מיקרוביוטה של גני נמלים אטיין: הדמיה של נוף מיקרוביאלי על ידי סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים
4 באוקטובר 2024
אנו מציעים פרוטוקול מיקרוסקופ אלקטרונים סורק אופטימלי להדמיית דגימות הטרוגניות ועדינות ביותר המכילות ביומסה צמחית ופטרייתית, יחד עם מיקרוביוטה וביופילם. פרוטוקול זה מאפשר לתאר את הממדים המרחביים של ארגון המיקרוביוטה.
אנו חוקרים את המיקרוביוטה שחיה בגינות פטריות על נמלים שמגדלות פטריות. אנו רוצים לדעת מי הם וכיצד הם מארגנים את המערכת האקולוגית המיקרוביאלית הזו. בפרט, אנו רוצים לדעת כיצד המיקרוביוטה מתקשרת פיזית עם הפטרייה שהנמלים מטפחות.
והאינטראקציות האלה מתווכות בעיקר על ידי ביופילם. הגנים המיקרוביאליים המעובדים על ידי הנמלים הם מדגם מורכב והטרוגני המורכב מהפטרייה המתורבת, המצע שנוסף לגידול והמיקרוביוטה. מלבד היותה עדינה מאוד, מאתגר למצוא שיטות המשמרות את כל רכיבי הגן להדמיה.
הממצאים שלנו מצביעים על כך שהמיקרוביוטה משלבת את מבני גן הפטריות, מה שתומך גם בכך שהם עשויים להשתתף בתגובות הפיזיולוגיות של סביבה זו. ואנו גם מספקים את מערכת הראיות לכך שביופילמים חשובים לאינטראקציות אלה. הפרוטוקול שלנו משמר מבני פטריות בביופילמים תוך פישוט תהליכים אחרים.
עם זאת, הוא משמר את מבנה הגן העדין, מפרט עוד יותר את האינטראקציה הפיזית של המיקרוביוטה וחושף את המבנה המרחבי של הביופילם. ביופילם הן מערכות תאיות שבהן מיקרואורגניזמים המשובצים במטריצת EPS יוצרים רשתות חברתיות. סריקת מיקרוסקופיה אלקטרונית מאפשרת לנו להתבונן בפירוט חסר תקדים כיצד המיקרוביוטה מתארגנת מרחבית בגן הפטריות, סביב קורים ובכל רחבי המצע.
אנו מאמינים כי צעדי ההכנה שאנו מציעים כאן ייושמו באופן נרחב לשכלול מחקרים במערכות אקולוגיות מיקרוביאליות אחרות. בתור התחלה, אתרו וסמנו את מושבת מיני הנמלים האטין. חפרו תעלה המקיפה את אזור הקן עד לחשיפת חדר הגן.
פתחו את תא הגינה לרוחב כדי למנוע מהאדמה לקרוס על פני הגינה. באמצעות מלקחיים אנטומולוגיים, בזהירות לאסוף דגימות גינה. מעבירים את דוגמאות הגינה למיכל פלסטיק נקי המכיל שכבת טיח לאיזון הלחות.
לאחר העברת עובדי הגינה והנמלים, אטמו הרמטית את המיכל כדי למנוע התייבשות דגימה. סגור את התעלה באמצעות הקרקע שהוסרה בעבר. אחסנו את דגימות הגן בטמפרטורה של 23 עד 25 מעלות צלזיוס, עד לעיבוד נוסף.
לקיבוע דגימות, השתמשו במלקחיים אנטומולוגיים כדי להסיר עובדים, ביצים, גלמים וזחלים מדגימות הגינה. מניחים בצד שברי גינה שגודלם אינו עולה על חמישה מילימטרים מעוקבים ומוסיפים אותם לצינור של שני מיליליטר. לאחר מכן עם פיפטה זכוכית פסטר, להוסיף כמיליליטר אחד של פתרון קיבוע Karnofsky לצינורות כדי לטבול לחלוטין את הדגימות.
יש להסעיר את הצינורית בעדינות כדי לאפשר לדגימות להשרות ולדגור על הדגימות בארבע מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לפחות. כדי להתחיל, להשיג שברי מושבה של מיני נמלים אטין בתמיסת קיבוע קרנופסקי. לאחר הקיבוע, להסיר לחלוטין את הפתרון המקבע של קרנופסקי באמצעות פיפטה זכוכית מבלי לשבש את הדגימה.
