זיהוי וכימות של מטבוליטים מטורפים בחולים קריטיים באמצעות מטבולומיקה מבוססת NMR

המחקר שלנו משתמש במטבולומיקה מבוססת NMR כדי לזהות מטבוליטים לא מווסתים ומסלולים ביוכימיים אשר משתנים בחולים קריטיים בטיפול נמרץ, וכללנו גם חולים של ARDS, שהוא מצב ריאות חמור. על ידי יצירת פרופיל והשוואת החתימות המטבוליות, אנו שואפים לחשוף את ההפרעות הביוכימיות הקשורות להתקדמות המחלה ולהתאים אישית טיפולים לשיפור התוצאות. למעשה, אנו מנסים להתמודד עם הפער בהבנת חוסר ויסות מטבולי בכל הקטגוריות של חולי ARDS, הכולל חולי ARDS קלים, בינוניים וקשים.

לשפר את התובנות שלנו, להבנה טובה יותר של המחלה, התקדמותה, במטרה הכוללת לשפר את התוצאה של המטופל על ידי מתן רפואה מדויקת ומותאמת אישית. NMR מציע הכנת דגימות קלה, שמירה על שלמות הסרום לניתוח מחדש ואיתור מטבוליטים ידועים ולא ידועים ללא פירוק כימי. הוא מספק נתונים כמותיים הניתנים לשחזור, ומבטיח מדידת מטבוליטים אמינה.

שלא כמו גישות ממוקדות, NMR מאפשר חקירה רגישה ובלתי משוחדת של שינויים מטבוליים, מה שהופך אותו אידיאלי לגילוי חתימות ומסלולים בהתקדמות המחלה. הממצא שלנו ישפר את מחקר ARDS על ידי חשיפת שינויים מטבוליים בשלבים שונים, אשר נחקרו פחות. באמצעות מטבולומיקה מבוססת NMR, אנו שואפים לזהות מטבוליטים ומסלולים שאינם מווסתים, מה שמוביל לחתימות פוטנציאליות לאבחון מוקדם, פרוגנוזה, חיזוי וטיפולים בזמן טוב יותר.

גישה זו מקדמת ניהול מותאם אישית ומעמיקה את הידע בפרופיל מטבולי רב-מדינתי. התוצאות שלנו סללו את הדרך לשאלות מדעיות חדשות, כגון: כיצד מטבוליטים ספציפיים המזוהים בשלבים שונים של ARDS משפיעים על התקדמות המחלה? האם ניתן למקד מסלולים לא מווסתים אלה להתערבויות טיפוליות מוקדמות?

נוסף על כך, כיצד השינויים המטבוליים הללו משתנים בין מצבים נשימתיים או דלקתיים אחרים? כדי להתחיל, באמצעות מחט סטרילית, לאסוף שני מיליליטר של דם מן העורקים של חולה שאובחן עם תסמונת מצוקה נשימתית חריפה קלה או בינונית או ARDS. מעבירים דם לבקבוקון סטרילי ומאפשרים לו להיקרש במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.

צנטריפוגה את הדם קרוש ב 3, 100 G במשך 15 דקות כדי להפריד את הסרום. מעבירים את הסרום לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגות סטריליות, מה שהופך aliquots של 400 עד 500 מיקרוליטר. תייגו את הצינורות עם פרטי המטופל ואחסנו אותם בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס.

עבור ניסויי NMR, ערבבו 250 מיקרוליטר של aliquot בסרום עם 250 מיקרוליטר של חיץ פוספט מלוחים כדי למזער את השונות ב- pH. מערבבים את התערובת במשך כ-15 שניות כדי להבטיח ערבוב הומוגני. מעבירים את הדגימה המוכנה לצינור NMR נקי עם תוספת קואקסיאלית המכילה TSP בריכוז של 0.05 מילימולר.

לאחר מכן, הכניסו את צינור ה-NMR לתוך המגנט. הקלד WRPA ובחר את מספר הניסוי המתאים כדי להגדיר ניסוי פרוטון עם תוכנית הדופק CPMG. לחץ על כותרת אפשרות להזין את שם המטופל ופרטים נחוצים אחרים.

הקלד Lock והקש Enter כדי לנעול את השדה המגנטי. לאחר מכן, בחר את האפשרויות 90% מים ו 10% תחמוצת דאוטריום. לאחר מכן, הקלד ATMM ולחץ על Enter כדי לבצע כוונון והתאמה של הבדיקה.

לאחר מכן, מתוך פרמטרים רכישה אופציה, בחר את הפרמטרים כמו 64, 000 נקודות על 128 סריקות כדי לאסוף נתוני אופטימיזציה. הגדר את השהיית ההרפיה של חמש שניות, רוחב טאטוא ספקטרלי של 12 PPM וזמן הד של 200 מיקרו-שניות, החוזר על עצמו 300 פעמים. החל הרחבת קו של 0.3 הרץ באמצעות פונקציית חלון מעריכית.

לאחר מכן, באמצעות כלי עיבוד וניתוח NMR, לרכוש את ספקטרום NMR. לאחר קבלת הספקטרום הסופי, הקלד APK ו- ABSN כדי לבצע תיקון פאזה ותיקון קו בסיס בהתאמה. לאחר מכן, לחץ על האפשרות כיול ציר בחלונית העליונה וכייל את שיא TSP ל- 0 PPM, באופן אוטומטי או ידני.

