקמפוס זיהה Neurochemically

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להקלטת קצבית רשת עצבית theta ו תנודות גמא מ הכנה בהיפוקמפוס שלם מבודד. אנו מתארים את השלבים ניסיוני מן החילוץ של ההיפוקמפוס לפרטים של שדה, יחידית תא שלם קליפת הקלטות מהדק, כמו גם צעדה optogenetic של קצב theta.

כוונון להקת הטטה בהיפוקמפוס<em&gt; במבחנה</em&gt; מתודולוגיות להקלטת מכרסמת מבודדת מעגל ספוטוהיפוקמפוס

אנו מספקים פרוטוקול עבור בידוד של מיקרוגלייה מאזורים בגזור שונים של המוח העכבר באמצע המחצית, ואחריו הכנה חצי אוטומטי הספריה לרצף העמוק של RNA תא בודד של טרנססקריפט באורך מלא. שיטה זו תסייע להבהיר טרוגניות תפקודית של מיקרוגלייה בריאות ומחלות.

בידוד של אזור-מיקרוגליה ספציפי מתוך חצי הכדור השני של המוח העכבר עבור רצפי RNA של תא יחיד בודד

אנו מציגים פרוטוקול להכנת פרוסות חריפות מההיפוקמפוס הגבי-ביניים של עכברים. אנו משווים הכנה רוחבית זו עם חתך קורנל במונחים של איכות הקלטות ושמירה על תכונות מורפולוגיות של נוירונים מוקלטים.

הכנת פרוסות חריפות מהיפוקמפוס הגבי להקלטה של תא שלם ושחזור עצבי בGyrus דנטאטה של עכברים בוגרים

מאמר זה מתאר שיטה לתצפית כרונית in vivo של תאי מיקרוגליה במנוחה בהיפוקמפוס עכבר CA1 באמצעות ניתוח מבוקר מדויק ומיקרוסקופ שני פוטונים.

ב Vivo הדמיה כרונית של שני פוטונים של תאי מיקרוגליה בהיפוקמפוס העכבר

אנו מתארים פרוטוקול לבידוד תאי מיקרוגליאה מההיפותלמוס של העכבר (או מבני מוח קטנים מקבילים) באמצעות מיון תאים מופעל מגנטית (MACS), בזמן קצר יחסית. מיקרוגליה היפותלמית ממוינת MACS יכולה לשמש לניתוח ex vivo וניתן לצפות אותה לביצוע בדיקות חוץ גופיות .

בידוד של תאי מיקרוגליה היפותלמיים ממוח עכבר בוגר שזה עתה מחורר על ידי מיון תאים המופעלים על ידי מגנטית  

למד בידוד ורישום patch-clamp של תא שלם במיקרוגליה היפוקמפלית ממכרים בוגרים. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח פיזיולוגי מדויק של תאים בודדים בסביבתם הטבעית לחקר מחלות נוירולוגיות.

בידוד ורישום Patch-Clamp של תא שלם של מיקרוגליה בהיפוקמפוס מעכברים בוגרים

גלה סרטונים נוספים