הדמיה אורכית תוך-חיונית של דינמיקת כלי הדם במח העצם הגולגולתי

מחקר זה מתמקד בהבנת הדינמיקה של כלי הדם במאקרו-סביבה של מח העצם באמצעות מיקרוסקופיה תוך-חיונית, במטרה לחשוף כיצד כלי הדם מגיבים להמטופואיזיס נורמלי ופתולוגי. אנו משתמשים בטכנולוגיות הדמיה מתקדמות כמו פוטומיקרוסקופיה, מודלים של בעלי חיים טרנסגניים, ומנתחים עוקב כדי לדמיין ולכמת שינויים דינמיים בכלי הדם ברקמה חיה לאורך זמן. ההתקדמות העיקרית היא חידוד הפרוטוקול שלנו לשיפור רווחת בעלי החיים ויישור קו עם שלושת ה-Rs.גישת האורך שלנו ממזערת את השלבים הכירורגיים ומפחיתה משמעותית את מספר בעלי החיים הדרושים למחקר שלנו.

הפרוטוקול שלנו נותן מענה לצורך בהדמיה תוך-חיונית לא רעילה לטווח ארוך על ידי שימוש במיקרוסקופ דו-פוטוני, המאפשר חדירה לרקמות עמוקות והדמיה ברזולוציה גבוהה של התנהגות התאים והאינטראקציה. שימוש בשתל הראש המודפס בתלת מימד יקל מאוד על מציאת אזור העניין במהלך הדמיה אורכית מבלי לכוון לשנות את הגובה, או הזווית, או הסדר. כיום אנו משתמשים בפרוטוקול זה כדי לעקוב אחר תת-סוגים ספציפיים של אנדותל ותגובתם להתפתחות לוקמיה וטיפול תרופתי כדי להבין טוב יותר את תרומתם לפתוגנזה של המחלה.

כדי להתחיל, הפעל את תוכנת הפילוח וייבא את קבצי המיקרו-CT DICOM כדי לבודד את הגולגולת. בצע פילוח מבוסס סף כדי להפריד את רקמת העצם מהמבנים שמסביב. כוונן באופן ידני אזורים מורכבים או רועשים כדי למקד את הפילוח.

ב-3D Sroller, ייבא את קובצי DICOM וטען את ערכת הנתונים. התבונן בפרוסות ה-CT בתצוגות הפרוסות הציריות, הסגיטליות והקורונליות. פתח את עורך הפלחים ולחץ על הוסף כדי ליצור פילוח חדש, ולאחר מכן לחץ שוב על הוסף כדי ליצור פלח חדש לסף.

בחלונית עורך הפלחים, לחץ על אפקט הסף. התאימו את מחווני הסף התחתון והעליון או הזינו ערכים מספריים כדי לסמן את האזור המפולח באדום. כדי לייצא את הגולגולת המפולחת כקובץ stl, עבור למודול הפילוח.

ודא שמקטע הסף נבחר. במקטע מודלים של ייצוא/ייבוא ומפות תוויות, הגדר את סוג הייצוא למודלים ואת פורמט הקובץ ל-stl ולאחר מכן לחץ על ייצוא כדי לשמור את הקובץ. להכנת מודל הגולגולת ב-CAD, ייבא תחילה את מודל הגולגולת הפשוט בפורמט stl לתוכנת ה-CAD כחלק או דגם חדש.

במישור החציוני, צור ציר משיק לקלבריה, ולאחר מכן שמור את דגם הגולגולת המוכן. צור סקיצה במישור הגולגולתי ועצב קו בצורת אגס מ-AP פלוס 6.5 עד מינוס שתיים. עם רוחב של שישה מילימטרים ב-AP 0.0, זה יהיה קווי המתאר של פני השטח הנצפים.

תכנן את זנב השתל תוך הקפדה על התאמה למבנה הגולגולת לקיבוע נכון תוך כיבוד הנפח הזמין. לבסוף, צור כיסוי מגן כדי להגן על חלון התצפית כאשר אינו בשימוש. הניחו עכבר מורדם על כרית חימום המכוונת ל-37 מעלות צלזיוס ועקבו חזותית אחר קצב הנשימה.

לגלח את ראש העכבר עם סכין גילוח חשמלי. לאחר מכן מרחו טיפת ג'ל עיניים על עיני העכבר. ודא שכל השיער מוסר כדי למנוע חפצי הדמיה ולהפחית את הסיכון לזיהום בפצע.

כעת, השתמש בזוג מלקחיים ומספריים סטריליים כדי לבצע חתך קטן בחלק המרכזי של הקרקפת כדי לחשוף את צלקת העצם המרכזית. הסר את רקמת החיבור בין הגולגולת לקרקפת. מערבבים מספיק מלט שיניים בצלחת פטרי כדי ליצור משחה.

מרחו אותו במהירות על החלק התחתון של שתל קיבוע הראש. מבלי לאפשר למלט דנטלי להיכנס לאזור ההדמיה, הנח את מחזיק הראש על הגולגולת החשופה ותן לו להתייצב. הפעל את זרימת האיזופלורן לכיוון המסכה הסטריאוטקסית של המיקרוסקופ.

כעת, הביאו את העכבר במהירות למיקרוסקופ. הכנס בזהירות את שיני העכבר למסכה כדי להבטיח חדירה תקינה של איזופלורן על ידי הרמת אפו ביד אחת. תוך כדי החזקת העכבר ביד אחת, החלק בעדינות את זנב היונה של שתל קיבוע הראש לתוך מחזיק הקיבוע ביד השנייה.