לבסוף, להעביר את הנתונים שנרכשו ממערכת NMR לתחנת העבודה לניתוח נוסף. לאחר רכישת ספקטרום NMR של חולים שאובחנו עם ARDS, פתח תוכנת כימות מטבוליטים NMR לעיבוד נתונים. כדי לבצע תיקון קווי בסיס ידני בשיטת Whitaker, פתח את הקובץ הספקטרלי במודול המעבד של תוכנת כימות מטבוליטים NMR.

בחרו 'תיקון קו בסיס' ובחרו בשיטה 'וויטאקר'. מקם נקודות בבסיס הפסגות בכל הספקטרה. לאחר שתסיים, שמור את הקבצים הספקטרליים שתוקנו בקו הבסיס בתיקייה אחת.

לאחר מכן, כדי לבצע בינינג ספקטרלי באמצעות מודול Profiler, בחר את כלים, ולאחר מכן תהליך אצווה, ואחריו בינינג ספקטרלי. ליצירת גיליון האיגוד הסופי לניתוח סטטיסטי, בחר בתיקייה הכוללת את כל הקבצים הספקטרליים המתוקנים בקו הבסיס. חלק את הספקטרום לפחים בגודל שווה עם רוחב ספקטרלי מוגדר הנע בין 0.01 ל- 0.04 חלקים למיליון.

ציין את גודל הדלי ואת ערכי PPM של התחלה וסוף. בחר תיקייה לשמירת גיליונות שילוב הפלט. אל תכלול את אזורי השינוי הכימי המתאימים למים ואת TSP הממס כדי למנוע הפרעות ספקטרליות.

הגיליון האלקטרוני הסופי יציג שמות לדוגמה בשורה אחת וערכי סלים עם PPM מתאים בשורות אחרות. לפני ביצוע ניתוח סטטיסטי, נרמל את הנתונים באמצעות נורמליזציה מסוימת, המרת יומן וקנה מידה של Pareto. עבור ניתוח רב-משתני, בצע ניתוח רכיבים עיקריים, ניתוח מפלה של ריבועים חלקיים חלקיים וניתוח מפלה של ריבועים חלקיים אורתוגונליים כדי לבחון אפליה בין הקבוצות, מה שמניב חשיבות משתנה של ציוני השלכה עבור כל מטבוליט האחראי להבדל בפרופיל המטבולי.

בצע מבחן t של סטודנט כדי לזהות מטבוליטים משמעותיים עם ערך p של פחות מ -0.05. בדיקות T מייצרות חלקות שפם קופסאות המציגות הבדלים בריכוזי מטבוליטים. לאחר מכן, בצע ניתוח סמנים ביולוגיים כדי ליצור אזור מתחת לגרף העקומה האופיינית להפעלה של המקלט.

בחר את הרשימה הסופית של מטבוליטים משמעותיים בהתבסס על חשיבות משתנה של ציון הקרנה גדול מאחד, ערך p מתוקן בונפרוני קטן מ-0.05 ואזור מתחת לעקומה גדול מ-0.8. באמצעות מסד הנתונים של חילוף החומרים האנושי, זהה את המטבוליטים המתאימים לערכי PPM ספציפיים. לפני תחילת הכימות, באמצעות מודול המעבד, לכייל את תרכובת הייחוס שנבחרה למחקר.

לחץ על האפשרות כיול מחוון הזזה כימית והזן את ריכוז תרכובת הייחוס. גרור את פסגת התוכנה אל שיא הייחוס הספקטרלי והתאם את גובהה ורוחבה. לאחר ששיאי הייחוס הספקטרליים מתיישרים עם שיא התוכנה, לחץ על קבל.

לאחר מכן, פתח את הספקטרום הרצוי במודול Profiler ובחר את ספריית המתחם המתאימה למחקר. בתחתית המסך תוצג רשימה של מטבוליטים. בחר את המטבוליט של עניין מהרשימה.

לחץ על ערך PPM בפינה העליונה של המסך. התקרב לספקטרום לסולם PPM הספציפי של המטבוליט. בשלב זה, שני פסגות מופיעות על המסך, האחת מייצגת את הנתונים המוקלטים והשנייה, המוצגת כקו מקווקו, המייצג את שיא התוכנה.

גרור את שיא התוכנה כדי ליישר אותו עם הפסגה שהוקלטה, תוך התאמת הגובה והמיקום בהתאם. לאחר שהפסגות מיושרות כראוי, קרא את ריכוז המטבוליט מהערך המוצג תחת הכותרת ריכוז במילימולר. כדי ליצור את קובץ הפלט, תחת כלים תפריט, לחץ על פעולות אצווה אפשרות וציין את התיקיה הרצויה לשמירת קובץ הפלט.

ניתוח רכיבים עיקריים הראה אשכולות ברורים בין קבוצות חולים ARDS קלות ומתונות. ניתוח מפלה אורתוגונלי חלקי לפחות ריבועים גילה הפרדה ברורה בין קבוצות ה- ARDS המתונות והמתונות, תוך הדגשת הבדלים מטבוליים. מבחן t של סטודנטים וניתוח סמנים ביולוגיים חשפו מטבוליטים לא מווסתים מרכזיים בין ARDS, קל ומתון.

לקטט ואיזולאוצין זוהו כמטבוליטים לא מווסתים באופן משמעותי בקורלציה עם חומרת ARDS.