לדגור את הדגימה באופן סדרתי עם מיליליטר אחד של ריכוזים הולכים וגדלים של אתנול, להבטיח את הדגימה נשארת ללא הפרעה. לאחר הסרת האתנול לחלוטין, באמצעות מלקחיים ומרית, העבירו בזהירות את הדגימה למיכל דגימה עבור מייבש הנקודה הקריטית. הניחו את המכסה על המיכל וטבלו אותו בכוס זכוכית מדורגת המכילה מספיק 100% אתנול כדי לטבול את המיכל.
לאחר מכן העבירו את מיכל הדגימה לכוס זכוכית מדורגת אחרת המכילה מספיק 100% אתנול. יש לדגור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן העבירו את המיכל למייבש הנקודה הקריטית.
כדי להתחיל, להשיג שברי מושבה של מיני נמלים אטין הנתונים לייבוש נקודה קריטית. כדי להכין את מחזיקי המדגם, לעטוף את הגבעולים עם חתיכת נייר אלומיניום, מכסה רק את החלק העליון. כתוב את הקוד או המספר לדוגמה בתחתית כל גבב כדי לזהות אותם, לפני כיסוי החלק העליון של הספח בסרט פחמן דו-צדדי.
לאחר מכן פתחו את מכסה מיכל הדגימה והעבירו בזהירות את הדגימה המיובשת לצלחת פטרי מזכוכית באמצעות מלקחיים ומרית. הניחו בזהירות שברים של דגימת הגינה על המשטח הדביק של הספח המכוסה בסרט. לאחר ציפוי השפריץ בזהב, הניחו את הגבעולים במחזיק הדגימה לצורך סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים.
השתמשו באפשרויות שעל המסך או בבקרה הידנית כדי להתאים את ההגדלה ואת מיקום התמונה. הזז את הבמה כדי לקבל תצוגה מקיפה של הדגימה. השתמש בפונקציה RDC כדי להתמקד באזורים ספציפיים.
כאשר מתבוננים במבנה מעניין, התאימו את ההגדלה, המיקוד, הבהירות, הניגודיות והסטיגמה בהתאם. עבור סטיגמה נכונה, באמצעות ממשק המשתמש הידני, להזיז את הבמה בכיוון X ו- Y. התאימו את קצב הרסטר כדי לבדוק את רזולוציית התמונה.
התאימו את ההגדלה בהתאם לחלק המצולם. כדי לשמור את התמונה, השתמש בפונקציית ההקפאה ולחץ על סמל התמונה. הגדר את נתיב הקובץ לשמירת התמונה.
לבסוף, נתחו לפחות שלושה שברי גן, ולכדו תמונות בכל טווחי ההגדלה שהוזכרו. קורים פטרייתיים בגני אטין נצפו כמבנים שלמים בצורת צינור המכסים את פני המצע, דבר המצביע על הכנת דגימה יעילה. הביופילמים שהתפשטו הורכבו מתאים מיקרוביאליים שיצרו שכבה דקה של תא אחד עד שלושה תאים שכיסתה את פני המצע.
סקירה כללית
מחקר זה בוחן את המיקרוביוטה בתוך גני הפטריות המטופחים על ידי נמלים מגדלי פטריות, תוך התמקדות באינטראקציות המבניות ובארגונם. המחקר מדגיש את חשיבותם של הביופילמים באינטראקציות אלו ומציג פרוטוקול אופטימלי למיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת (SEM) המשמר ביעילות את המבנים העדינים המעורבים בתהליך.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מחקר
- אקולוגיה מיקרוביאלית
- סימביוזה פטרייתית
- אינטראקציות של ביופילם
רקע
- המיקרוביוטה בגני הפטריות של נמלים מייצגת מערכת אקולוגית מורכבת.
- קיימים אתגרים בדימות של דגימות ביולוגיות עדינות.
- הבנת האינטראקציות הללו חיונית להבנת הדינמיקה של המערכת האקולוגית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- פרוטוקול אופטימלי למיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת (Scanning Electron Microscopy)
- גני פטריות המטופחים על ידי נמלי קוטר (attine ants)
- טכניקות של ניתוח והדמיה של ביופילם (Biofilm)
תוצאות עיקריות
- מיקרוביוטה משתלבות עם הפטרייה והמצע בגינה.
- תיעוד של הארגון המרחבי של המיקרוביוטה והאינטראקציה שלה עם מבנים פטרייתיים.
- הדגשת תפקידם של ביופילמים בתמיכה באינטראקציות אלו.
מסקנות
- המחקר מספק תובנות לגבי הדינמיקה של מערכות אקולוגיות מיקרוביאליות.