אבטח אותו בחצי סיבוב של כפתור הבורג. לאחר מכן, הציגו בדיקה רקטלית משובצת מראש בג'ל על בסיס מים כדי לנטר את טמפרטורת העכבר. מלאו את תא ההדמיה הראשי בכמות גדולה של ג'ל על בסיס מים, או PBS.

הורד את מטרת הטבילה במים עד לטבילה מלאה לעירור אופטימלי וזיהוי אותות במהלך עירור דו-פוטוני. הזז את שלב ה-x, y ואת כונן z כדי להתמקד בעצם המרכזית בצלקת הפיגום. זהה את הרקמה המסומנת על ידי משטח העצם והווריד המרכזי.

כבו את האור בחדר וסגרו את הקופסה סביב מעמד המיקרוסקופ. לאחר הפעלת הגלאים שאינם TOSCAN. הגדר PMT1 לזהות SHG שני ב-423 עד 461 ננומטר, D2 גבוה עבור GFP ב-485 עד 548 ננומטר, ו-D3 גבוה עבור TD D'Amato ב-551 עד 645 ננומטר.

השאר את הקיזוז על אפס. כעת, הגדר את רווח ה-PMT SHG ל-850 וולט ואת רווחי ה-D הגבוהים ב-100%הגדל את עוצמת הלייזר האינפרא אדום עד שתמונה עם טווח דינמי של 200 רמות אפור נראית בנמוך מבין שלושת הערוצים. בתוכנת הרכישה, אזור האיתור המכיל כיסי מח עצם, המצוין בתוך משטחי העצם.

כדי לזהות אזורי עניין שונים, או החזר ROI, הפעל את Loss Navigator וצור סקירה כללית באמצעות מצב ספירלה. לחץ על סמל התמונה הבודדת כדי לתעד מיקומי החזר ROI שנבחרו ולשנות את שם כל מיקום ברשימת המשימות. כדי לרכוש נפח מחסנית Z, בחר במצב מחסנית Z והגדר את גודל הצעד בשלושה מיקרומטרים.

בטל/י את הבחירה באפשרות ״גודל ערימה זהה״ עבור כל האזורים, ואז לחץ/י על ״התחלה״ כדי להתחיל ו״סיום״ כדי לסיים. לאחר הלכידה, לחץ על Redefine Stack. לחץ על התחל כדי להתחיל באיסוף התמונות ולשמור את התמונות בתיקיה המתאימה.

כדי למדוד תכונה דינמית, כגון חדירות כלי דם, שנה את מצב הרכישה ל-XYZT כדי לרכוש זמן-lapse. במודול T, התאם את מרווח הזמן לשלוש דקות ואת משך הזמן לשעה. כעת, הזריקו 100 מיקרוליטר של 70 קילודלטון דקסטרן TRITC לווריד בריכוז של ארבעה מיליגרם למיליליטר, והתחילו ברכישה.

לאחר העברת העכבר לסימן ניתוח על כרית חימום של 37 מעלות צלזיוס, מרחו ג'ל תוך-אתר על הגולגולת כדי לשמור על לחותה. סגור את אזור ההדמיה של שתל הראש עם המכסה הספציפי ואבטח בזהירות את המכסה באמצעות בורג. הכנס את העכבר לקופסת החימום המוגדרת ל -37 מעלות צלזיוס והמתן שיתעורר.

לאחר שהעכבר התאושש לחלוטין, העבירו אותו למתקן בעלי החיים ושיכנו אותו בכלוב נקי עם הידרוג'ל והעשרה סביבתית. לרכישות אורכיות, הניחו טיפה קטנה של ג'ל עיניים על עיני עכבר עם מחזיק ראש שכבר מותקן. השג את תמונת הסקירה כפי שהודגם קודם לכן.

במידת הצורך, יישר מחדש את התמונות הקודמות והחדשות באמצעות מודול הטעינה והיישור של התמונה. פתחו את תמונת לכידת המסך כדי לסמן מיקומים במקומם המקורי. מודל ה-CAD של שתל קיבוע ראש טיטניום תוכנן להתאים למבנה האנטומי של הגולגולת, מה שמבטיח חיבור יציב לשלב המיקרוסקופ להדמיה ברמת התא.

השתל הוצמד בהצלחה לגולגולת העכבר ואיפשר הדמיה יציבה לאורך זמן, תוך שהוא מאפשר לעכבר לשמור על פעילות תקינה. כלי הדם של מח העצם הגולגולתי הודגמו באמצעות סריקת אריחים, וחשפו רשת מורכבת של עורקים, נימי מעבר וסינוסואידים. ניתוח כלי דם כמותי הדגים פילוח של מבני כלי דם, המאפשר מדידה של קוטר, אורך וישר הכלי, והמתאם ביניהם.

הדמיה אורכית לכדה שיפוץ מתקדם של כלי הדם הגולגולתיים במהלך התקדמות לוקמיה עם צפיפות כלי דם מוגברת שנצפתה לאורך זמן. חדירות כלי הדם הוערכה באופן דינמי, והראתה שימור דיפרנציאלי של צבע פלואורסצנטי לאורך זמן, והציגה חדירות דיפרנציאלית של כלי מח עצם שונים.