- פרוטוקול הדמיה המוצע עשוי לשפר מחקרים על מערכות ביולוגיות דומות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ויזואליזציה ברזולוציה גבוהה של ארגון מרחבי מיקרוביאלי בתוך מטריצות ביולוגיות מורכבות היא קריטית להפחתת סיכונים בשלבי הגילוי המוקדמים ותיקוף מטרות במחקר ופיתוח הקשורים למיקרוביום. פרוטוקול ה-SEM המתואר מאפשר מיפוי מדויק של אינטראקציות בין מיקרוביוטה לביופילם, ובכך תומך בביטחון חיזוי במחקרים פונקציונליים של קונסורציומים מיקרוביאליים. יכולת זו רלוונטית ישירות עבור צוותי ביו-פארמה השואפים להבין את הקשרים שבין מבנה לתפקוד של קהילה במיקרוביומים רלוונטיים למחלה או במיקרוביומים מהונדסים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר הדמיה ישירה של התארגנויות מרחביות מיקרוביאליות לצורך בחינה של תפקודי הקהילה המבוססת על השערות.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית על ידי חשיפת אינטראקציות פיזיות בין המיקרוביוטה לבין המאכסן או מבני התשתית.
- מסייע בתיקוף של מטרות פונקציונליות באמצעות מיפוי של אינטראקציות המתווכות על ידי ביופילם in situ.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק פרוטוקולי דימות מתוקפים להכנת דגימות ביולוגיות הטרוגניות לצורך ניתוח כמותי בהמשך.
- מסטנדר את שימור הדגימות והדימוג, ובכך משפר את השחזוריות לאורך קמפייני סריקה.
- מייצר נתונים מרחביים כמותיים המשמשים לפיתוח בדיקות עבור תרכובות המשפיעות על המיקרוביום.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאם מיפוי מרחבי של מיקרוביוטה עם גילוי של סמנים ביולוגיים תרגומיים במערכות אקולוגיות מיקרוביאליות מורכבות.
- מאפשר רצף משלב הדימוי של שלב הגילוי ועד לתיקוף של התערבויות במיקרוביום במודלים פרה-קליניים.
- תומך בהקדמה מותאמת סיכונים על ידי הבהרת קשרי מבנה-תפקוד במערכות רלוונטיות למחלה.
שילוב צינור עיבוד וזרימת עבודה
תהליך עבודה זה, המבוסס על SEM, משתלב ברצף מהשלב הגילוי ועד לשלב הפרה-קליני עבור תוכניות המכוונות למיקרוביום, ובכך תומך הן בבדיקת היפותזות והן ברציפות תרגומית.
- ביולוגיה של גילוי: מספקת נתונים ברזולוציה מרחבית לבחינת השערות ולהבהרת מסלולים בקהילות מיקרוביאליות.
- סריקה: קובעת סטנדרטים של דימוג הניתנים לשחזור לצורך הערכה כמותית של ארגון הביופילם והמיקרוביוטה.
- אנליטיקה: מספקת קריאות מרחביות בעלות תוכן גבוה להשוואת תנאים ניסיוניים והתערבויות.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין דימוג גילוי לתיקוף פרה-קליני של השערות לגבי מבנה ותפקוד של המיקרוביום.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פרוטוקול ניתן לשימוש חוזר, הניתן להתאמה למערכות אקולוגיות מיקרוביאליות וסוגי דגימות מגוונים.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקר מיקרוביום.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של הדמיה והכנת דגימות עבור תהליכי עבודה ניתנים לשכפול ובקנה מידה רחב.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס לקבלת החלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) על ידי הבהרת הארגון המרחבי והפוטנציאל התפקודי של קהילות מיקרוביאליות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון של נכסים והתערבויות המכוונות למיקרוביום.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתפעול SEM ובטיפול בדגימות של אקולוגיה מיקרובית.
- מחייב גישה לציוד לייבוש בנקודה קריטית, לציפוי בגיבוב (sputter coating) ולמכשיר SEM ברזולוציה גבוהה.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי איסוף והכנת דגימות.
- ניתן להתאמה למטריצות ביולוגיות מורכבות שונות מעבר לגני פטריות של נמליות קוצר.
- רגישות והטרוגניות של הדגימות עשויות להגביל את קצב העבודה או לדרוש אופטימיזציה של הפרוטוקול עבור מערכות חדשות.
שאלות נפוצות בתחום הביופארמה
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:53
Isolation and Fixation of Ant Colonies for Characterizing the Spatial Structure of Microbiota in Fungus Gardens with SEM Techniques
3:25
Dehydration of Fixed Fungus Cultures of Attine Ants for Unveiling the Microbial Biofilm Structure
4:32
Scanning Electron Microscopy for Imaging Microbial Biofilms in Fungus-Growing Ant Colonies
6:34
Representative Results
